帕金森氏病（PD）是最常见的运动障碍，其特征是运动迟缓、僵硬、静止性震颤和姿势不稳定。这些临床特征被认为是纹状体多巴胺能输入减少和黑质致密部多巴胺能神经元丢失所致。虽然帕金森病的发生主要是散发性的，但五个不同基因的突变与临床综合征有关，这些临床综合征通常与散发性帕金森病难以区分停车场，DJ-1型、和粉红色1（PTEN诱导的激酶1）基因是隐性遗传的，包括大量外显子缺失或框架位移截断，这表明存在功能丧失的致病机制(1–三).
粉红色1最初被鉴定为一种基因，其转录被肿瘤抑制因子PTEN在癌细胞系中激活(4). 这个粉红色1该基因有8个外显子，跨度1.8kb，编码581个氨基酸残基。推导的氨基酸序列表明PINK1包含一个线粒体靶向基序（氨基酸1-34）和一个与Ca高度同源的激酶结构域（氨基酸156-509）2+/钙调素依赖性激酶。自第一份报告将PINK1的隐性遗传无义（W437X）和错义（G309D）突变与家族性PARK6病例联系起来以来(三)在有或无家族史的早发PD患者中，发现了大量（>30）额外的截断和错义突变(5–11). 遗传分析显示粉红色1具有高度渗透性，在早发（<50）PD患者中相当常见，并且在外显率降低的晚发PD患者中存在杂合突变(6，7，10). PINK1突变的患者在临床上通常与散发性PD无法区分，并且通常对左旋多巴治疗有良好的反应(6，10，12).
PINK1功能丧失如何导致帕金森病？携带PINK1突变的早发PD患者的正电子发射断层扫描（PET）和单光子发射计算机断层扫描（SPECT）显示纹状体突触前多巴胺能功能障碍，其水平与晚发性特发性PD相当(13–15). 这些影像学研究表明PINK1可能在维持人类突触前多巴胺能终末的正常功能和存活中发挥作用。在这项研究中，我们研究了PINK1缺陷如何导致PD，以及小鼠PINK1功能丧失是否会导致多巴胺能功能障碍。
结果
的生成粉红色1−/−老鼠。
为了产生缺乏PINK1的突变小鼠，我们选择创建外显子4-7的靶向生殖系缺失(一个). 外显子4-7的缺失删除了大部分激酶结构域，并由于阅读框的改变在外显子8的开头产生无义突变。靶等位基因截短的mRNA可能通过非传感介导的衰变被降解。将线性化的靶向载体转染到ES细胞中，使用3′外探针通过Southern blot分析筛选350个ES克隆，以确定是否存在预期的6.9-kb片段，该片段代表靶向等位基因(B类). 然后用引物3和引物4对4个阳性克隆进行PCR检测，以确认5′同源区的正确重组。将两个ES克隆注射到母细胞中以生成嵌合小鼠，并将其繁殖以获得F1杂合突变小鼠。F类2通过Southern blot分析，使用针对PGK-新盒和3′探针，并通过使用引物3和4的PCR，然后测序。使用外显子8特异探针进行的Northern blot分析显示粉红色1纯合和杂合突变小鼠大脑中的mRNA分别证实了截断粉红色1含有外显子1-3和8的转录物被降解(C类). 因此，我们得出结论，外显子4-7的生殖系缺失导致粉红色1-零等位基因，纯合子突变小鼠重演了粉红色1-关联PD。
正常多巴胺能神经元和多巴胺水平粉红色1−/−老鼠。(一个)目标战略。包含外显子3的KpnI（K）-Bsr GI（B）片段用作5′同源区。P1和P2代表用于扩增包含外显子8的3′同源区域的引物的位置。3′探针表示3′外部探针的位置，用于筛选3′同源区中携带适当重组的靶向ES细胞。P3和P4是用于确认5′同源区正确重组的引物。E、 EcoRV；K、 KpnI；B、 Bsr镀锌(B类)利用3′探针对ES细胞进行Southern印迹分析。67.1kb EcoRV片段代表野生型等位基因，而6.9-kb EcoSV片段代表靶向等位基因。(C类)Northern印迹分析粉红色1抄本。该印迹与第8外显子特异性探针杂交，然后与第8外显子特异的探针杂交GAPDH公司cDNA作为对照。(D类)多巴胺能神经元的正常形态粉红色1−/−小鼠的SNpc中有类似的TH免疫反应粉红色1−/−2～3个月龄的小鼠和wilt-type对照组。(E类)类似数量的TH阳性神经元存在于粉红色1−/−2–3个月龄的野生型小鼠（+/+：13660±1033；−/−：12520±573；n个=每个基因型4个；P（P）>0.05）和8-9个月（+/+：13547±1638；−/−：14446±1150；n个= 6–7;P（P）> 0.05). (F类)DA纹状体含量相似粉红色1−/−2–3个月龄的小鼠和野生型对照组（+/+：14.3±0.7；−/−：13.2±1.8；n个=每个基因型5个；P（P）>0.05）和8-9个月（+/+：15.8±0.9，−/−：17.7±2.3；n个=每个基因型5-7个；P（P）> 0.05).
多巴胺能神经元数量和纹状体多巴胺（DA）水平正常粉红色1−/−老鼠。
由于选择性神经变性主要发生在PD患者的黑质纹状体多巴胺能系统中，我们通过纹状体和黑质检查了PD患者的冠状脑切片粉红色1−/−小鼠和野生型对照。酪氨酸羟化酶（TH）特异性抗体的免疫组织化学分析显示多巴胺能细胞体的形态和密度没有明显异常(D类)或纹状体多巴胺能投射（数据未显示）粉红色1−/−老鼠。TH免疫反应神经元的立体计数显示粉红色1−/−2-3岁的小鼠(n个= 4,P（P）>0.05）和8-9个月(n个= 6–7,P（P）> 0.05;E类).
为了确定PINK1功能的丧失是否影响纹状体中DA的水平，我们使用反相高效液相色谱法（HPLC）测量了从纹状体分离出来的纹状体内DA及其主要代谢物二羟基苯乙酸（DOPAC）和高香草酸（HVA）的总量粉红色1−/−和对照小鼠。DA水平(F类)、DOPAC和HVA（数据未显示）在粉红色1−/−老鼠(n个=每个基因型5-9个；P（P）>0.05），表明在缺乏PINK1的情况下DA合成和周转正常。因为TH是DA合成中的一种速率限制酶，我们还测量了真实航向mRNA和蛋白质。实时RT-PCR和Western blot分析显示真实航向mRNA和蛋白质粉红色1−/−大脑。我们进一步测量了TH活性体内通过TH产品的量化，我-DOPA，在NSD-1015（芳香族抑制剂）存在下通过HPLC测定我-氨基酸DOPA脱羧酶，可以通过血脑屏障，阻止我-DOPA至DA的级别我-解剖纹状体的多巴胺在粉红色1−/−小鼠（+/+：0.61±0.03，−/−：0.62±0.03，n个=每个基因型5个），表明在缺乏PINK1的情况下TH活性正常。
多巴胺和儿茶酚胺的诱发释放减少粉红色1−/−老鼠。
为了进一步研究PINK1在多巴胺能系统中的作用，我们使用急性纹状体切片进行了电流测量记录粉红色1−/−2～3月龄野生型小鼠。野生型小鼠切片显示平均诱发DA信号为26.0±2.3×106分子(n个=在10只小鼠的25片切片中刺激117次），而粉红色1−/−切片平均18.5±2.7×106分子(n个=10只小鼠23片中的102次刺激；*，P（P）<0.05），表明粉红色1−/−老鼠(一个). 由于诱发DA溢出主要由DA释放和再摄取决定，而DA释放和重新摄取是通过DA转运体介导的，因此我们在DA再摄取阻断剂诺米芬新存在的情况下测量诱发DA溢出，以确定DA溢出减少是否是由DA释放减少和/或DA再摄取增加引起的，并发现粉红色1−/−切片显示平均诱发DA信号减少（24.4±3.5×106分子，n个=6只小鼠8片中39次刺激），与野生型小鼠（60.4±6.4×106分子，n个=在8只小鼠的21片切片中进行105次刺激；**，P（P）< 0.01;一个). 这些结果表明PINK1失活导致诱发DA释放的显著减少。
儿茶酚胺的诱发释放减少粉红色1−/−老鼠。(一个)诱发多巴胺释放减少粉红色1−/−纹状体。左侧显示了在无（对照）和存在诺米非辛的情况下，电刺激诱发DA释放的典型安培轨迹。箭头表示电脉冲的开始。粉红色1+/+切片显示平均诱发DA信号为26.0±2.3×106分子，而粉红色1−/−切片显示较低的诱发DA信号为18.5±2.7×106分子（*，P（P）<0.05），表明粉红色1−/−老鼠。在诺米芬新存在下，平均诱发DA信号粉红色1+/+纹状体切片，但不在粉红色1−/−纹状体切片显著增加（60.4±6.4×106分子）与不含诺米芬苷的对照条件（26.0±2.3×106分子；**，P（P）< 0.01). 所有面板中的数据均表示为平均值±SEM(B类)诱发儿茶酚胺释放减少粉红色1−/−嗜铬细胞。80 mM K的电流迹线+-顶部显示了诱发的儿茶酚胺释放。箭头表示高K值的开始+刺激。在6秒钟的刺激期间，每个细胞的总儿茶酚胺释放量在粉红色1−/−小鼠（25.0±2.5×106)与野生型对照组相比（50.2±5.0×106；**，P（P）< 0.01). 儿茶酚胺的平均量子尺寸在粉红色1−/−嗜铬细胞（52.4±2.6×104与…相比粉红色1+/+电池（77.6±3.9×104；**，P（P）< 0.01). 量子释放的频率在粉红色1−/−细胞，如粉红色1+/+（1.3±0.1）比英寸粉红色1−/−电池（2.1±0.3；**，P（P）< 0.01). 所有面板中的数据均表示为平均值±SEM。
为了进一步表征PINK1失活对儿茶酚胺释放的影响，我们对分离的肾上腺嗜铬细胞进行了电流测量记录，这些细胞是研究儿茶酚碱释放的极好模型，因为它们可以分辨致密核心囊泡释放的单量子(16). 我们测量了来源于粉红色1−/−和野生型小鼠(B类). 在6秒钟的刺激期间，每个细胞的总儿茶酚胺释放量在粉红色1−/−细胞（+/-：50.2±5.03×106; −/−: 25.0 ± 2.48 × 106；**，P（P）< 0.01;B类). 儿茶酚胺的平均量子大小粉红色1−/−电池（52.4±2.7×104分子，来自100个细胞的4465个小泡）小于野生型对照组（77.6±3.9×104分子，来自110个细胞的6381个小泡，*，P（P）< 0.01;B类). 此外，平均峰间距粉红色1−/−细胞（2.1±0.3秒）比对照组（1.3±0.1秒，**，P（P）< 0.01;B类)，表明在缺乏PINK1的情况下量子释放频率降低。这些结果进一步支持了儿茶酚胺释放减少粉红色1−/−老鼠。
D1受体激动剂可逆转皮质纹状体长时程增强（LTP）损伤。
由于DA调节纹状体中等大小棘（MS）神经元的皮质纹状体谷氨酸能神经传递，我们对MS神经元进行电生理记录，以确定DA突触释放减少的后果。急性皮质纹状体薄片MS神经元的全细胞记录显示正常特性（如静息膜电位、输入电阻）粉红色1−/−老鼠。在去极化电流脉冲下，膜整流和张力动作电位放电在粉红色1−/−和野生型小鼠(n个=18–27个神经元；P（P）> 0.05). 为了寻找谷氨酸释放概率或短期可塑性的可能变化，我们对MS神经元进行了细胞内记录，以测量自发兴奋性突触后电流（sEPSC）和小型EPSC（mEPSC）。在荷包牡丹碱的存在下，谷氨酸依赖性sEPSC的频率和振幅在粉红色1−/−MS神经元(n个= 19–22;P（P）> 0.05). 同样，在荷包牡丹碱和河豚毒素存在的情况下记录的mEPSCs的频率和振幅在PINK1缺失的情况下也正常(n个=10-13个神经元；P（P）> 0.05). 此外，配对脉冲比率（PPR）是突触前释放的改良指标(17)，在中保持不变粉红色1−/−MS神经元(n个= 13–14;P（P）> 0.05).
然后我们进行细胞内记录以测量皮质纹状体突触的LTP。无镁条件下高频刺激（HFS）诱导的LTP粉红色1−/−MS神经元（117.1±12.7%；n个=4）低于野生型对照组（156.0±12.0%；n个= 8,P（P）< 0.05;一个). 因为皮质纹状体LTP的诱导依赖于D1型DA受体的激活(18，19)，我们检测了D1受体样激动剂是否可以逆转这种LTP缺陷粉红色1−/−老鼠。事实上，用D1受体激动剂SKF 38393预孵育皮质纹状体切片，可以完全恢复LTP（153±18.3%；n个= 4;一个).
为了测试观察到的突触可塑性损伤是否对接受来自SNpc的调节性多巴胺能输入的皮质纹状体谷氨酸能突触是特异性的，我们测量了另一个谷氨酸能神经元突触的突触传递和可塑性，即海马的Schaeffer侧支通路粉红色1−/−老鼠。输入/输出（I/O）曲线类似于粉红色1−/−和对照小鼠(P（P）>0.8），表明基础突触传递正常[支持信息（SI）图5一个; 另请参见SI材料和方法]。五列θ-突发刺激（TBS）诱导的LTP在粉红色1−/−老鼠(SI图5B类). 诱导后60分钟测得的LTP大小与粉红色1−/−（155.4±6.2%）和对照小鼠（156.9±6.8%，P（P）= 0.48). 这些结果表明，PINK1失活不会改变海马谷氨酸能突触的正常突触可塑性。
多巴胺受体激动剂或增加多巴胺释放的药物可恢复皮质纹状体长期抑郁（LTD）损害。
在镁的存在下，皮质传入纤维的HFS诱导野生型MS神经元中皮质纹状体EPSP的LTD（62±8.4%，在HFS后20分钟测量，n个= 10;B类). LTD入职培训粉红色1−/−然而，MS神经元缺失（106±4%，n个= 7;B类). 因为LTD的诱导依赖于D1和D2受体的激活(20)，我们试图用D1和D2激动剂或同时使用D1和D1激动剂恢复LTD诱导。D1类受体激动剂预处理皮质纹状体切片｛“type”：“entrez protein”，“attrs”：｛“text”：“SKF38393”，“term_id”：“1157151916”，“term_text”：“SKF38393”｝38393瑞典克朗（83±10%）或D2类受体激动剂喹吡罗（75.2±8.8%）部分恢复LTD诱导粉红色1−/−神经元(n个=7；C类). 两种激动剂的使用，{“type”：“entrez-protein”，“attrs”：{“text”：”SKF38393“，“term_id”：“1157151916”，“term _text”：“SKF38933”}}38393瑞典克朗和喹吡罗，将LTD恢复到控制水平（62±4%，n个= 5;C类).
突触可塑性缺陷粉红色1−/−D1和D2受体激动剂可以拯救小鼠，这促使我们研究PINK1的缺失是否会降低纹状体D1和D1受体的密度。放射性配体结合放射自显影术以前曾被用于证明纹状体中D1和D2受体的丰富性，如D1受体与放射性标记的拮抗剂的高水平结合所示([三H] SCH23390）和D2-([三H] spiperone）样受体和相应基因敲除小鼠纹状体结合信号的消失(21–23). 因此，我们进行了放射配体结合分析，通过使用[三H] SCH23390和[三H] 斯皮珀龙(SI图6一个; 另请参见SI材料和方法). 纹状体结合密度的定量分析显示，基因型组之间D1和D2受体的密度没有显著差异，表明纹状体中表面D1和D2受体的水平正常粉红色1−/−纹状体(SI图6B类).
D1和D2激动剂逆转了LTD缺陷，D1和D1受体水平没有下降，这表明D1和D2信号在粉红色1−/−老鼠。因此，纹状体突触可塑性损伤可能是由于纹状体中DA的突触释放减少所致粉红色1−/−老鼠。为了进一步研究这一点，我们探索了影响DA释放的因子如何影响皮质纹状体突触可塑性。我们首先测试了安非他明的作用，安非他命会导致突触间隙DA增加。有趣的是，在安非他明的存在下，我们确实观察到纹状体LTD在粉红色1−/−切片（66.4±7.2%，n个=4个神经元；D类). 研究发现，安非他明可以增加DA的释放，从而缓解LTD在年的赤字粉红色1−/−切片为诱发的DA溢出减少提供了直接的支持证据，因为在粉红色1−/−老鼠。我们还检测了诺米非辛的作用，该药未能增加诱发的多巴胺溢出粉红色1−/−老鼠(一个)在LTD诱导后，发现诺米非辛没有显著恢复LTD诱导（90.0±2.5%，n个= 4;D类). 最后，用DA前体预处理切片我-多巴可以增加多巴胺的生成，从而增加刺激后可释放的多巴胺量，从而挽救了纹状体LTD诱导粉红色1−/−神经元（74.4±4.7%，n个= 5;D类). 这些结果为诱发DA释放受损提供了进一步的支持，这可能是纹状体突触可塑性缺陷的潜在机制粉红色1−/−老鼠。
讨论
深入了解其致病机制粉红色1缺乏导致PD，我们使用遗传方法探讨PINK1在黑质纹状体通路中的正常功能，黑质纹纹状体是一种在PD中特别脆弱的神经回路。我们的结果揭示了PINK1在多巴胺能突触传递中的一个重要和选择性作用(). 具体而言，我们发现PINK1失活会损害DA的释放，但不会改变DA的水平、多巴胺能神经元的数量、DA的合成或DA受体的水平。年DA释放的减值粉红色1−/−小鼠足以损害黑质纹状体回路功能，如皮质纹状体双向突触可塑性缺陷所示，这种可塑性可以通过增加突触前DA释放的药物（苯丙胺和我-多巴）或直接激活突触后DA受体功能（D1和D2受体激动剂）。
黑质纹状体和皮质纹状体异突触PINK1功能的示意模型。该示意性模型说明了黑质纹状体输入在纹状体中棘神经元（MSN）谷氨酸能皮质纹状体突触的神经调节作用。会聚性黑质纹状体多巴胺能和皮质纹状体谷氨酸能输入的同时激活分别引发DA和谷氨酸的突触释放以及突触后D1/D2和NMDA/AMPA受体的激活。D1受体的激活是诱导皮质纹状体突触LTP的必要条件，而D1和D2受体的活化是诱导LTD的必要条件。在缺乏PINK1的情况下，黑质纹状体终末DA的释放受损导致突触后D1和D1受体激活减少，以及LTP和LTD的后续缺陷。
PINK1在突触前DA释放和皮质纹状体突触可塑性中发挥重要作用。
一些证据支持PINK1功能丧失导致DA释放选择性损伤的结论。急性纹状体切片的电流测量记录显示粉红色1−/−老鼠(). 诱发DA溢出（作为诱发DA信号测量）反映了电刺激DA释放和再摄取的平衡，而改变的DA信号原则上可以通过这两个过程中的变化而产生。正如预期的那样，多巴胺再摄取抑制剂诺米芬新大大增强了对照纹状体中诱发的多巴胺信号。相反，阻断多巴胺再摄取对多巴胺信号的影响很小粉红色1−/−纹状体。总之，这些结果表明粉红色1−/−小鼠是由细胞外DA释放减少而非再摄取增加引起的。嗜铬细胞中诱发儿茶酚胺释放的研究进一步支持了细胞外DA释放缺陷，如儿茶酚酚胺释放总量、量子大小和释放频率显著降低粉红色1−/−老鼠(). DA释放受损粉红色1−/−小鼠的多巴胺合成或多巴胺能神经元数量的改变不能归因于粉红色1−/−老鼠()，进一步表明受损的DA释放反映了功能性缺陷而非结构性缺陷。
黑质纹状体投射释放DA调节兴奋性皮质纹状体突触传递和可塑性(). 我们对黑质纹状体回路的功能分析粉红色1−/−小鼠双向纹状体突触可塑性明显受损(). 在缺乏PINK1的情况下，皮质纹状体突触（黑质纹状体多巴胺能输入的主要靶点）LTP和LTD的诱导受损。皮质纹状体LTP的诱导依赖于D1受体的激活，而LTD的诱导依赖D1和D2受体的活化(18，24). 因此，在LTP和LTD中观察到的损伤与突触前DA释放减少或突触后D1和D2受体介导的功能缺陷相一致。与DA释放减少的结果一致粉红色1−/−我们观察到DA受体激动剂能有效地挽救小鼠LTP和LTD的损伤粉红色1−/−老鼠。这一观察表明，适当的突触后DA受体的直接激活可以弥补DA释放的突触前缺陷。
全面纾困LTP和LTD赤字粉红色1−/−适当激动剂诱导的小鼠表明突触后D1和D2受体功能保持完整，与放射配体结合放射自显影术观察到的纹状体D1和D1受体的正常水平一致(SI图6). 此外，MS神经元的内在生理特性是正常的，谷氨酸能突触传递和短期可塑性也是正常的，这为防止突触后或谷氨酸能功能障碍提供了进一步的证据。此外，海马Schaeffer侧支通路中的谷氨酸能突触传递和LTP是正常的(SI图5)，反对普遍的谷氨酸能缺陷。因此，观察到的皮质纹状体LTP和LTD的缺陷与突触前多巴胺能功能的特定缺陷最为一致。
PINK1如何调节细胞外DA的释放？迄今为止对PINK1的研究表明，PINK1可能作为线粒体激酶发挥作用(三，25).粉红色1−/−苍蝇确实表现出明显的线粒体形态缺陷(26，27). 然而，我们在粉红色1−/−小鼠（T.K.和J.S.，未发表的结果），可能是因为与果蝇属尽管仍有可能存在细微的线粒体缺陷粉红色1−/−老鼠。虽然对细胞外DA释放的机制知之甚少，但它可能使用与谷氨酸能突触类似的机制，在谷氨酸能神经元突触中，DA的释放是能量依赖性的，由SNARE依赖的突触小泡融合介导，并由钙触发2+与突触体结合(28). 如果PINK1确实是一种线粒体激酶，我们的结果将表明线粒体和DA分泌调节之间可能存在功能联系。
PD发病机制的含义。
帕金森综合征的病理生理学特征是纹状体多巴胺能输入减少。携带杂合或纯合PINK1突变的PD患者的PET和SPECT研究表明突触前多巴胺能缺陷和纹状体多巴胺能终末缺失(13–15). 与我们之前在停车场−/−(29)和DJ-1型−/−老鼠(30),粉红色1−/−至少在9个月大的时候，小鼠没有表现出黑质纹状体神经变性的迹象(). 尽管仍然有可能粉红色1−/−小鼠可能在年龄较大时出现黑质变性，这种可能性不大，因为停车场−/−(29)和DJ-1型−/−（H.Y.和J.S.，未发表的结果）小鼠在24个月大时未发生明显的多巴胺能神经退行性变。然而，黑质纹状体终末DA的释放减少粉红色1−/−小鼠与帕金森病（PD）中多巴胺能去神经支配的功能后果非常相似，我-多巴改善黑质纹状体通路的功能缺陷粉红色1−/−老鼠()帕金森病患者的临床症状。因此，我们认为DA突触前释放受损可能是PD的一种常见病理生理机制，可能代表黑质纹状体功能障碍范围内的一种机制性前驱物，导致坦率的神经退行性变。
一些额外的证据支持这种突触前假说。首先，苯丙胺诱导的旷野过度活动在两种情况下都有所减少停车场−/−(31)和DJ-1型−/−老鼠(32)这表明苯丙胺诱导的DA释放存在一个常见缺陷。其次，我们以前报道过在急性纹状体脑片中诱发的DA溢出减少DJ-1型−/−老鼠(30). 第三，我们最近获得了类似的证据，证明黑质纹状体终末DA释放减少停车场-急性纹状体薄片和分离的嗜铬细胞的电流测量记录中的缺陷小鼠（T.K.、E.N.P.和J.S.，未发表的结果）。parkin、DJ-1和PINK1在调节细胞外DA释放方面的功能趋同表明隐性帕金森综合征的共同病理生理机制，这一假设也可以解释在帕金森综合症患者中观察到的功能冗余果蝇属派金和PINK1(26，27). 突触前缺陷和多巴胺释放减少如何影响多巴胺能神经元的存活，有待进一步研究，以了解多巴胺释放慢性不足导致多巴胺能终末和最终细胞体逐渐丧失的机制。
方法
的生成粉红色1−/−老鼠。
靶向载体是通过使用1.9 kb的DNA片段（KpnI–Bsr GI）从粉红色1BAC克隆（Invitrogen，Carlsbad，CA）作为5′同源区。用引物1和2 PCR扩增的2.1kb DNA片段作为3′同源区。目标载体还包括PGK-新选择暗盒和底片PGK-DT公司选择磁带。使用标准程序将线性化靶向载体转染到J1（129/Sv）和MK（129/Sv；C57BL/6 F1杂交）ES细胞。将两个ES克隆（MK和J1）注射到C57BL/6或Balb C小鼠的母细胞中。将ES克隆1（MK）获得的嵌合小鼠与129/Sv杂交；C57BL/6层1获得F的杂交小鼠1杂合突变小鼠，然后将其杂交获得纯合突变小鼠以进行进一步分析。除分子分析外，所有实验均以基因型盲法进行。
组织学和神经元计数。
来自两个基因型组的四对大脑被嵌入每个石蜡块中，并以16μm的厚度进行切片。使用Vector Elite ABC试剂盒和DAB对整个SN的每10个中脑切片进行TH（1:1000，兔抗TH；Chemicon，Temecula，CA）免疫组化分析和Nissl复染。SN中DA神经元的数量通过使用无偏体视学的分馏器和光学解剖器方法计数冠状切片中的TH-免疫活性神经元来确定，该图像分析系统由配备BX51显微镜（奥林巴斯，梅尔维尔，纽约州）、CCD相机和Bioquant图像分析软件的计算机控制。
安培记录。
急性冠状纹状体切片的制备、碳纤维微电极的使用和电刺激参数先前在(30). 局部浴敷DA再摄取阻断剂诺米芬新（3μM）30分钟，以评估再摄取在诱发DA信号中的作用。为了制备分离的肾上腺嗜铬细胞，用Ca将分离的髓质分离2+-游离胶原酶IA溶液（0.2%）30分钟，并在1%BSA和0.02%DNase中研制。细胞培养基含有DMEM、10%FBS、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素。将细胞悬液置于35 mm培养皿中的层粘连蛋白涂层玻璃孔上。细胞保持在5%的CO中237°C培养箱。在80 mM K微孢子化后，用碳纤维微电极（尖端直径5μm）电镀后的第1天到第3天进行了电流测量记录+在单个细胞上溶解6秒。数据采集在50 kHz时进行，并在1 kHz时数字后滤波。通过量子大小、振幅、宽度和脉冲间隔平均值的单向方差分析进行统计显著性分析。
电生理学。
如前所述，从2至3个月大的小鼠中制备皮质纹状体薄片（≈250μm）(30). 利用差示干涉对比度和红外显微镜对单个神经元进行全细胞记录。用含有125 mM K的内部溶液填充移液管（3-5 MΩ）+-葡萄糖酸盐、10 mM氯化钠、1 mM氯化钙2，2 mM氯化镁2、1 mM BAPTA、19 mM Hepes、0.3 mM GTP和2 mM Mg-ATP，用KOH调节至pH 7.3。用Axopatch 200B放大信号并存储在PC上（Digidata 1200和pClamp9）。通过电压灯实验（保持电位−80 mV）评估电流-电压（I–V）关系，从−140到−40 mV应用10-mV步长（0.3 s）。使用负步长（−10 mV）测量膜电阻。在电流灯模式下，从−500到+700 pA施加200 pA的步长（1s），研究了烧制特性。对于sEPSCs，在阻断GABA中添加10μM荷包牡丹碱一个-媒介传播。为了分离mEPSCs，我们使用河豚毒素（TTX，1μM）。离线记录和分析EPSC（MiniAnalysis 6.1；Synaptosoft）。
将双极电极置于白质中，诱发皮层纹状体EPSP。在荷包牡丹中以0.1Hz的频率提供测试刺激。对于HFS（三组：3秒持续时间，100赫兹频率，20秒间隔），刺激强度提高到阈值以上。镁2+从溶液中删除以诱导LTP。对于每个细胞，对六个EPSP的振幅进行平均，并绘制为HFS前≈10分钟平均振幅的百分比。对于配对脉冲记录，我们测量了EPSP2/EPSP1比率（PPR，50毫秒刺激间隔）。给出的值为平均值±SEM。学生的t吨检验用于评估统计学意义。药物（荷包牡丹碱甲硫咪胍；西格玛，密苏里州圣路易斯；{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“SKF38398”，“term_id”：“1157404243”，“term_text”：“skF38399”}}38398瑞典克朗，喹吡罗；Tocris，Ellisville，MO）通过将对照灌注切换为含药物溶液来应用。
