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.2006年1月至次年3月；2(1):39-46.
doi:10.4161/auto.2229。 Epub 2006年1月10日。

示踪染料探测大鼠肝细胞线粒体自噬

萨拉·罗德里格斯-恩里克斯 1, Insil Kim公司, 罗伯特·T·柯林, 约翰·莱马斯特斯
附属公司

示踪染料探测大鼠肝细胞线粒体自噬

萨拉·罗德里格斯-恩里克斯等。 自噬. 2006年1月至次年3月.

摘要

线粒体在营养缺乏后成为自噬降解的目标，这一过程也被称为线粒体自噬。在本研究中，我们使用LysoTracker Red（LTR）和MitoTracker Green来表征培养的大鼠肝细胞中自噬体增殖和有丝分裂的动力学。营养剥夺和胰高血糖素诱导的自噬增加了荧光板阅读器评估的LTR摄取量，以及共焦显微镜评估的单个肝细胞中LTR标记的酸性细胞器数量，增加了4-6倍。用MitoTracker Green（MTG）对肝细胞进行连续成像显示，自噬诱导后线粒体平均消化时间为7.5分钟。在蛋白酶抑制剂的存在下，消化时间增加了一倍以上，LTR标记的细胞器总数增加了约40%，但含有MTG荧光的LTR标记酸性细胞器的比例保持在75%左右。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤、沃特曼和LY204002将营养剥夺后LTR摄取量的增加抑制了85%，证实了LTR摄取的增加反映了自噬诱导。线粒体通透性转换（MPT）的特异性抑制剂环孢霉素A和NIM811也降低了LTR的摄取，而不抑制MPT的免疫抑制剂他克莫司则没有效果。此外，c-Jun N末端激酶（JNK）抑制剂SCP25041和SP600125分别阻止了47%和61%的LTR摄取，但ERK1、p38和caspase抑制剂没有作用。结果表明，线粒体一旦被选择用于有丝分裂，就会被迅速消化，这支持了线粒体自噬涉及MPT和通过PI3激酶和可能的JNK进行信号传递的概念。

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图1
图1
自噬刺激后培养肝细胞中LTR荧光增强。在（A）中，培养的肝细胞在完全生长培养基（GM）或KRH加1μM胰高血糖素（KRH+G）中培养70分钟后，加载25、50、200和500 nM LTR。再过20分钟，使用荧光板阅读器测量LTR荧光，如材料和方法中所述。在（B）中，肝细胞装载50 nM LTR，如（A）所述。然后在不同的培养时间后测量LTR荧光。*，p<0.001与完全培养基比较（n=12，25 nM LTR除外，其中n=4）。
图2
图2
自噬诱导后肝细胞中LysoTracker Red（LTR）摄取的共焦和宽视野显微镜。将培养的肝细胞加载LTR（200 nM，20分钟），并在完整的生长培养基（GM，上部面板）或KRH加1μM胰高血糖素（KRH+G，下部面板）中培养70分钟。左面板显示了生长培养基（左上面板）或KRH加胰高血糖素（左下面板）中肝细胞的红色LTR荧光的典型重叠穿透焦点共聚焦图像。右侧面板是相应的明亮图像。
图3
图3
自噬过程中的线粒体消化。将培养的肝细胞与MTG（0.5μM）混合60分钟，并在37°C的完全生长培养基中与LTR（0.5μM）混合20分钟。在显微镜台上，将完整的生长培养基替换为KRH加1μM胰高血糖素，并收集绿色MTG荧光和红色LTR共焦图像的时间序列。选择时间点来说明线粒体自噬消化的开始和完成。一个实验代表10人。
图4
图4
蛋白酶抑制剂延长线粒体自噬消化。在（A）中，将培养的肝细胞与MTG和LTR混合，放置在KRH和胰高血糖素中，如图3所示，不存在（左面板）和存在7.5μM胃蛋白酶抑制素A（右面板）。70分钟后，收集绿色MTG和红色LTR荧光的单共焦图像。向上的白色箭头表示与MTG标记的线粒体共定位的LTR标记的酸性细胞器。向下的黄色箭头表示不与MTG荧光共定位的LTR标记的溶酶体。在（B）中，含有MTG荧光的LTR标记酸性细胞器的数量（黑条）和单个共焦光学切片（厚度约2μm）（黑条在无胃蛋白酶抑制素A（Pep A，7.5μM）或亮氨酸肽（Leu，10μM）的情况下绘制。在（C）中，MTG和LTR在个体自噬体中共定位的持续时间是根据KRH加胰高血糖素在存在和不存在蛋白酶抑制剂的情况下自噬刺激后共聚焦图像的时间序列确定的，如（A）所示。*，p<0.001 vs.无（n=6）。
图5
图5
LTR荧光板阅读器筛选试验：通过抑制MPT、PI3激酶和JNK的药物抑制自噬，但不通过抑制caspases、ERK1和p38的药物抑制。将生长培养基中培养的肝细胞在完全生长培养基预培养30分钟，然后在生长培养基（GM）或KRH加1μM胰高血糖素（KRH+G）中培养70分钟。添加LTR（50 nM），并按照材料和方法中的描述测量LTR荧光。如前所述，从30分钟预培养开始添加各种抑制剂。使用的药物有：（A）、10 mM 3-MA、5μM他克莫司（钙调神经磷酸酶抑制剂）、5μM NIM811（MPT抑制剂）、5M CsA（钙调神经元磷酸酶和MPT抑制剂；（B） ，0.5μM沃特曼，10μM LY294002（PI3激酶抑制剂）；C、 100μM DEVD-fmk（caspase 3抑制剂）、100μM IETD-fmk；D、 10 mM 3-MA、100μM PD98059（ERK1抑制剂）、100μM SB203580（p38抑制剂）、10μM SCP25041（JNK抑制剂）、20μM SP600125（JNK抑制剂）。*，与KRH+G相比，p<0.001（每组n=12-16，SP600125除外，其中n=4）。
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