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.2009年5月15日；284（20）：13843-13855。
doi:10.1074/jbc。M808515200。 Epub 2009年3月10日。

PINK1功能丧失通过影响氧化应激和线粒体分裂促进有丝分裂

鲁本·达格达 1, Salvatore J Cherra第三 1, 斯科特·库利奇 2, 阿努拉·坦登 三, 大卫·帕克 4, 查琳·T·楚 5
附属公司

PINK1功能丧失通过影响氧化应激和线粒体分裂促进有丝分裂

鲁本·达格达等。 生物化学杂志. .

摘要

线粒体失调与帕金森病密切相关。PTEN诱导的激酶1（PINK1）突变与家族性帕金森病和神经精神疾病有关。尽管过表达PINK1具有神经保护作用，但对PINK1-功能丧失的神经元反应知之甚少。我们发现，PINK1的稳定敲除在SH-SY5Y细胞中诱导线粒体断裂和自噬，这一现象被PINK1RNA干扰（RNAi）抗性质粒的重新引入所逆转。此外，野生型PINK1的稳定或短暂过表达增加了线粒体的互连性，并抑制了毒素诱导的自噬/有丝分裂。在PINK1 shRNA系中，线粒体氧化剂的产生在触发线粒体断裂和自噬中起着重要作用。自噬/有丝分裂在限制细胞死亡中起到保护作用，Parkin的过度表达进一步增强了这种保护性的有丝分裂反应。显性阴性Drp1突变体抑制PINK1缺陷细胞的分裂和有丝分裂。有趣的是，自噬蛋白Atg7和LC3/Atg8的RNAi敲低也降低了线粒体碎片，而不影响氧化应激，这表明自噬积极参与线粒体形态重塑以清除。总之，PINK1功能的丧失会引起氧化应激和线粒体周转，而线粒体周转是由自噬和裂变/融合机制协调的。此外，PINK1和Parkin可能通过不同机制合作维持线粒体内环境稳定。

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数字

图1。
图1。
PINK1-过表达和敲除细胞系的特性。 一个，来自稳定pRec载体控制SH-SY5Y细胞系的细胞裂解物(C类)PINK1敲除稳定细胞系(答14)，和PINK1-过表达克隆细胞系(#24)以5-15%的比例解决用ammediol缓冲凝胶和免疫印迹法检测PINK1和C8830抗血清存在(中间面板)或缺席(左侧面板)阻塞的PINK1肽（100μg/ml，1小时）。为FLAG标签重新标记污点(右侧面板)β-actin作为负荷控制。插入1显示胶片的较长曝光时间，以更好地显示全长内源性PINK1相对于过度表达的PINK1-3xFlag。免疫反应性带包括全长重组PINK1-3xFlag（带一′,～69 kDa），内源性全长（带一，～66 kDa）和a主要处理波段b条，～50 kDa）。一个或两个以下还观察到分子量处理形式（<39 kDa）。A已处理有时观察到PINK1-3xFlag的形式（～60kDa，补充图。第8节）；插图2显示了单元格中此处理带的加重用蛋白酶体抑制剂clasto-lactacystinβ-内酯（band）治疗一″). 较小的处理PINK1频带可能进一步反映处理，可能在C端子端，因为没有更小的FLAG频带观察。B类线粒体的蛋白质印迹(米托)和细胞质的(细胞)来源于亲代SH-SY5Y细胞的组分(W公司)，一条稳定的矢量线(Ctrl键)，和PINK1-3xFlag克隆#24在10%三甘氨酸凝胶上溶解并免疫印迹FLAG，内源性PINK1、线粒体P60和乳酸脱氢酶(乳酸脱氢酶). 类似获得了克隆9的结果（数据未显示）。星号，表示非特定带。全长重组PINK1-3xFlag（带一′），内源性全长（带一)、和已处理（波段b条)观察到PINK1。C类，的外荧光图像SH-SY5Y细胞双重标记内源性PINK1(绿色)和60-kDa人线粒体抗原(红色)并对带有DAPI公司(蓝色).D类克隆SH-SY5Y株系中PINK1 mRNA水平表达针对N末端（A系列克隆）或中间的shRNAPINK1的（D系列克隆）区域。数据归一化为β-肌动蛋白mRNA作为相对量化值±最大值和最小值。对照克隆使用pRS控制矢量（V系列克隆）作为参考生成值。*，第页< 0.001与V17。E类，PINK1免疫印迹显示稳定PINK1shRNA内源性PINK1s减少细胞系与含有β-actin的载体控制细胞系的比较用作加载控制。50kDa的处理带(b条)和两个较小的处理带(c（c）和d日)在这个斑点中观察到（参见补充图S7了解ECL膜的非裁剪版本）。密度测定法显示了数据（每行三个独立实验汇编而成）低于(*，第页< 0.01与控制单元线路）。
图2。
图2。
PINK1基因敲除和过度表达细胞的超微结构分析线。 A-D公司，稳定细胞系的电子显微照片表达空shRNA载体控制(一个)、A和D系列PINK1 shRNAs(B类和C类)，或PINK1-3x标志(D类).米，线粒体；av（平均值），自噬空泡；第页，溶酶体；n个，原子核。插入，线粒体增大，显示致密嵴(比例尺：2μm）。E类，平均数量线粒体嵴折叠/μm(公式图像，第页< 0.001与矢量控制；平均值±S.E。，n个= 80-150线粒体/状况）。F类AV的平均数量（自噬体和自身溶酶体）每细胞定量。(公式图像，第页< 0.05与矢量控制；平均值±S.E。，n个= 30单元格/条件）。
图3。
图3。
PINK1的敲除或过度表达改变线粒体形态学。 一个线粒体的表观荧光图像在载体控制中瞬时转染mito-GFP，稳定的PINK1-shRNA和稳定的PINK1过表达克隆。比例尺：20微米。B类，线粒体Z堆叠的三维重建在载体控制、PINK1 shRNA克隆和PINK1-过表达克隆。C类，定量图像分析线粒体互联性和线粒体伸长在空腹中的应用载体控制和PINK1shRNA克隆细胞（三种代表性细胞实验；公式图像，第页< 0.02与控制(Ctrl键); 平均值±S.E。，n个=25-35个单元格）。D类，线粒体定量a中的互连性和线粒体伸长PINK1-3xFlag在SH-SY5Y细胞中的瞬时过表达转染PINK1-WT-V5(公式图像，第页< 0.05与稳定对照或空载体；平均值±S.E。，n个=25-35个细胞/条件，三个独立实验）。
图4。
图4。
PINK1的敲除增加了大细胞自噬和有丝分裂。 一个，LC3-Western blot显示LC3-II对β-肌动蛋白的增加PINK1shRNA克隆中自噬增加的比率与载体控制克隆或亲本SH-SY5Y细胞。B类，平均数在一个载体控制系和两个PINK1中每个细胞定量的GFP-LC3点短暂表达GFP-LC3（早期AVs标志物）的shRNA克隆细胞系(左图))或RFP-LC3（晚期AV的标记(右图形))当面(黑色条)或缺席(灰色条)第页，共页巴非霉素抑制溶酶体降解(公式图像，第页< 0.01与控制细胞系(Ctrl键);n个=20-40个单元量化/条件；公式图像，第页< 0.01与PINK1shRNA线在缺乏巴非霉素；n个=分析的30-40个细胞/条件）。C类，对照组和对照组线粒体线粒体红标记共焦显微镜观察三株瞬时表达GFP-LC3的PINK1shRNA株(绿色).比例尺：20微米。D类，定量分析GFP-LC3/MitoTracker共定位作为载体控制和三个PINK1 shRNA克隆系。条形图显示平均值±S.E。从四个实验汇编的45-90个细胞/条件(公式图像，第页< 0.001与对照细胞系；n个=25-30个细胞/条件）。E类，计算机辅助量化细胞面积百分比被对照组线粒体和PINK1 shRNA细胞占据缺乏巴非霉素A。细胞瞬时转染线粒体靶向GFP和非靶向RFP标记细胞周长。(公式图像，第页< 0.05与对照细胞系；公式图像，第页< 0.05与未经处理的PINK1shRNA细胞系；n个=25-35个单元格分析/条件）F类线粒体丙酮酸的蛋白质水平脱氢酶(PDH公司)，将总ERK1/2重新设置为加载控制。G公司，计算机辅助量化60kDa人线粒体抗原特异性免疫反应带（mito-P60）相对于对照细胞系中的总ERK水平PINK1shRNA细胞系和PINK1-3x-Flag过表达系。这个酒吧图表显示由3-4 Western blot编译的平均值±S.E每个细胞系的实验(公式图像，第页< 0.05与对照细胞系；n个=5-7条免疫反应带分析/条件）。插入，代表性Western blot显示与载体稳定相比，PINK1 shRNA细胞中mito-P60水平降低控制(Ctrl键)，将总ERK1/2重新设置为加载控制。
图5。
图5。
野生型PINK1表达增加抑制由6-OHDA或PINK1缺乏。 一个，宏自噬通过量化PINK1的平均数量分析过表达细胞系dH存在时每个细胞的GFP-LC3点20（车辆）或6-OHDA（120μ米持续4小时；Sigma）作为自噬的诱导剂(公式图像，第页< 0.05与未经处理的载体对照细胞系；公式图像，第页< 0.05与6-OHDA处理的对照细胞系(Ctrl键); 方法±S.E。，n个=20-35个量化细胞/条件）。B类，PINK1过表达克隆在缺乏或6-OHDA作为有丝分裂诱导剂的存在实验；公式图像，第页< 0.05与未经处理的对照细胞系；公式图像，第页< 0.05与6-OHDA处理的对照细胞系；25-30口井量化/条件）。使用A系列恢复PINK1表达抗RNAiΔN-PINK1-3xFLAG质粒抑制PINK1的自噬通过LC3移位分析评估的shRNA线A14(C类)并且排队A4由GFP-LC3 punta评估(D类).(公式图像，第页< 0.0005与对照细胞系；公式图像，第页< 0.0005与空载体转染PINK1 shRNA；平均值±S.E。，n个=15-30个量化细胞/条件。）
图6。
图6。
PINK1敲除诱导线粒体超氧化物上游PINK1缺陷系的线粒体断裂和自噬。 一个细胞渗透红MitoSOX的表观荧光分析线粒体超氧化物荧光指示剂在对照稳定细胞系中的应用(Ctrl，左面板)和两个PINK1敲除细胞系(正确的面板). 用DRAQ5对细胞核进行复染(蓝色).比例酒吧：100微米。B、 条形图显示编译平均值±S.E。来自三个独立实验，平均MitoSOX增加将每个细胞的荧光归一化为载体控制细胞系(公式图像，第页< 0.05与载体控制细胞系；n个=200-300个单元格分析/条件）。C类和D类，量化线粒体互联性(C类)和线粒体伸长(D类)在用过氧化氢酶处理的PINK1敲低克隆细胞系中，MnTBAP或车辆（未经处理）24小时（三个独立的代表实验；公式图像，第页< 0.05与对照细胞系；n个=分析了25-35个细胞根据条件。）E类，代表性的外荧光显微照片PINK1敲除细胞系（A4）瞬时表达GFP-LC3是否存在抗氧化剂MnTBAP。注意MnTBAP抑制PINK1敲除细胞中的自噬。F类，平均手机数量对照组或短暂表达GFP-LC3的PINK1shRNA细胞中的GFP-LC3puncta在存在或不存在指定抗氧化剂的情况下。(公式图像，第页< 0.05与未经处理的对照细胞系；公式图像，第页< 0.0001与各自未经处理的克隆；代表条形图显示平均值±S.E。，n个=25-40个量化细胞/条件）。
图7。
图7。
PINK1敲低细胞的线粒体变化需要Drp1活动。对照或PINK1shRNA稳定克隆细胞系与GFP-Drp1-DN和线粒体靶向RFP联合转染（mito-RFP），并对图像进行线粒体互联性分析(一个)和线粒体伸长(B类)如下所述“实验程序”。（三名独立代表实验；公式图像，第页< 0.005与对照细胞系；公式图像，第页< 0.05与各自的空载体转染PINK1shRNA细胞系；n个=25-35个量化细胞/条件。）控制或PINK1shRNA稳定用HA标记的Drp1-DN和GFP-LC3联合转染细胞以标记AV（平均值）。C类和D类，GFP-LC3穿孔平均数(C类)或GFP-LC3点与线粒体共定位的百分比(D类)通过共焦显微镜和图像分析（代表三个独立实验；公式图像，第页< 0.01与控制；公式图像，第页< 0.05与空载体转染的A4或D14；n个=25-30个分析细胞/条件）。
图8。
图8。
自噬参与由PINK1缺乏并发挥神经保护作用。 一个，稳定载体控制或PINK1shRNA细胞与指定的siRNA共同转染并对每个细胞中GFP-LC3点的数量进行量化两个的代表性实验(公式图像，第页< 0.001与对照细胞系；公式图像，第页< 0.01与控制siRNA；平均值±S.E。，n个=30-40个电池按条件量化）。插入显示代表性的蛋白质印迹显示Atg7或控制siRNA的作用。注意，Atg7的敲除降低内源性Atg7水平并降低激活的LC3-II水平。B类，MitoSOX荧光的平均积分强度为瞬时转染PINK1shRNA稳定细胞系中的定量带有指示的siRNAs(公式图像，第页< 0.01与控制细胞系(Ctrl键)，表示±S.E。，n个=300-400个细胞/条件）。C类和D类，线粒体互联性的量化(C类)和线粒体伸长(D类)PINK1敲除克隆系用指示的siRNA转染（代表三个实验；公式图像，第页< 0.05与转染对照siRNA的对照细胞系；公式图像，第页< 0.01与PINK1 A4或D14转染对照siRNA；n个=25-30个细胞/条件）。E类，基底细胞存活率（Alamar Blue试验）对照和PINK1 shRNA克隆（四个实验的代表；公式图像，第页< 0.005与对照稳定细胞系；n个=8口井分析/条件）。F类，碘化丙啶(圆周率)细胞死亡对照和PINK1 shRNA稳定克隆细胞系的检测(公式图像，第页< 0.05与控制稳定线；n个=800-1000个电池分析/条件）。G公司、对照细胞存活率或PINK1 shRNA用巴非霉素或载体处理18小时的稳定细胞系（代表性三个实验；公式图像，第页< 0.05与对照细胞系/巴非霉素；n个=分析的4口井/条件）。H（H）、对照细胞存活或转染Atg7 siRNA的PINK1shRNA细胞实验；公式图像，第页< 0.05与对照siRNA处理的克隆A4；公式图像，第页< 0.005与对照siRNA-处理克隆D14；n个=6口井分析/条件）。
图9。
图9。
帕金促进自噬/有丝分裂并恢复线粒体形态PINK1 shRNA细胞系。 一个，代表性落射荧光GFP-LC3和载体共转染对照细胞的显微照片(左边)以及与GFP-LC3和矢量（中间）或HA标记Parkin(正确的). 细胞固定HA-tag免疫染色(红色)并用DAPI复染可视化细胞核(蓝色).B类，代表性GFP-LC3 punta对照细胞系和联合转染PINK1shRNA细胞系的条形图GFP-LC3和空矢量或HA-Parkin(公式图像，第页< 0.0001与对照细胞系；公式图像，第页< 0.01与载体转染shRNA细胞系；n个=30-40个电池按条件分析）。插图显示了细胞的典型HA免疫印迹转染HA标记Parkin(黑色箭头). 预测的HA-Parkin的分子量为54kDa。C类，有丝分裂定量用空载体或HA帕金(公式图像，第页< 0.02与对照细胞系；公式图像，第页< 0.05与PINK1shRNA细胞系；n个=每分析30-40个细胞条件）。D类，线粒体的代表性量化控制细胞系和PINK1shRNA细胞系的相互连接与mito-GFP和空载体或HA-Parkin联合转染(公式图像，第页< 0.002与对照细胞系；公式图像，第页< 0.05与PINK1shRNA细胞系；n个=每个分析25-30个细胞条件）。E类对照组和PINK1的碘化丙啶细胞死亡测定用所示质粒转染shRNA稳定克隆细胞系。(公式图像，第页< 0.001与控制稳定线；公式图像，第页< 0.05与PINK1shRNA细胞系；n个=800-1000个电池分析/条件）。
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