蛋白质组学和磷酸蛋白质组学
多重TMT-LC/LC-MS/MS蛋白质组定量分析
等压标记，如iTRAQ和TMT，正在成为一种强大的策略，用于高通量和重复性的深度多重蛋白质组学分析(Bai等人，2017年). 与该方法相关的一个局限性是，在LC-MS/MS分析过程中，目标肽离子通常与其他共洗脱肽离子共同分离，这会导致高噪声水平压缩定量比率并降低测量准确度。幸运的是，比率压缩效应也缓解了实验变化，因此对蛋白质差异表达分析的影响很小(Tan等人，2017年). 此外，通过广泛的肽分馏、狭窄的分离窗口和MS后校正可以减少比率压缩(Niu等人，2017年). 或者，MS3方法几乎可以消除这种比率压缩，但它需要更长的占空比、特定的MS设置以及使用低分辨率MS2进行鉴定，这通常会影响肽/蛋白质鉴定(McAlister等人，2014年). 为了平衡与等压标记相关的利弊，我们通过长梯度高分辨率LC/LC-MS/MS实现了广泛的分离，以实现深层蛋白质组覆盖，并减少量化过程中的离子压缩。此外，我们使用样本复制来促进差异表达蛋白质的统计推断，这是蛋白质组学分析中广泛采用的策略(Bai等人，2017年;Tan等人，2017年).
RMS O-PDX肿瘤组织、成肌细胞和肌管细胞的蛋白质组和磷酸蛋白质组分析108收集每个样本的成肌细胞和肌管细胞，用10ml冰镇PBS清洗两次，然后在液氮中快速冷冻。这些过程在5分钟内完成。将O-PDX移植的小鼠麻醉并在处死前用10ml PBS灌注，收集O-PDX肿瘤组织的中心切片，匀浆，并在液氮中快速冷冻。这些步骤在10分钟内完成。
蛋白质提取、消化、标记和汇集
蛋白质提取、消化、标记和汇集的操作与前面描述的类似(Bai等人，2017年;Tan等人，2017年). 在新制备的裂解缓冲液（50 mM HEPES，pH 8.5，8 M尿素，0.5%脱氧胆酸钠和磷酸酶抑制剂混合物（PhosSTOP，Roche））中裂解RMS O-PDX组织、成肌细胞和肌管细胞。样品裂解物的蛋白质浓度通过BCA蛋白质分析（赛默飞世尔科学公司）以滴定的BSA为标准进行定量~每个样品1 mg蛋白质首先在室温下用Lys-C（Wako，1:100 w/w）消化2小时，用50 mM HEPES（pH 8.5）稀释4倍，然后在室温下再用胰蛋白酶（Promega，1:100 w/w）进一步消化过夜。添加1%三氟乙酸以冷却消化反应，然后使用Sep-Pak C18筒（Waters）脱盐，并使用speedvac干燥脱盐的肽。然后，将样品重新悬浮在50 mM HEPES中，pH值为8.5，并按照制造商的说明，用10-plex TMT试剂进行标记。最后，将10个等压标记样品以等量汇集在一起，用Sep-Pak C18筒再次脱盐，然后进行speedvac干燥。
离线碱性pH反相液相色谱法
如前所述，在安捷伦1220 LC系统上进行碱性pH反相液相色谱肽预分离(Bai等人，2017年;Tan等人，2017年). 将合并的TMT标记样品溶解在缓冲液A（10 mM甲酸铵，pH值8）中，并在两个XBridge C18柱（3.5μm粒径，4.6 mM×25 cm，Waters）上分离成约180个组分，从15%到65%的缓冲液B（95%乙腈，10 mM甲酸铵，pH 8，流速：0.4 ml/min），梯度为220 min。将每个组合部分的5%进行干燥以进行全蛋白组分析，其余95%通过speedvac进行干燥以用于磷酸蛋白组分析。
TiO富集精制磷酸肽2
按照前面描述的改进方案进行磷酸肽富集(Tan等人，2015年). 简单地说，添加肽来清洁TiO2在结合缓冲液（65%乙腈、2%TFA和0.5 mM KH）中肽与珠重量比为1:4的珠（GL科学）2人事军官4)并培养20分钟。将浓缩的磷酸肽洗涤、洗脱、干燥并溶解在5%甲酸中，以进行LC-MS/MS分析。
长梯度酸性pH反相LC-MS/MS
分析是基于我们的优化平台进行的，如前所述(Bai等人，2017年;Tan等人，2017年). 干燥的肽部分在加载缓冲液（5%甲酸）中进行重组，加载到反相柱（75μm×50 cm，1.9μm C18树脂（德国Maisch GmbH博士））上，并与FUSION或Q Exactive HF质谱仪（Thermo Fisher Scientific）接口。用15–65%梯度的缓冲液B洗脱肽6小时（缓冲液a:0.2%甲酸，5%二甲基亚砜；缓冲液B:a缓冲液加65%乙腈，流速：0.25μl/min）。采用蝶形组合加热器（Phoenix S&T）在65°C下加热色谱柱，以降低背压。质谱仪以数据相关模式运行，MS1设置为60000分辨率，1×106AGC目标和最大50 ms离子时间，前20 ms/ms高分辨率扫描，MS2设置为1米/z隔离窗偏移0.2，分辨率60000，最大离子时间100ms，1×105AGC靶点、HCD、33归一化碰撞能量和40秒动态排斥（磷酸蛋白质组的35归一化冲突能量和20秒动态排斥）。
基于标签的混合搜索引擎JUMP识别肽
使用我们最近开发的JUMP搜索引擎进行肽鉴定，提高了灵敏度和特异性(Wang等人，2014年). 商用数据库搜索引擎可分为两类：基于标记的从头开始测序（例如灵敏度有限的峰值）和基于模式的数据库搜索（例如SEQUEST、MASCOT）。JUMP软件集成了这两种方法来对推测的肽进行评分，与这些商用工具相比，显示出了显著的改进(Wang等人，2014年). JUMP软件以前曾在许多出版物中使用过(Gong等人，2017). 分析与前面描述的类似(Tan等人，2017年)首先将MS/MS原始文件转换为mzXML格式，并根据复合目标/诱饵数据库FDR估计进行搜索。靶蛋白数据库由Uniprot小鼠和人类数据库编译而成（人类数据库：88965个蛋白质条目；小鼠数据库：52738个蛋白质条目，2015年2月下载），诱饵数据库通过反转靶蛋白序列生成。以前体离子和产物离子的±10ppm质量耐受性搜索光谱，具有完全胰蛋白酶限制，N-末端TMT标签和赖氨酸的静态修饰（+229.16293），丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的动态修饰（+79.996633，用于磷酸蛋白质组分析），三个最大修饰位点，两个最大遗漏劈理，以及一,b条、和年离子。肽谱匹配（PSM）首先通过MS质量精度（~2ppm，±4个标准偏差）进行过滤。在过滤之前，将JUMP Jscore大于30的双电荷肽PSM用于整体质量重新校准。存活的PSM首先按前体离子电荷状态分组，然后再按Jscore和dJn值进一步过滤。对这些值应用截止值，并进行调整，直到达到蛋白质FDR<1%。如果一个肽由多个蛋白质共享，则根据简约规则，PSM最高的蛋白质将代表该肽(Nesvizhskii和Aebersold，2005年).
Lscore从JUMP软件套件中分配磷灰石
为了确定磷酸化位点在肽上定位的可靠性，我们采用了磷酸化RS算法的概念(Taus等人，2011年)与前面描述的相同，计算每个PSM中的磷脂酶定位得分（Lscore，0–100%）(Tan等人，2017年). 将磷脂酶与蛋白质序列对齐，以生成除PSM Lscore之外的蛋白质水平Lscore。如果针对一个特定的磷酸位点鉴定出多个PSM，则蛋白质Lscore由最高的PSM Lscore表示。由于随机分配含有不明确磷酸位点的PSM通常会导致蛋白质上不可靠磷酸位点的数量过多，因此我们实施了一系列规则来缓解这个问题：（i）如果一个PSM中单个磷酸化肽的第一个和第二个位点之间的PSM L分数差距>10%，则选择L分数最高的位点；（ii）否则，我们检查相应蛋白质中的磷酸化位点，而不是选择具有最高蛋白质Lscore的位点。这允许低质量PSM借用从高质量PSM推断出的信息；（iii）如果PSM和蛋白质水平Lscore都无法区分，则根据发生顺序为磷酸化位点分配启发式优先级：SP-motif、S、T和Y；（iv）如果PSM不满足上述任何规则，则首先通过JUMP Jscores对这些PSM进行分类，然后我们选择由其他高Jscoress的PSM确定的蛋白质磷酸位点。
使用JUMP软件套件进行基于TMT的蛋白质和磷酸化位点定量
该分析按照与之前报告类似的步骤进行(Tan等人，2017年). （i） 提取每个PSM的TMT报告离子强度；（ii）根据每个标记试剂的同位素分布校正原始强度(Tan等人，2017年); （iii）排除了报告离子强度极低的PSM（例如，最小强度<1000，中间强度<5000）；（iv）通过归一化所有PSM的修剪中值强度，校正样本加载偏差；（v） 计算了样本中以平均值为中心的强度(Tan等人，2017年); （vi）通过对相关PSM求平均值来总结蛋白质或磷脂酶的相对强度；（vii）通过将相对强度乘以前三个最丰富的PSM的grand-mean强度，得出蛋白质或磷脂酶的绝对强度。为了生成多批次的组合定量表，每个批次中都包含一个普通样品（SJRHB10468_X1）作为内部标准。根据该内部标准，对不同批次的MS强度进行标准化。
蛋白质组和磷酸蛋白质组的差异表达分析
使用LIMMA R软件包对整个蛋白质组和磷酸蛋白质组进行差异表达分析，该软件用于分析基因表达，同时比较多个基因靶点。LIMMA通过拟合线性模型跨基因借用信息，以克服小样本和复杂实验设计的问题，因此它是基于TMT的深层蛋白质组数据差异表达分析的理想工具。简言之，（i）线性模型适用于每个蛋白质或磷脂酶的表达数据；（ii）使用经验贝叶斯方法跨基因借用信息；（iii）通过Benjamin Hochberg方法调整p值；（iv）然后应用调整后的p值截止值0.05；（v） 在蛋白质组和磷酸蛋白质组的至少一组比较中，通过1.5倍和2.0倍的变化（相当于肿瘤生物复制品的3倍标准偏差）进一步过滤剩余蛋白质。
加权基因共表达网络分析（WGCNA）和通路注释
分析由WGCNA R软件包完成，与前面描述的类似(Tan等人，2017年). 只有DE蛋白和磷酸化位点分别用于定义蛋白质组和磷酸蛋白质组共表达簇（即WPC和PPC）。（i） Pearson相关矩阵是通过计算蛋白质之间的相关性生成的（只考虑了正相关性），并使用无标度拓扑原理计算邻接矩阵，将其进一步提高到16次方。（ii）然后通过混合动态树切割法确定共表达簇(Langfelder等人，2008年)具有用于合并模块的高度截断（例如0.2）；（iii）基于每个共表达簇的第一主成分计算一致趋势（特征基因）。然后将蛋白质分配到相关性最高的共表达簇；（iv）然后使用从MsigDB下载的Hallmark通路数据库对每个共表达簇进行注释(Liberzon等人，2011年)（Hallmark数据库中未注释的肌源性调控途径是从KEGG数据库中手动提取并添加的），通过Fisher精确测试。在每个共表达簇中，选择B.H.调节p值小于0.05的途径作为解除调控的途径。
蛋白质组学的免疫印迹验证
异种组织在含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液（Sigma，目录R0278）中进行裂解（Halt Inhibitor Cocktail，目录87785）。蛋白质在4–15%SDS-PAGE凝胶中溶解并转移到PVDF膜（Millipore）。在Odyssey阻断缓冲液（Licor，目录927-4000）中阻断膜，然后探测以下主要抗体：NOS1（1:1000，细胞信号，目录4234）、HMGA2（1:1000；细胞信号，类别5269）、RPS6的荧光-Ser235/236（1:1000、细胞信号，目2211）、CDC25，磷酸CDC25C（Ser216）（1:1000，细胞信号，目录9528）和肌动蛋白（1:5000，Sigma，AC-15）。次要抗体为抗兔抗体（Licor，目录926–32221）；防鼠（Licor，目录926–32210）。
免疫组织化学
通过一些组织学特征比较患者H&E染色玻片和O-PDX衍生玻片的组织病理学特征的相似性。这些患者-异种移植物对通过以下属性进行评估：总体肿瘤细胞数、生长模式、细胞形态（包括多形性程度）和有丝分裂活性。
使用福尔马林固定石蜡包埋组织（厚度4μm）进行染色，并评估适当的阳性和阴性对照。有关所用抗体的信息如下：
通过免疫组织化学方法对所有患者样本和异种移植组织进行MYF5、CDK4、CDK6、CCND1、CCND2、CCND3、pRB、p16和肌生成素的评估。总共回顾了34张苏木精和伊红染色切片和306张免疫组化染色切片。抗体信息可在下文和关键资源表中找到。
| 抗体在免疫组织化学分析中的应用 |
|---|
| 抗体 | 验证 | 染色剂 | 主机 | 稀释 | 检索 | 放大/
舞台调度
试剂 | 供应商/
猫# |
|---|
| MYF5型 | 鲁奥 | 过激的 | 马来西亚令吉 | 1:25 | 第2页–第92页
最小值 | 无 | abcam；
ab125078号 |
| 肌生成素 | 体外诊断 | 过激的 | MP公司 | 1:500 | CC1–64号机组
最小值 | 无 | Dako；
M3559型 |
| 第16页 | 体外诊断 | 过激的 | MM（毫米） | 远程终端设备 | CC1–48号机组
最小值 | 无 | 罗氏；
705–4713 |
| pRB（pRB） | 鲁奥 | 过激的 | RP公司 | 1:100 | CC1–64号机组
最小值 | 无 | 单元格
信号；
9301秒 |
| CCND3号机组 | 鲁奥 | 奥姆尼斯 | MM（毫米） | 1:400 | 高pH值
TR 30型
最小值 | 鼠标链接器-
10分钟 | 单元格
信号传导；
2936 |
| CCND2号机组 | 鲁奥 | 债券-
三 | RP公司 | 1:100 | ER1–20
最小值 | 无 | 圣诞老人
克鲁兹；供应链-
593 |
| CCND1号机组 | 体外诊断 | 过激的 | 马来西亚令吉 | 远程终端设备 | CC1–36号机组
最小值 | 无 | 单元格
品牌：
241R-18型 |
| 川东北6 | 若 | 过激的 | MM（毫米） | 1:25 | CC1–64分钟 | 无 | 圣诞老人
克鲁兹；
sc7961型 |
| 川东北4 | 鲁奥 | 过激的 | MM（毫米） | 1:50 | CC1–64号机组
最小值 | AB公司
布洛克（罗氏） | 圣诞老人
克鲁兹；
sc260标准 |
体外诊断-体外试验诊断，RUO-仅供研究使用，Bond-III-徕卡，Omnis-Dako，Ultra-Ventana BenchMark Ultra（Roche），MP-小鼠多克隆，RM-兔单克隆，MM-小鼠单克隆，RP-兔多克隆，CC1-细胞调节溶液1，TR-热回收，RTU-随时可用
评估抗体的染色强度，从无反应到3+。记录具有预期染色定位的肿瘤细胞百分比。这仅限于MYF5、CCND1、CCND2、CCND3、pRB、p16和肌生成素的核染色。CDK4和CDK6的细胞质或细胞核染色均可接受。根据预期的染色定位，评估患者和异种移植物样本之间的不一致性。当出现完全差异（一个样本阳性，另一个样本阴性或染色<5%）时，或当两个样本均阳性但样本之间存在显著差异（>50%）时，出现不一致。如果染色完全失败，则认为比较不适用。
药动学试验
帕尔博西利布
在单次口服16 mg/kg帕尔博西布林游离碱当量后，评估雌性裸鼠（Charles River Laboratories，12-16周龄）的帕尔博西布林总血浆和肿瘤PK。将盐酸帕尔博西利（MedKoo，批号SSC40317，纯度99%）悬浮于1%甲基纤维素（MC，类型400 cPs）和1%吐温80（1%MCT）超纯水中，最终标称浓度为1.6 mg/mL游离碱当量，灌胃体积为10 mL/kg。使用IACUC批准的方法在给药后10分钟、1小时、4小时、8小时和24小时处死小鼠，每个时间点3只小鼠。通过心脏穿刺将全血收集到含有10μL肝素钠的塑料微型离心管中，旋涡混合抗凝剂，立即离心至血浆中，并保存在干冰上，以备研究剩余时间之用。然后通过右心室用无钙和无镁的PBS灌注小鼠，切除原位异种移植物，用PBS冲洗，称重，分成等分试样，并置于干冰上。在体内程序结束时，从干冰中转移所有样品，并将其置于−80°C的温度下，直至分析。
使用灵敏且特异的液相色谱法和串联质谱法评估血浆和肿瘤匀浆中帕波西卜的总浓度。首先，用5:1体积的超纯水稀释肿瘤样本，并用基于珠的技术进行均质(Liang等人，2011年)在FastPrep-24系统上（MP Biomedicals，加州圣安娜）。将1.4 mm陶瓷球（MP Biomedicals，Lysing matrix D，10 mg/mg肿瘤）添加到含有样品的微离心管中。然后在FastPrep-24系统上对样品进行三次6.0 M/S振动循环，每次1分钟。为了防止摩擦导致过热，在每个循环之间将样品放置在湿冰上5分钟。然后将匀浆储存在−80°C下，直至分析。
在乙腈中制备盐酸帕尔博西利（MedKoo，批号SSC40317，纯度99%）储备溶液，并用于加标基质校准品和质量控制。血浆和肿瘤匀浆样品（各25μL）用75μL的10 ng/mL LEE011（Cayman Chemical Co.，Lot 0467691–2，纯度≥95%）在乙腈中进行蛋白质沉淀，作为内部标准。通过LEAP CTC PAL自动取样器将2μL等分提取的上清液注入岛津LC-20ADXR高效液相色谱系统。使用Phenomenex Gemini C6 Phenyl（3.0μm，30 mm x 2.0 mm）色谱柱进行液相色谱分离，色谱柱保持在60°C，梯度洗脱，流速为0.50 mL/min。二元流动相由储液罐a中pH为6.0（90:10 v/v）的水200 mm醋酸铵和pH为6.0的乙腈水-200 mm醋酸铵盐组成初始流动相由25%的B组成，在三分钟内线性增加到65%的B。然后在100%的B下冲洗柱两分钟，然后在初始条件下平衡两分钟，总运行时间为七分钟。在这些条件下，分析物和IS分别在1.36和1.04分钟洗脱。
使用SCIEX API 5500 Q-TRAP在正ESI模式下用串联质谱法检测分析物和IS，监测以下质量变化：Palbociclib 448.25->380.10，LEE011 435.26->322.20。
方法鉴定和生物分析运行均通过了P-PKSR的非GLP分析性能验收标准。二次模型（1/X2称重）在1至500 ng/mL范围内拟合校准品，相关系数（R）≥0.9951。定量下限（LLOQ）定义为峰面积信噪比为5或更大，与IS的基质空白相比为1 ng/mL。批内精密度和准确度分别为<14.9%CV和103%-114%。
根据矩阵和时间点对所得的帕尔博西布林浓度-时间（Ct）数据进行分组，手动插补低于定量下限（BLOQ）的数据如下：如果在任何时间点≥2/3rds的Ct结果高于LLOQ，则BLOQ数据替换为½LLOQ值，ELSE将整个时间点的数据视为缺失。然后，使用Phoenix WinNonlin 6.4（Certara USA，Inc.，Princeton，NJ）生成Ct数据汇总统计数据（算术平均值、标准偏差、%CV、最小值、中位数、最大值），并对每个基质的palbociclib算术平均Ct数据进行非部分药代动力学分析（NCA）。应用血管外模型（模型202），并使用“线性上升-下降”梯形规则估计Ct曲线下面积（AUC）值。终相被定义为Ct曲线末端的三个时间点，使用终相的未加权对数线性回归估计消除速率常数（Ke）。终端消除半衰期（T1/2）估计为0.693/Ke，从时间0到无穷大的AUC（AUCinf）估计为到最后一个时间点的AUC+预测的碎屑/Ke。
估计的其他NCA参数包括观察到的最大浓度（Cmax）、Cmax时间（Tmax），最后一个观察到的时间点的浓度（Clast）、Clast时间（Tlast）、表观清除率（CL/F=剂量/AUCinf）和表观终末分布体积（Vz/F）。给药间隔（Cavg）的平均浓度估计为AUCinf/给药间隔小时数。palbociclib从血浆到相关组织的表观分配系数（Kp，组织)估计为可用时AUCinf、组织与AUCinf血浆的比值。为了估计与临床相关的小鼠剂量，将合成的小鼠血浆AUCinf与报告的人类血浆PK值进行比较，假设单药帕尔博西利批准剂量为125 mg PO QD。所有的推断都是在小鼠和人类的非时间依赖性、线性和剂量比例PK假设下进行的。
考虑到系列牺牲设计，Palbociclib在研究中表现出中度PK变异性。血浆浓度变异系数（CV）为13.5%至58.4%，肿瘤浓度变异系数为25.3%至68.5%。最大的变化发生在第一个采样时间点10分钟，即在吸收阶段。表观血浆清除率（CL/F）估计值为5.47 L/hr/kg，与之前发表的文献中得出的结果相似（4.0至5.9 L/hr/kg]）(Parrish等人，2015年). 与文献相比，表观终末半衰期（T1/2）稍短（2.61小时vs.约3.4小时）。Palbociclib在原位RMS异种移植物中分布良好，达到了比血浆高约6倍的浓度。肿瘤中的T1/2比血浆长1.8倍。NCA参数估计值和按矩阵分组的平均值（SD）palbociclib Ct图如下所示：
美国食品药品监督管理局批准的帕博西立普普通剂量为125 mg PO QD，持续21天，然后休息7天。以下PK和ADME信息来自帕博西立普美国食品药品监督管理局NDA审查。帕博昔单抗的群体PK分析显示，典型患者的平均血浆CL/F为60.2 L/小时，导致稳态时估计的总血浆AUCtau为2080小时ng/mL。据报道，患者体内帕尔博西利的血浆半衰期为22至29小时。此外，在两项临床研究中多次服用帕尔博西利125 mg PO QD后，平均血浆总Cmax范围为94.9至116 ng/mL，平均Ctrough为61 ng/mL。通过标准计算，患者的估计血浆总Cavg，ss约为85 ng/mL。由于小鼠和人类之间的血浆蛋白结合没有明显差异（Fu分别为0.159和0.147），因此可以使用血浆总浓度来估算小鼠等效剂量（MED）。假设小鼠的剂量和时间线性PK和最小研究间PK变异性，并基于人类血浆总AUCinf和AUCtau，MED估计为每天10 mg/kg帕博西利游离碱当量，该配方在类似的研究条件下。同样，小鼠血浆Cavg支持这一剂量，后估计的Cavg为76.9 ng/mL，与观察到的患者Cavg ss为85 ng/mL相似。
阿贝马奇利布
单次口服50 mg/kg阿贝马昔布游离碱当量后，评估雌性裸鼠（Charles River Laboratories，8–16周龄）的阿贝马昔布总血浆和肿瘤PK。将甲磺酸阿贝马西利（LY2835219，Abmole，M2112，Lot 2，纯度>98%）悬浮于1%羟乙基纤维素（HEC）、0.25%吐温80和~0.05%西米硫醇的超纯水中，最终标称浓度为5 mg/mL游离碱当量，灌胃体积为10 mL/kg。使用IACUC批准的方法在给药后10分钟、1小时、4小时、8小时和24小时处死小鼠，每个时间点3只小鼠。通过心脏穿刺收集全血至Sarstedt Microvette®500μl K3 EDTA微型离心管，旋涡混合抗凝剂，立即离心至血浆中，并储存在干冰上，以备剩余研究之用。然后通过主动脉用PBS灌注小鼠，切除原位异种移植物，用PBS冲洗，并放在干冰上。在体内程序结束时，从干冰中转移所有样品，并将其置于−80°C的温度下，直至分析。
使用灵敏且特异的液相色谱法和串联质谱法评估血浆和肿瘤匀浆Abemacilib的总浓度。首先，用体积为5:1的超纯水稀释肿瘤样本，并用基于珠的技术进行均质(Liang等人，2011年)在FastPrep-24系统上（MP Biomedicals，加州圣安娜）。将1.4 mm陶瓷球（MP Biomedicals，Lysing matrix D，10 mg/mg肿瘤）添加到含有样品的微离心管中。然后在FastPrep-24系统上对样品进行三次60 M/S的振动循环，每次1分钟。为了防止摩擦导致过热，在每个循环之间将样品放置在湿冰上5分钟。然后将匀浆储存在−80°C下，直至分析。
在乙腈中制备甲磺酸阿贝马西布（LY2835219，Abmole，M2112，Lot 2，纯度>98%）储备溶液，校正盐含量，并用于加标基质校准品和质量控制。血浆和肿瘤匀浆样品（各25μL）用100μL 150 ng/mL帕尔博西利（LC Labs，P-7788，Lot PLH-103，纯度>99%）在乙腈中沉淀蛋白作为内标。通过LEAP CTC PAL自动取样器将2μL等分提取的上清液注入岛津LC-20ADXR高效液相色谱系统。使用Phenomenex Kinetex 2.6μm EVO C18（100μm，50×2.1 mm）在50°C下进行LC分离，梯度洗脱，流速为0.5 mL/min。二元流动相由20 mm醋酸铵在H中组成2储液罐A中的O和储液罐B中的甲醇：乙腈：异丙醇（40:30:30 v/v）。初始流动相保持在25%B下0.5 min，然后在2.5 min内线性增加到100%B。然后在100%B下冲洗柱2 min，然后再在初始条件下平衡2 min，总运行时间为7 min。在这些条件下，分析物和IS分别在1.37和0.98 min洗脱。
使用SCIEX API 5500 Q-TRAP在正ESI模式下用串联质谱法检测分析物和IS，并监测以下质量转变：abemaciclib 507.28>393.20，palbociclib 448.25->380.10。
实验生物分析运行均被发现可用于单一非GLP临床前PK评估。线性模型（1/X2称重）在5.00至500 ng/mL范围内拟合校准品，相关系数（R）≥0.9967。定量下限（LLOQ）定义为峰面积信噪比为5或更大，与IS的基质空白相比为5.00 ng/mL。整个基质的批内精密度和准确度分别为<15.6%CV和90.7%至112%。
生成的阿贝马西布林浓度-时间（Ct）数据按矩阵和时间点分组，低于定量下限（BLOQ）的数据手动插补如下：如果在任何时间点≥2/3rds的Ct结果高于LLOQ，则BLOQ数据替换为½LLOQ值，ELSE将整个时间点的数据视为缺失。然后，使用Phoenix WinNonlin 6.4（Certara USA，Inc.，Princeton，NJ），生成Ct数据汇总统计数据（算术平均值、标准差、%CV、最小值、中值、最大值），并对每个矩阵的阿贝马昔单抗算术平均Ct数据进行非部门药代动力学分析（NCA）。应用血管外模型（模型202），并使用“线性上升-下降”梯形规则估计Ct曲线下面积（AUC）值。终相被定义为Ct曲线末端的三个时间点，使用终相的未加权对数线性回归估计消除速率常数（Ke）。终末消除半衰期（T1/2）估计为0.693/Ke，从时间0到无穷大的AUC（AUCinf）估计为到最后一个时间点的AUC（AUClast）+预测的Clast/Ke。
估计的其他NCA参数包括观察到的最大浓度（Cmax）、Cmax的时间（Tmax）、最后一个观察到的时间点的浓度（Clast）、Clast的时间（Tlast）、表观清除率（CL/F=剂量/AUCinf）和表观终末分布体积（Vz/F）。给药间隔（Cavg）的平均浓度估计为AUCinf/给药间隔小时数。阿贝马西利从血浆到相关组织的表观分配系数（Kp，组织)估计为可用时AUCinf、组织与AUCinf血浆的比值。为了估计与临床相关的小鼠剂量，将合成的小鼠血浆AUCinf与报告的人类血浆PK值进行比较，假设单药阿贝马西利最大耐受剂量（MTD）为200 mg PO BID(Patnaik等人，2016年). 所有的推断都是在小鼠和人类的非时间依赖性、线性和剂量比例PK假设下进行的。
Abemacilib浓度在小鼠血浆中表现出较低的变异性，在采样时间点上的变异系数为4.1%至40.1%，在血浆和肿瘤中的0.167小时时间点的变异性最高。所有血浆和肿瘤结果均高于LLOQ。肿瘤穿透似乎相对较快且广泛，基于AUCinf，Kp肿瘤值为6.20。阿贝马西利在血浆中的T1/2为5.2小时，在肿瘤中观察到类似的半衰期（5.98小时）。值得注意的是，我们在50 mg/kg PO条件下的阿贝马西利血浆PK与Tate报告的不同(Tate等人，2014年). 我们的小鼠在给药后4小时内显示出类似的血浆Ct曲线，但随后浓度迅速下降，导致AUC降低约3.8倍。尽管使用了甲磺酸盐形式和相同的混悬剂配方，但我们的小鼠并未表现出这些研究人员所描述的长期吸收和低CL/F。NCA参数估计值和平均值（SD）abemacilib Ct图（按矩阵分组）如下所示：
在一项持续服用阿贝马西利单药的第1阶段研究中，MTD为200 mg PO BID。稳态下人体总血浆AUCtau的几何平均值为3000 hr-ng/mL，相应的几何平均谷浓度为197 ng/mL。假设小鼠的剂量比例和线性PK过程，小鼠的等效剂量（MED）为提供相似的总血浆AUC为14.4 mg/kg。测定小鼠和人类血浆中未结合的平均体外分数（Fu，p），得出值分别为0.054和0.027(Raub等人，2015年). 由于这些值处于两倍阈值，定义了临床前研究的显著差异，因此尚不清楚是否应根据两个物种之间的血浆蛋白结合调整阿贝马西布剂量。因此，根据未结合和总血浆AUC，四舍五入和推荐的MED范围分别为7.5至15 mg/kg PO BID。此范围内的剂量还应提供与200 mg PO BID时人类类似的未结合稳态血浆浓度。可能需要进行更多的PK研究，以确定我们的血浆PK与Tate报告的差异的来源，或进一步确认我们的PK发现。
曲美替尼
在单次口服0.1 mg/kg曲美替尼游离碱当量后，评估雌性裸鼠（Charles River Laboratories，12-16周龄）的曲美替尼总血浆和肿瘤PK。将曲美替尼游离碱（Abmole，批号M1759，纯度>99%）悬浮于5%二甲基亚砜（DMSO）、10%克雷莫波尔RH40和10%PEG400中75%超纯水中，最终标称浓度为0.02 mg/mL游离碱当量，灌胃体积为5 mL/kg。使用IACUC批准的方法在给药后30分钟、1小时、4小时、8小时和16小时处死小鼠，每个时间点3只小鼠。通过心脏穿刺收集全血至Sarstedt Microvette®500μl K3 EDTA微型离心管，旋涡混合抗凝剂，立即离心至血浆中，并储存在干冰上，以备剩余研究之用。然后通过右心室向小鼠灌注无钙和无镁PBS，切除原位异种移植物，用PBS冲洗，称重，分成小份，放在干冰上。在体内程序结束时，从干冰中转移所有样品，并将其置于−80°C的温度下，直至分析。
采用灵敏、特异的液相色谱法和串联质谱法评估曲美替尼血浆和肿瘤匀浆的总浓度。首先，用体积为5:1的超纯水稀释肿瘤样本，并用基于珠的技术进行均质(Liang等人，2011年)在FastPrep-24系统上（MP Biomedicals，加州圣安娜）。将1.4 mm陶瓷球（MP Biomedicals，Lysing matrix D，10 mg/mg肿瘤）添加到含有样品的微离心管中。然后在FastPrep-24系统上对样品进行三次6.0M/S振动循环，每次1分钟。为了防止摩擦导致过热，在每个循环之间将样品放置在湿冰上5分钟。然后将匀浆储存在−80°C下，直至分析。
在乙腈中制备曲美替尼游离碱（Abmole，Lot M1759，纯度>99%）储备溶液，并用于刺入基质校准器和质量控制。血浆和肿瘤匀浆样品各25μL，用75μL的75 ng/mL雷美替尼（开曼化学公司，批号0464258-2，纯度≥95%）在乙腈中作为内标进行蛋白质沉淀。通过LEAP CTC PAL自动取样器将2μL等分提取的上清液注入岛津LC-20ADXR高效液相色谱系统。使用Phenomenex Gemini C6 Phenyl（3.0μm，30 mm x 2.0 mm）色谱柱进行液相色谱分离，色谱柱保持在60°C，梯度洗脱，流速为0.50 mL/min。二元流动相由储液罐a中pH为6.0（90:10 v/v）的水200 mm醋酸铵和pH为6.0的乙腈水-200 mm醋酸铵盐组成初始流动相由25%的B组成，在三分钟内线性增加到65%的B。然后在100%的B下冲洗柱两分钟，然后在初始条件下平衡两分钟，总运行时间为七分钟。在这些条件下，分析物和IS分别在2.91和2.8分钟洗脱。
使用SCIEX API 5500 Q-TRAP在正ESI模式下用串联质谱法检测分析物和IS，并监测以下质量转换：曲美替尼616.04->491.10，雷美替尼572.91->394.00。
实验生物分析运行均被发现可用于单一非GLP临床前PK评估。线性模型（1/X2称重）在1.00至500 ng/mL范围内拟合校准品，相关系数（R）≥0.9985。定量下限（LLOQ）定义为峰面积信噪比为5或更大，与IS的基质空白相比为1.00 ng/mL。整个基质的批内精密度和准确度分别为<5.73%CV和95.8%至103%。
将生成的曲美替尼浓度-时间（Ct）数据按矩阵和时间点分组，手动插补低于定量下限（BLOQ）的数据如下：如果在任何时间点≥2/3的Ct结果高于LLOQ，则BLOQ数据替换为½LLOQ值，ELSE将整个时间点的数据视为缺失。然后，使用Phoenix WinNonlin 6.4（Certara USA，Inc.，Princeton，NJ）生成Ct数据汇总统计数据（算术平均值、标准偏差、%CV、最小值、中位数、最大值），并对每个基质的曲美替尼算术平均Ct数据进行非部门药代动力学分析（NCA）。应用血管外模型（模型202），并使用“线性上升-下降”梯形规则估计Ct曲线下面积（AUC）值。终相被定义为Ct曲线末端的三个时间点，使用终相的未加权对数线性回归估计消除速率常数（Ke）。终端消除半衰期（T1/2）估计为0.693/Ke，从时间0到无穷大的AUC（AUCinf）估计为到最后一个时间点的AUC+预测的碎屑/Ke。
估计的其他NCA参数包括观察到的最大浓度（Cmax）、Cmax时间（Tmax），最后一个观察到的时间点的浓度（Clast）、Clast时间（Tlast）、表观清除率（CL/F=剂量/AUCinf）和表观终末分布体积（Vz/F）。给药间隔（Cavg）的平均浓度估计为AUCinf/给药间隔小时数。曲美替尼从血浆到相关组织的表观分配系数（Kp，组织)估计为可用时AUCinf、组织与AUCinf血浆的比值。为了估计与临床相关的小鼠剂量，在假定的单药曲美替尼最大耐受剂量（MTD）为2 mg PO QD时，将生成的小鼠血浆AUCinf与报告的人类血浆PK值进行比较。所有的推断都是在小鼠和人类的非时间依赖性、线性和剂量比例PK假设下进行的。
曲美替尼在研究中的PK变异性较低，浓度变异系数（CV）在5.57%至26.4%之间。在采样期间，肿瘤中没有足够的终相，因此肿瘤终相参数无法估计。利用AUClast、肿瘤与AUClast血浆a Kp的比值，估计肿瘤为5.49。NCA参数估计值和平均值（SD）曲美替尼Ct图（按矩阵分组）如下所示：
FDA批准的单药曲美替尼的常用剂量为每天一次性服用2毫克PO。曲美替尼的群体PK分析(Ouellet等人，2016年)结果显示，典型女性患者的平均血浆CL/F为4.91 L/hr，典型男性患者为6.19 L/hr，导致不同性别的平均AUC为365 hr-ng/mL。据报道，患者中曲美替尼的血浆半衰期为92.5至115小时。在每天一次性多次给药2 mg曲美替尼可稳定后，患者的平均血浆总Cmax范围为17.9至21.2 ng/mL，平均Ctrough范围为11.7至15.0 ng/mL。根据标准计算，患者的估计血浆总Cavg，ss约为15.1 ng/mL。小鼠和人类血浆中未结合的曲美替尼组分（Fu，p）分别为0.05和0.03。通过Fu，p对每个物种的AUC和Cavg的关键PK参数进行调整，在指定的共溶剂溶液中，0.1 mg/kg PO QD的MED在临床上与人类的2 mg PO QD相当。
甘奈特斯比
通过尾静脉缓慢静脉注射（IV）150 mg/kg后，评估雌性裸鼠（Charles River Laboratories，年龄8-16周）中ganetespib的总血浆和肿瘤PK。将Ganetespib（MedChem Express，HY-15205，批号08249，纯度>98%，摩尔Wt 364.40）溶于二甲基亚砜中，并用Kolliphor RH 40（Sigma）在5%注射用葡萄糖中进一步稀释，USP（D5W，Baxter）在10%DMSO/18%Kolliphor RH 40/72%D5W和10mL/kg注射体积中最终标称浓度为15mg/mL。使用IACUC批准的方法在给药后10分钟、1小时、4小时、8小时和16小时处死小鼠，每个时间点处死3只小鼠。通过心脏穿刺用肝素钠收集全血，立即离心至血浆中，并储存在干冰上，以供研究剩余时间使用。然后通过主动脉用PBS灌注小鼠，切除原位异种移植物，用PBS冲洗，并放在干冰上。在体内程序结束时，从干冰中转移所有样品，并将其置于−80°C的温度下，直至分析。
使用灵敏和特异的液相色谱、串联质谱（LC-MS/MS）分析法评估了甘奈特氏菌血浆和肿瘤匀浆的总浓度。首先，组织样品被浸渍，用5:1体积的超纯水稀释，并用基于珠的技术均质(Liang等人，2011年)在FastPrep-24系统上（MP Biomedicals，加州圣安娜）。将陶瓷溶珠基质（MP Biomedicals，Ceramic Bead lysing matrix，3mg/mg组织）添加到含有肿瘤样本的微离心管中。然后在FastPrep-24系统上对样品进行三次60 M/S的振动循环，每次1分钟。为了防止摩擦导致过热，在每个循环之间将样品放置在湿冰上5分钟。然后将匀浆储存在−80°C下，直至分析。
Ganetespib储备溶液在100%甲醇中制备，用于添加基质校准品和质量控制。血浆和组织匀浆样品各50μL，用10μL内标物（SLV320，Tocris Bioscience，纯度>99%）100 ng/mL加标溶液处理，然后使用甲基叔丁基醚进行液-液萃取程序，涡旋并在4°C下离心，上清液在CentriVap离心真空浓缩器（Labconco）中蒸发至干燥。然后用100μL 100%乙腈重新配制提取物，并通过岛津SIL-20ACXR自动取样器将5μL等分的重新配制提取物注入岛津LC20ADXR高效液相色谱系统。使用Phenomenex Luna C8 80 Au LC柱（4.0μm，30 mm x 2 mm）在室温下进行LC分离，梯度洗脱，流速为0.25 mL/min。二元流动相由储液罐a中超纯水中的0.1%甲酸和储液罐B中乙腈中0.1%甲酸组成。初始流动相由5%B组成，在2.5分钟内增加到90%B。在90%B下维持4分钟后，然后在100%B下冲洗柱1分钟，然后在初始条件下平衡1.5分钟，总运行时间为9分钟。在这些条件下，分析物和IS分别在3.52和2.86分钟洗脱。
使用SCIEX API 4000在正ESI模式下使用串联质谱法检测分析物和IS，并监测以下质量转变：ganetespib 365.2->131.1，SLV320 309.2->211.1。
实验生物分析运行均被发现可用于单一非GLP临床前PK评估。线性模型（1/X2称重）在5至200 ng/mL范围内拟合校准品，相关系数（R）≥0.99。在校准范围以上，以足够的精度和准确度稀释质控样品。定量下限（LLOQ）定义为峰面积信噪比为5或更大，与IS的基质空白相比，由于稀释因子，血浆为5 ng/mL，组织为30 ng/mL。整个矩阵的批内精密度和准确度分别≤9.62%CV和98.5%至111%。
根据矩阵和时间点对合成的ganetespib浓度-时间（Ct）数据进行分组，手动插补低于定量下限（BLOQ）的数据如下：如果在任何时间点≥2/3rds的Ct结果高于LLOQ，则BLOQ数据替换为½LLOQ值，ELSE将整个时间点的数据视为缺失。然后，使用Phoenix WinNonlin 6.4（Certara USA，Inc.，Princeton，NJ）生成Ct数据汇总统计数据（算术平均值、标准偏差、%CV、最小值、中位数、最大值），并对每个基质的ganetespib算术平均Ct数据进行非部门药代动力学分析（NCA）。采用静脉推注模型（模型201），并使用“线性向上-向下”梯形规则估计Ct曲线（AUC）值下的面积。终相被定义为Ct曲线末端的三个时间点，使用终相的未加权对数线性回归估计消除速率常数（Ke）。终端消除半衰期（T1/2）估计为0.693/Ke，从时间0到无穷大的AUC（AUCinf）估计为到最后一个时间点的AUC+预测的碎屑/Ke。
估计的其他NCA参数包括反萃初始浓度（C0）、观察到的最大浓度（Cmax）、Cmax时间（Tmax），最后观察到的时间点的浓度（Clast）、Clast时间（Tlast）、清除率（CL=剂量/AUCinf）和稳态分布体积（Vss）。ganetespib从血浆到相关组织的表观分配系数（Kp，组织)估计为可用时AUCinf、组织与AUCinf血浆的比值。为了估计临床相关的小鼠剂量，将得到的小鼠血浆AUCinf与在假定的单剂甘尼特司匹布（200 mg/m）下报告的人血浆PK值进行比较2这是建议的第2阶段剂量（RP2D）(Goldman等人，2013年). 所有推断都是在小鼠和人类中时间无关、线性和剂量比例PK的假设下进行的。
Ganetespib浓度在血浆中表现出中等的变异性，表明在整个采样时间点的变异系数为2.9%至65.6%。所有血浆和肿瘤结果均高于LLOQ。肿瘤穿透似乎很快但不太严重，基于AUCinf，Kp肿瘤值为0.639。ganetespib在血浆中的T1/2为2.03小时。肿瘤的表观半衰期比在血浆中观察到的半衰期长（8.42小时），表明ganetespab对原位肿瘤的亲和力很高。肿瘤的明显Vss也表明ganetespib具有较高的原位肿瘤保留率。值得注意的是，我们的血浆和肿瘤PK与Shimamura等人发表的小鼠静脉注射125 mg/kg的PK一致(Shimamura等人，2012年). NCA参数估计值和按矩阵分组的平均（SD）ganetespib-Ct图如下所示：
在单剂ganetespib的第1阶段研究中，每周静脉注射一次，为期3周，为期4周，200mg/m2是RP2D(Goldman等人，2013年). ganetespib的主要不良反应是腹泻和疲劳；然而，视网膜毒性一直备受关注。在人类研究的剂量范围内（7至259 mg/m），Cmax和AUC值似乎以剂量比例方式增加2). 200 mg/m时人体总血浆AUCinf的估计值2约为7000 hr-ng/mL。假设小鼠的剂量比例和线性PK过程，提供类似总血浆AUCinf的小鼠等效剂量（MED）将为12.8 mg/kg。ganetespib的血浆蛋白结合仅被报告为“高”，缺乏关于物种间差异程度的数据。因此，在小鼠和人类血浆蛋白结合相似的假设下，MED只能通过血浆总浓度得出。
值得注意的是，有数据表明，高亲和力HSP90抑制剂（如ganetespib）可能不会表现出剂量比例PK，尤其是在小鼠中(Yamazaki等人，2013年). 这被认为是由于靶点介导的药物处置，其中化合物对高度丰富和特异性靶点的亲和力驱动非线性组织分布。我们在小鼠体内静脉注射50 mg/kg ganetespib后产生了有限的血浆PK，这表明可能是这种情况（数据未显示）。在这种情况下，剂量从50毫克/千克增加到150毫克/千克的3倍会导致注射后10分钟血浆Cmax增加约17倍。因此，当我们从150 mg/kg剂量的AUC中反萃MED时，很难假设成比例。考虑到这一点，我们在小鼠药效模型中评估了ganetespib的两个剂量水平：10 mg/kg（可能接近MED）和50 mg/kg。
