蛋白质组学。作者手稿;PMC 2016年1月1日提供。
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磷酸盐添加剂富集精制磷酸肽及人脑磷酸蛋白质组分析
,1 ,2 ,2,4 ,2 ,2 ,1 ,三 ,5和1,2,6
海燕滩
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吴志平
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王宏(Hong Wang)
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冰白
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李玉欣
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王旭升
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薄斋
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托马斯·G·比奇
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彭俊敏
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三美国田纳西州孟菲斯市圣裘德儿童研究医院治疗药物生产与质量部,邮编38105
4田纳西大学健康科学中心综合生物医学科学项目,田纳西州孟菲斯,38163,美国
5美国亚利桑那州太阳城Banner Sun健康研究所,邮编85351
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摘要
阿尔茨海默病(AD)是最常见的痴呆症,其特征是认知功能逐渐丧失。AD的病理特征之一是由异常高磷酸化tau蛋白组成的神经原纤维缠结的形成,但对AD中蛋白磷酸化的全局放松调控还没有很好的分析。在这里,我们报道了通过二氧化钛富集结合高分辨率液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对AD磷酸化蛋白质组的初步研究。在富集方法的优化过程中,我们发现低浓度(例如1 mM)的磷离子可以有效地作为非磷酸肽竞争对手来降低背景。该程序在肽珠比、磷酸肽回收率和纯度方面进行了进一步调整。使用这种改进的方法和9小时LC-MS/MS,我们分析了一毫克消化的AD脑裂解物中的磷酸蛋白质组,识别出5243个磷酸肽,其中包含1455个蛋白质上3715个非冗余磷酸位点,包括tau蛋白上的31个磷酸位点。这种改良的富集方法既简单又高效。AD病例研究证明了在有限数量的死后人脑中解剖磷酸蛋白质组的可行性。
关键词:磷酸化、磷酸肽富集、LC-MS/MS、人脑、阿尔茨海默病
1.简介
阿尔茨海默病(AD)是一种进行性神经退行性疾病,导致记忆丧失[1]。全世界约有3560万AD患者。AD脑表现为两种病理特征,淀粉样蛋白-β聚集斑块和含tau的神经原纤维缠结,使淀粉样蛋白升高[2]和τ假说[三]AD发病机制。蛋白磷酸化失调在AD脑中早已为人所知,例如tau过度磷酸化,导致神经原纤维缠结的形成[4],以及神经丝的磷酸化[5]和微管相关蛋白1B[6]。越来越多的激酶和磷酸酶可能有助于这种异常修饰,如GSK-3β、微管亲和性调节激酶、细胞周期素依赖性激酶5、丝裂原活化蛋白激酶、丝氨酸-精氨酸蛋白激酶2和蛋白磷酸酶2A[7,8]。然而,AD中的整体磷酸化改变没有很好的特征,部分原因是人类磷酸蛋白质组分析中的技术问题。
基于质谱(MS)的蛋白质组学技术的最新发展使得大规模分析磷酸蛋白质组成为可能[9]。磷蛋白组通常通过结合富集策略和液相色谱-串联质谱(LCMS/MS)进行分析。许多磷酸肽富集方法已经开发出来,包括固定化金属或金属氧化物亲和色谱法,如铁3+离子[10,11]、二氧化钛(TiO2) [12,13]、钛纳米聚合物[14]、阳离子和阴离子交换色谱法[15-17],抗体捕获[18-20]、磷酸钙沉淀、化学衍生[21,22]以及这些方法的组合[23]。氧化钛2该方法因具有高选择性、回收率和重现性而广受欢迎。同时,采用亚2μm树脂填充的长柱和最新型号的高分辨率质谱仪后,LCMS/MS系统的灵敏度显著提高[24].
在这里,我们描述了一种简化、有效的磷酸肽富集方案及其在分析死后AD大脑中的应用。TiO公司2富集取决于磷酸基团与TiO的亲和结合2通过配位键,其中羧基的非特异性结合因竞争对手的加入而减少,例如2,5-二羟基苯甲酸、谷氨酸和乳酸[12,25]。在优化方法的过程中,我们发现游离磷酸盐是一种有效的竞争对手,并且肽珠比应根据不同的样品而变化。最后,我们用长梯度LC-MS/MS对一例AD患者的磷酸蛋白质组进行了测试,鉴定出5000多个磷酸肽,错误发现率小于0.5%。
2.材料和方法
2.1蛋白质样品制备
来自前额叶皮质区的人类冷冻组织由Banner Sun健康研究所的大脑和身体捐赠计划提供。AD病例的临床和病理特征符合既定标准[26],尸检间隔不到3小时。本研究由Banner Sun健康研究所批准。成年大鼠大脑购自Pel Freez Biologicals。
为了从脑组织中提取蛋白质,用剃须刀片切割样品,并在三种不同尺寸的玻璃珠(直径分别为0.5 mm、1 mm和5 mm,Sigma)的混合物中旋转在新鲜的裂解缓冲液中(50mM HEPES,pH 8.5,8M尿素,磷酸酶抑制剂混合物PhosphoSTOP,罗氏,缓冲液与组织的比例为~10:1 v/v)。以15000×克持续5分钟,上清液通过BCA蛋白质分析(Thermo Fisher Scientific)定量。蛋白质浓度在非常短的SDS凝胶上得到确认,然后以滴定的BSA作为标准进行考马斯染色[27].样品在21°C下用Lys-C(Wako,1:100 w/w)消化2h,用50 mM HEPES(pH 8.5)稀释至2 M尿素,然后在21°C下用胰蛋白酶(Promega,1:50 w/w。通过添加1%的三氟乙酸(TFA)将所得肽样品酸化,并在21000×克持续10分钟以去除颗粒。上清液用Sep-Pak C脱盐18滤筒(Waters),用60%乙腈(ACN)加1%甲酸洗脱,并用speedvac干燥,在-80°C下储存。
2.2磷酸肽富集
磷酸肽的富集是通过TiO进行的2珠子(德国劳埃德船级社科学)。将干燥的肽样品溶解在结合缓冲液中(65%ACN,2%TFA,1μg/μl)。千赫2除非另有说明,否则PO4添加至1mM。TiO公司2用洗涤缓冲液(65%ACN,0.1%TFA,200μl/mg珠子)洗涤珠子两次,并与肽溶液以4:1(w/w)的比例混合,除非另有说明。在21°C下结束旋转20分钟后,对样品进行短暂离心,以收集底部的珠子。对于连续浓缩,将上清液(相当于流动)转移到另一等分TiO中培养2珠。孵育后,用洗涤缓冲液(每mg珠200μl)将磷肽结合珠洗涤两次,再悬浮到50μl洗涤缓冲液中并转移到C182毫升离心管顶部的StageTip(Thermo Fisher Scientific)。用另一个50μl洗涤缓冲液收集培养管中的残余珠子,并转移至StageTip。离心StageTip以去除缓冲液,在碱性pH条件下(15%NH)洗脱磷酸肽4OH,40%ACN,至少10μl/mg珠子)。将洗脱液干燥并溶解在5%甲酸中,以进行LC-MS/MS分析。
2.3长梯度LC-MS/MS
将富集的磷酸肽样品加载到C18色谱柱(直径为~1 m×75μm)填充1.9μm树脂(德国Maisch GmbH博士),并在9 h梯度内洗脱(~0.15μl/min;7%~45%;缓冲液a:0.2%甲酸,5%二甲基亚砜;缓冲液B:缓冲液a加65%ACN)。使用蝶形组合加热器(Phoenix S&T)在65°C下加热色谱柱,以减少背压。在Orbitrap Elite MS(Thermo Fisher Scientific)上用一次MS扫描(240000分辨率,1×10)分析洗脱的肽6自动增益控制,最大离子时间100 ms)和前20个低分辨率ms/ms扫描(快速碰撞诱导解离,3000自动增益控制、最大离子时间200 ms,2米/z隔离窗口、35归一化碰撞能量和45 s动态排除)。电荷状态筛选旨在排除单电荷或未分配电荷的前体离子。
串联MS原始文件转换为mz XML格式,并使用Sequest算法(v28,修订版13)对Uniprot人类数据库进行搜索。使用目标恢复策略估计错误发现率(FDR)[28,29]。光谱与前体离子的质量容限为±10ppm,产物离子的质量容限为±0.5Da,部分胰蛋白酶限制和3个最大混合。动态质量转移参数包括氧化Met(+15.9949)、磷酸化Ser/Thr/Tyr(+79.9663)和5个最大修饰位点。仅限b条和年对离子进行了评分。基于XCorr、ΔCn、前体质量误差和电荷状态等众多参数,通过线性判别分析筛选匹配的肽,以将肽错误发现率降低到<0.5%[30]。每个磷酸肽位点分配的置信度由Ascore程序确定[31]。一个明确的站点的最小Ascore为13(第页< 0.05).
基于质谱的蛋白质组学数据已存入蛋白质组改变联盟(http://proteomecentral.proteomexchange.org)通过PRIDE合作伙伴存储库[32]数据集标识符为PXD001180。
3.结果和讨论
许多蛋白质组学平台已经对死后AD脑样本进行了广泛研究[33-38],但对AD磷酸蛋白质组的系统分析鲜有报道[39]。2008年,我们报告了对AD磷酸蛋白质组中466个磷酸化位点的初步分析[40]。随着磷酸肽富集和LC-MS/MS方法的成熟,我们决定重新审视这个项目,并评估目前解剖AD磷酸蛋白质组的技术。
3.1 TiO的优化2利用磷酸盐竞争物富集磷酸肽
由于疾病人体样本的局限性,我们试图从相对较低的总蛋白水平优化磷酸肽富集方法。与磷酸蛋白质组研究中通常报告的~10 mg蛋白质相反,我们使用0.5 mg大鼠脑裂解物作为测试样品,并选择了常用的TiO2方法。在我们对方法中的各种添加剂进行测试期间,我们推断低浓度的游离磷酸盐可能会降低非特异性结合,如在基于键的镍亲和纯化中,建议使用低水平的咪唑(例如5 mM)来减少污染物的结合,而高水平的咪唑啉(例如500 mM)用于洗脱His标记蛋白。事实上,当在不含或含1 mM游离磷酸盐的情况下进行孵育时,LC-MS/MS鉴定的磷酸肽的百分比从68.3±0.1%增加到92.3±1.1%,而磷酸肽的数量也略有增加(). 更重要的是,与一些广泛使用的添加剂相比,如谷氨酸[41]和乳酸[25]在纯度(即磷酸肽的百分比)和效率(即识别的磷酸肽的数量)方面,游离磷酸盐提供了类似甚至更好的结果,).
TiO的优化2使用0.5mg大鼠脑裂解物和各种添加剂富集磷酸肽,以减少非磷酸肽的结合。肽珠比为1:4(w/w)。(A) 未添加和添加三种添加剂(分别为1 mM磷酸盐、饱和谷氨酸和2 M乳酸)的已鉴定磷酸肽的数量和百分比。通过1h LC-MS/MS分析分离的肽。(B)磷酸滴定水平对磷酸肽富集的影响。
由于磷酸盐的使用比高浓度谷氨酸或乳酸更方便、更经济,我们决定优化磷酸盐作为添加剂的使用,并表征了磷酸盐浓度对磷酸肽富集产量的影响。随着磷酸盐水平从0、0.3、1、3增加到10 mM,共纯化非磷酸肽从31.7%减少到8.8%().随着磷酸盐含量的增加,检测到的磷酸肽总数先增加后下降。结果表明,游离磷酸盐和磷酸肽与TiO结合的动态竞争2珠子,这是一个浓度依赖的过程。
由于单位点或多位点磷酸肽对TiO的亲和力不同2珠,我们在磷酸滴定过程中比较了这些肽。正如预期的那样,单磷酸肽鉴定在1 mM磷酸盐时达到一个平台,然后随着更多磷酸盐的添加而降低(). 相比之下,多位点磷酸肽鉴定对高水平的磷酸盐更具抗性,在10mM磷酸盐时略有增加(). 总的来说,1 mM磷酸盐水平代表了敏感性和特异性之间的合理平衡。
磷酸滴定过程中单磷酸和多磷酸的比较。(A-B)已鉴定的单位点和多位点磷酸肽的总数。重复LC-MS/MS实验,并显示标准偏差。(C-D)代表性单位点和多位点磷酸肽的回收,如LC-MS/MS运行期间提取的离子电流所示。
此外,我们通过测量LC-MS/MS中的萃取离子电流,检查了磷酸盐滴定过程中一些代表性磷酸肽的回收率。与鉴定结果一致,单侧磷酸肽随着高磷酸盐含量而急剧减少,多位点磷酸肽表现出更稳定的水平,反映了它们对珠子的强烈亲和力(). 作为肽(AAPALT#PPDR,Thr磷酸化)的一个例子,其在0、0.3、1、3、10 mM磷酸盐中的离子电流分别为6E6、4.5E6、1.5E6、8E5和2E5,表明在1 mM磷酸盐的条件下,大部分肽未被回收。
3.2磷酸肽富集过程中肽珠比的评估
认识到在上述一步富集中磷酸肽的回收有限(肽基比为1:4)[41],我们系统地分析了样品与TiO2之间的关系2三个实验中的珠子。首先,以1:3的肽珠比进行一系列的去除,其中第一次孵育中流出的未结合肽用一份新的小珠重新培养,依此类推(). 在第五次孵育之前,已鉴定的磷酸肽的百分比没有显著变化()这意味着在前四次孵育期间,样品中可能存在足够的磷酸肽,并且可能使用1:12的最大肽珠比。其次,我们以1:3、1:6、1:9和1:12的不同肽珠比进行了富集分析。正如预期的那样,这四个数据集似乎相似,尽管在1:9和1:12的比率下观察到了减少的趋势()这表明与大量珠子的背景结合略有增加。第三,我们使用大鼠大脑、小鼠胸腺和人类AD大脑进行了一系列耗竭实验,以测试不同样本是否含有不同水平的磷酸肽。虽然经过多轮孵育后,三个样品的磷酸肽都减少了,但每个样品的消耗率不同()表明磷酸肽水平在大鼠脑样品中最高,在小鼠胸腺样品中最低。样品之间的差异可能是所选组织固有的,也可能是由于样品制备过程中的去磷酸化以及肽回收和定量的实验变化造成的。因此,理想的肽珠比可以在1:6(例如大鼠大脑)到1:3(例如小鼠胸腺)之间变化,具体取决于样品中磷酸肽的含量。
肽珠比对磷酸肽富集选择性的影响。重复LCMS/MS分析,相对标准偏差平均值<10%。(A) 连续磷酸肽富集示意图(肽珠比1:3)。(B) 0.5 mg大鼠大脑五次孵育中确定的磷酸肽百分比。(C) 应用不同肽珠比时磷酸肽的百分比。(D) 通过五次连续孵育(0.5 mg大鼠大脑、小鼠胸腺和人类AD大脑,肽珠比为1:3)来检测不同样品中磷酸肽的总水平。
3.3 AD磷酸蛋白质组分析
最后,我们使用优化的方案分析了一例AD患者的磷酸蛋白质组(). 为了评估管道的敏感性,我们首先使用三种数量的脑组织蛋白(50μg、250μg和1 mg)进行磷酸肽富集和长梯度LC-MS/MS(9 h)。我们用50μg蛋白质鉴定了1178个独特的磷酸肽,其中465个蛋白质上含有851个磷酸位点。当使用250μg蛋白质时,我们在1007个蛋白质上检测到3327个磷酸肽,由2274个磷酸位点组成。在1毫克蛋白质的情况下,长梯度运行产生了~80000个MS/MS光谱,其中约20%(~16000个光谱)与人类数据库成功匹配,从而鉴定出5243个磷酸肽,包括1455个蛋白质上的3715个磷酸位点(补充表S1).由于已鉴定的磷酸肽几乎与蛋白质水平呈线性增加()我们的数据表明,起始材料的数量是通过长梯度LC-MS/MS系统分析磷酸蛋白质组的限制因素。
人类AD脑的磷酸蛋白质组分析。用优化的TiO溶解、消化和富集人脑组织2方法(1 mM磷酸盐和1:6的肽珠比)。使用了三种不同水平的总蛋白。富集的磷酸肽在加热的反相柱(~1 m×75μm ID)上以长梯度(9 h)进行分解,并通过串联质谱进行分析。
然后,我们通过光谱计数评估已鉴定的磷酸蛋白的丰度,并将前20个蛋白分为功能组,如微管相关蛋白、其他细胞骨架蛋白、突触成分和伴侣蛋白(). 这个最丰富的磷酸蛋白列表与我们之前的分析中只测定了466个磷酸位点非常相似[40]。有趣的是,大量突触蛋白被高度磷酸化,包括syntaxin、MARCS、AKAP12、BASP1、BIN1、CAMK2A和piccolo。最近的全基因组关联研究确定BIN1基因是AD的重要遗传易感性位点[42].未来需要进行定量分析,以确定这些蛋白质的磷酸化状态是否在AD中发生改变。
(A) AD病例中发现的前20种最丰富的磷蛋白。丰度通过分配给单个蛋白质的磷酸肽的光谱计数之和进行估算。(B) τ(441个残基的2N4R亚型)中磷脂酶的定位。之前报告的所有站点均以灰色突出显示,而本研究中确定的站点以粗体和下划线显示。(C) MS/MS扫描与磷酸肽匹配。
例如,我们详细检查了tau的磷酸化(),因为tau是AD中最具特征的磷酸蛋白,其异常的过度磷酸化被认为是导致神经变性和痴呆的原因[8]。Tau由一个人类基因表达,但有六种剪接亚型。最长形式由441个氨基酸组成,包括85个Ser/Thr/Tyr假定磷酸化位点。之前通过免疫检测和/或纯化tau蛋白的质谱分析方法检测到了tau中总共48个磷酸位点[8]。在这个没有tau纯化的直接分析中,我们鉴定了31个磷酸位点,其中30个位点与报告的列表重叠。另一个位点(T386)由三个独立检测的磷酸肽支持:AKT#DHGAEIVYK(); 电话#DHGAEIVYKS#PVVS#GDTSPR;和T#DHGAEIVYKS#PVVSGDTSPR。我们预计,使用增强的分离能力(如二维液相色谱)和高水平的样品(如10 mg蛋白质)进行深入分析将增加AD磷酸蛋白质组的覆盖率,从而揭示本试验研究中遗漏的磷酸位点。
4.结束语
我们在本研究中介绍了TiO的精炼2使用低浓度磷酸盐作为添加剂进行富集,以提高选择性。该协议简单、有效且健壮。它成为我们实验室和蛋白质组学设施的标准协议,并已成功应用于各种生物样品的分析。在AD的磷酸蛋白质组研究中,我们进行了一项初步研究,以证明从尸检脑标本中提取和回收磷酸肽的可行性,从而能够在一次长梯度运行中检测到1 mg总蛋白中的5000多个磷酸肽。定量磷酸蛋白质组分析,包括iTRAQ和TMT的等压标记方法[43,44],将能够比较AD和其他脑样本,以探测与疾病发展相关的磷酸蛋白改变。
致谢
作者感谢所有实验室成员的有益讨论,感谢Steven Gygi博士的数据分析。这项工作得到了NIH拨款R21AG039764、U24NS072026、P30AG19610、亚利桑那州卫生服务部(合同211002)、亚利桑那州生物医学研究委员会(合同4001、0011、05-901和1001)、迈克尔·福克斯基金会和ALSAC(美国-黎巴嫩-叙利亚联合慈善机构)的部分支持。MS分析在St.Jude儿童研究医院蛋白质组学设施进行,部分由NIH癌症中心支持拨款(P30CA021765)支持。
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