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临床癌症研究。作者手稿；PMC 2014年5月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
《临床癌症研究》，2013年11月1日；19（21）：10.1158/1078-0432.CCR-13-0850。
2013年8月5日在线发布。 数字对象标识：10.1158/1078-0432.CCR-13-0850
预防性维修识别码：项目经理3818134
EMSID:EMS54323标准
PMID：23918606

双重阻断PI3K/AKT/mTOR（AZD8055）和RAS/MEK/ERK（AZD 6244）通路协同抑制横纹肌肉瘤细胞生长在体外和体内

简·伦肖，1,2 凯瑟琳·泰勒，1,2 瑞安·毕晓普，1,2 梅兰妮·瓦伦蒂，2 亚历克西斯·德黑文·布兰登，2 沙伦·戈万，2 苏珊娜·埃克勒斯，2 露丝·R·拉德尔，2 路易斯·约翰逊，2 弗洛伦斯·雷诺，2 乔安娜·L·塞尔夫，2,三 Khin Thway公司，2,三，4 托尔斯滕·皮埃奇，5 安德鲁·皮尔逊，1和珍妮特·希普利2,三
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

目的

为使用PI3K和/或MAPK途径抑制剂治疗横纹肌肉瘤（RMS）提供理论依据，RMS是儿童/青少年癌症死亡的主要原因。

实验设计

采用免疫组织化学方法评估RMS临床样本中PI3K/MAPK通路激活的患病率。p110αshRNA介导的缺失后，在RMS细胞系中检测到PI3K/MAPK通路之间的补偿信号和串扰。利用稳定的p110α敲除株中重编程信号的药理学抑制来确定诱导最大生长抑制的靶向抑制谱。这个在体外和体内分别对TORC1/2抑制剂（AZD8055）、MEK抑制剂（AZD6244）和P13K/mTOR抑制剂（NVP-BEZ235）进行单独和成对联合疗效评价。

结果

82.5%的横纹肌肉瘤中PI3K通路激活，36%的肺泡型和胚胎型中MAPK共同激活。短期和长期内，细胞株中p110α的敲除与其他p110亚型的代偿表达、MAPK通路的激活以及重新激活PI3K通路的串扰有关。PI3K通路和MEK抑制剂联合抑制细胞生长在体外用AZD8055和AZD6244处理RD细胞可阻断双向通路的激活，AKT/ERK/S6磷酸化降低就是证明。体内，使用AZD8055/AZD6244组合而非NVP-BEZ235/AZD6245，对生长和药效生物标志物变化的协同效应进行了概述。药代动力学分析提供了药物与这两种组合相互作用的证据。

结论

两种横纹肌肉瘤亚型中的双重PI3K/MAPK通路激活和代偿信号预测，针对任一通路的单一药物缺乏临床疗效，支持将TORC1/2与MEK抑制剂结合的治疗策略。

关键词：横纹肌肉瘤、PI3K途径抑制剂、MAPK途径抑制剂，协同抑制，药效学/药代动力学

介绍

横纹肌肉瘤（RMS）是0-14岁儿童最常见的软组织肉瘤，约占该年龄组所有病例的50%（回顾(1)). 两种主要的组织学亚型，肺泡型（ARMS）和胚胎型（ERMS）具有不同的形态和遗传改变：大多数ARMS含有PAX3-FOXO1或PAX7-FOXO1嵌合转录因子(2)，以及PAX3-氧气1融合转录本与预后不良有关(三). 尽管11p15.5的等位基因不平衡通常被鉴定出来，ERMS通常有更有利的结果，并且没有一致的染色体易位(1，2). RAS信号通路的失调可能与ERMS的发病机制有关(4，5)以及IGF信号转导到所有RMS的发病机制(6). 多药化疗、手术和放疗的使用改善了具有良好特征的RMS患者的预后，尽管代价是毁容和长期后遗症(7). 不幸的是，转移性和复发性RMS肿瘤的预后仍然很差，迫切需要新的、毒性较小的治疗策略。

据报道，RMS细胞系和相当大比例的原发性肿瘤中存在高水平的磷酸化AKT，这表明PI3K/AKT/mTOR通路的组成性激活，提示RMS可能对该通路的靶向抑制敏感(8，9). 然而，以前在其他肿瘤类型中的报告表明，活化的MAPK信号转导介导对PI3K抑制剂的耐药性(10，11). 事实上，美国国家科学院约20%的ERMS患者中发现突变(4)，可以识别那些对PI3K抑制剂不太可能产生反应的肿瘤，正如KRAS突变肺癌所显示的那样(10). 相反，对MEK抑制剂的固有耐药性与结直肠癌和乳腺癌细胞系中的强PI3K信号相关(12，13). 因此，PI3K/AKT/mTOR和RAS/RAF/MEK/ERK途径的双重激活可能导致对单独靶向任一途径的耐药性。令人鼓舞的是，这两种途径的共同抑制在多种异种移植癌模型中显示出降低肿瘤生长的效用(10，13-15)，这种组合的临床试验正在成年人中进行。

在这里，我们通过对PI3K和MAPK通路以及下游S6的磷酸化标记物进行免疫组织化学染色，评估了一系列特征明确的RMS临床样本中PI3K与MAPK通路共同激活的流行率。我们使用shRNA诱导的p110α敲除（KD）来探索RMS细胞系中PI3K/MAPK通路之间的代偿信号和串扰，并进行了全面的临床前研究在体外和体内PI3K和/或MAPK通路靶向治疗的研究。我们提供证据支持最有效的PI3K抑制剂类别，确定可能导致治疗失败的机制，并进行了解决此问题的联合研究。我们的结果预测了PI3K/AKT/mTOR或RAS/RAF/ERK途径单一疗法在RMS中普遍缺乏临床疗效，我们提出了一种双重靶向临床测试策略。

材料和方法

患者RMS组织和免疫组织化学

先前已经描述了79例RMS患者（组织学上为25例肺泡型和54例胚胎型）的福尔马林固定石蜡包埋诊断肿瘤材料的组织芯片（TMA），并批准了该研究（地方研究伦理委员会协议编号1836和2015以及多区域研究伦理委员会/06/4/71）(16). 在抗原提取（0.1M柠檬酸钠，pH 6.0，微波600W，30min）和阻断（5%牛奶，2%正常兔血清，30min的TBS）后，使用抗磷酸-AKT（Ser473）、磷酸-ERK1/2（Thr202/Tyr204）和磷酸-S6（Ser235/236）的抗体对TMA切片（4μm）进行免疫染色，（1:200稀释，细胞信号技术）使用抗生物素-生物素复合物法（DAKO）进行检测，通过二氨基联苯胺四氯化氢（DAB）进行可视化。用苏木精对载玻片进行轻微复染。病理学家将岩芯评分为阴性、弱阳性、中等阳性或强阳性，如果岩芯中至少有10%的细胞染色，则视为阳性。

细胞培养、化合物和胃肠道50估计

来自ARMS的人类肿瘤细胞系RH30、RMS-1、SCMC和RH41以及来自ERMS的RD、RMS-YM和CT10的来源在其他地方进行了描述(16). 所有细胞系均在DMEM（Sigma UK）中生长，补充10%胎牛血清（Biosera，Labtech International Ltd），5%CO2在37°C的空气中。根据制造商的说明，在所述实验的六个月内，通过使用Promega Power Plex 1.2系统分析短串联重复序列来验证细胞系身份。结果与保存细胞系（RH30和RD）或将细胞系交付给我们实验室后立即产生的细胞库中的可用结果相匹配。除NVP-BMK120（Selleckchem）外，所有化合物均购自AxonMed Chem。将化合物溶解在10mM的适当溶剂中，并在组织培养基中稀释至工作浓度。GI公司50使用MTS分析（Promega）在96孔板中测定值（连续暴露72小时后导致50%细胞增殖抑制的浓度）。对于等深线的构建，GI50测定化合物A和B的值以及GI50化合物B在各种固定亚基GI存在下的值50化合物A的浓度。GI50然后在x轴和y轴上绘制化合物A和B的值以及GI50化合物B的值与化合物A的固定浓度。

慢病毒shRNA KDPIK3CA公司，Western印迹和FACS分析

shRNA KD慢病毒颗粒PIK3CA公司慢病毒包装载体pMD2.G（3μG）、pMDLg/RRE（5μG）和pRSV-Rev（2.5μG，Addgene）转染后产生PIK3CA公司如前所述，shRNA载体（10μg，TRCN0000039603，Sigma）或对照shRNA载体(16). 控制（CONSH）或皮克3卡shRNA LV颗粒以10倍的感染率在聚brene（4μg/ml，Sigma-Aldrich）存在下转导到RH30、RMS-1、RD和RMS-YM细胞（每行2×6孔板），并从第2天起用嘌呤霉素（2.5μg/ml）筛选转导细胞。在第2天、第5天和第8天对活细胞进行计数（ViCell系列自动细胞活力分析仪，Beckman Coulter），用70%乙醇固定细胞进行荧光激活细胞分选（FACS）分析，并提取蛋白质进行Western Blotting。

对于Western blotting，定量后（BCA蛋白检测试剂盒（Pierce），使用NuPage Bis-Tris或Tris-Acetate凝胶（Invitrogen）分离10μg每种裂解物，转移到高键PVDF膜上（Amersham Biosciences），并在4°C下用1:1000稀释的一级抗体（细胞信号技术）隔夜进行检测，和1:10000的辣根过氧化物酶二级抗体（Amersham Biosciences）在室温下稀释2小时。使用ECL Plus试剂（Amersham）检测信号，并使用STORM 860 Phosphor Imager和ImageQuant®软件（Amersham Biosciences）进行可视化和分析。

对于FACS分析，旋转固定细胞，将其重新悬浮在800μl PBS、100μl RNase（0.1mg）和100μl PI（碘化丙啶，40μg）中，并在37°C下培养30分钟。将标记的细胞保存在4°C下，直到使用BDFACSDiVa软件和双重判别法在BDLSRII FACS分析仪（BD Franklin Lakes，NJ USA）上进行细胞周期分析。每个样本记录了10000个事件。

药效学（PD）、药代动力学（PK）和异种移植疗效研究

所有动物实验均按照1986年《动物（科学程序）法案》下的英国内政部条例和英国癌症研究协调委员会指南进行(17). RD电池（5×106将25%基质凝胶（BD Biosciences）中的细胞双侧皮下移植（用于最初的PD和PK研究），或一侧皮下移植（对于肿瘤疗效研究）到6-8周大的雌性CrTac:Ncr中-Fox1（努）（Ncr）无胸腺小鼠（查尔斯河）。单独或联合口服AZD6244、（10%二甲基亚砜水中10mg/kg）、AZD8055、（酸化水中10或20mg/kg）和NVP-BEZ235（90%PEG300中10%NMP中25mg/kg）。对照组动物接受同等体积的适当载具。对于初始PK和PD分析，在给药后的不同时间对患有足够大肿瘤的小鼠（n=3）实施安乐死，切除肿瘤，将其平分并快速冷冻，收集血液，离心并将血浆冷冻以备在−80°C下储存。对于肿瘤疗效研究，在肿瘤完全形成时开始给药（平均直径≈5 mm，n=6/治疗组），并持续每天19-22天。定期称重动物，观察其不良反应。通过两个垂直直径测量肿瘤，并使用公式V=4/3π[（d1+d2）/4]计算体积三实验结束后，给小鼠放血，切除肿瘤并称重，并按照上述方法处理样品。

定量PK分析通过液相色谱-串联质谱和多重反应监测进行，使用之前描述的方法的改进((18)和Suppl方法). 根据制造商的说明，使用中尺度发现多点电化学发光免疫分析系统评估肿瘤PD生物标记物，以检测10μg肿瘤裂解液中的磷酸（T/Y:202/204:185/187）ERK/总ERK1/2、磷酸（Ser473）AKT/总AKT和磷酸（240/244）S6/总S6。

结果

PI3K和MAPK通路的双重激活在原发性横纹肌肉瘤中普遍存在

36%（8/22）ARMS和46%（19/41）ERMS样本的p-AKT和p-ERK均呈阳性染色。其中，50%（4/8）ARMS及58%（11/19）ERMS样品的p-S6也呈阳性染色，表明mTOR信号强烈激活。59%（13/22）的ARMS样本，但只有29%（12/41）的ERMS样本对p-AKT呈阳性染色，而对p-ERK无阳性染色，这表明ERMS患者对单一药物PI3K通路抑制反应的可能性可能低于ARMS患者。值得注意的是，93%（27/29）的pERK染色阳性的样本也对pAKT染色阳性，除了没有检测到pERK着色和高水平pAKT的样本外，还可以预测大多数RMS对MAPK途径抑制剂的耐药性。在所有成对分析中，使用趋势的卡方检验评估染色之间的相关性显示出显著的正相关：pAKT和pERK趋势统计：4.0912（p=0.0431），pAKT与pS6趋势统计：8.5413（p=0.0035），pERK和pS6趋向统计：11.1429（p=0.0008）(补充表S1A-C).

皮克3卡KD诱导MAPK和PI3K通路之间广泛的代偿信号和相互串扰

与以前的报告一致，PI3K p110α和β亚型普遍表达（在(19))p110α在一组7个RMS细胞系中的表达水平相似，而p110β的表达更具变异性(补充图S1). 意外的p110δ，主要在白细胞中表达(19)，在四个ARMS中的两个（RH30和RH41）中高水平表达，但这里研究的ERMS系中没有一个。PI3K p110α，（由PIK3CA公司)被认为是主要参与胰岛素、IGF信号传导和多种细胞类型的细胞生长的亚型(19)). 为了评估PI3K p110α对RMS细胞系生长和存活的重要性，用靶向性慢病毒（LV）shRNA颗粒转导了两个ARMS株（RH30和RMS-1）和两个ERMS株（RD和RMS-YM）PIK3CA公司.这些线都没有致癌PIK3CA公司突变。只有ARMS系RMS-1在p110αKD反应中生长受到抑制(图1A). FACS分析证明，生长抑制不涉及细胞周期阻滞(补充图S2)也没有出现凋亡（PARP裂解）或自噬（LC3BII生成）增加(图1B)表明细胞溶解。

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PIK3CA公司shRNA-介导的敲除诱导细胞株特异性代偿信号转导和MAPK和PI3K通路之间的相互串扰

答：。代表性增长曲线如下PIK3CA公司敲除：两个ARMS（RH30和RMS-1）和两个ERMS（RD和RMS-YM）细胞系用对照（CONSH）或PIK3CA公司靶向shRNA(PIK3CA公司KD）或仅用聚乙烯处理（CONUT）。对d2、d5和d8细胞进行计数，对d2和d5细胞进行适当稀释后，放入新鲜平板中，以便计算和绘制d5和d8的累积细胞计数。在d2上引入嘌呤霉素（2.5μg/ml）选择并在整个实验中保持，CONUT和CONSH生长曲线之间的差异反映了病毒转导效率。B。1A类PI3K亚型的西方免疫印迹，证实在8天内PIK3CA公司shRNA转导的细胞系，以及凋亡标记（PARP裂解）和自噬标记（LCBI/II表达）。在d5上看到的PARP切割反映了嘌呤霉素在d2-d5之间的选择。C、。PI3K通路生物标记物的西方免疫印迹显示上述细胞中PTEN、pAKT、pS6、IRS2、pERK和pAMPK的细胞系特异性破坏。*RMS-1细胞中的pS6水平低于PhosphorImager检测水平。因此，在X射线胶片曝光10分钟后收集此图像。D。pERK和总ERK免疫印迹的定量显示C、。使用ImageQuant软件，表示为pERK:总ERK的比率。每个条上的数字：在每个细胞系中，CONUT细胞中pERK:总ERK的比率设置为1.0，并计算每个样品的相对倍数变化。

p110α的KD诱导四种细胞系p110β表达不同程度的代偿上调(图1B)p110δ表达受影响最小。下游，p110αKD后AKT磷酸化没有持续受到抑制(图1C). 值得注意的是，增加了pThr 308号机组Akt高于控制水平，（未反映为p的等效增加Ser473系列在RH30细胞LV转导后第5天出现Akt），Akt磷酸化的总抑制延迟至第8天。相比之下，两者都是pThr 308号机组Akt和pSer473系列到第5天，RMS-1、RD和RMS-YM细胞的Akt降低到对照水平以下，到第8天，ERMS细胞的Akt恢复到对照水平。此外，PTEN表达在RH30细胞中下调，但在其余三种细胞系中增加（定量显示为补充图S3). 下游S6磷酸化的抑制反映了除RH30以外的所有细胞系中AKT磷酸化的抑制剂，其中S6和AKT磷酸的抑制似乎断开。后者可能仅通过三种AKT亚型中的一种将p110α信号传递给mTOR，导致S6磷酸化降低，尽管明显缺乏对AKT总磷酸化的抑制。

IRS2的经典缓解（但不是IRS1，数据未显示），mTOR信号抑制的反馈抑制(20)在三个细胞系（RH30除外）中观察到，以及PI3K/AKT/mTOR和RAS/RAF/ERK通路之间相互串扰的证据。在LV转导后第5天，在三个p110αKD耐药细胞系中观察到pERK1/2不同程度的上调，但在敏感的RMS-1细胞中直到第8天才观察到。AMPK瞬时激活伴随pERK上调的证据(21)在三种细胞系中观察到（除RD外，其中pAMPK水平降低）。pERK1/2和总ERK1/2蛋白印迹的定量证实了ERMS中ERK信号的基础激活水平高于ARMS株，并且ERK磷酸化在ERMS诱导后受到刺激PIK3CA公司杜兰特(图1D).

重组信号通路的药理学抑制PIK3CA公司KD稳定细胞系为RMS中PI3K/MAPK通路的双重阻断奠定了基础

确定减少的长期影响PIK3CA公司PI3K和MAPK信号转导的表达、稳定的p110αKD和对照（CONSH）细胞系均来自于病毒转导的细胞系，持续时间约为4周。然后使用衍生的细胞系来筛选具有针对1类p110亚型和/或mTOR的各种抑制谱的PI3K途径抑制剂。

两个ERMS稳定的KD株系都显示p110δ表达增加，这是一个新的观察结果，与生长因子信号下游的p110δ一致(19)p110α和δ亚型之间的功能冗余(22). 对pan-PI3K抑制剂BMK120的敏感性无差异（与其他亚型相比，p110α具有适度选择性(补充图S4A))在稳定的p110αKD系及其CONSH对应物中观察到(补充图S4B). 此外，只有p110α和δ表达最低的RMS-1稳定KD细胞系对p110β抑制剂TGX221的敏感性增加（p110β对p110α的选择性为78倍，p110δ的选择性较小，补充图S4A和C). 综上所述，这些数据表明，必须抑制所有表达的亚型，才能最大限度地抑制细胞生长。

评估稳定KD系中PI3K/AKT/mTOR和RAS/RAF/ERK通路的选定元件(图2A)显示p增加Thr308型AKT但不是pSer473系列四个稳定KD株系中的三个株系（RMS-YM除外）的AKT水平，同时伴有RD稳定KD系PTEN表达的改变。p水平增加Thr308型AKT与下游AKT底物GSK3β的磷酸化增加相关，但对pS6水平没有持续影响(补充图S4D). IRS2在RMS-1、RD和RMS-YM稳定的KD细胞系中表达上调，表明通过IGF1R增加的信号可能有助于pThr308型某些细胞系中的AKT。在所有稳定的KD系中观察到上调的MAPK信号传导，如pERK水平增加所证明的，导致串扰，从而显著增加pAMPK水平，并且在ERMS KD系中，增加了自噬的基础速率（LCB3II产生）。后一数据与这些细胞系中mTOR信号方面的破坏一致。NVP-BEZ235治疗，主要抑制浓度低于100nM的mTOR(23)和AZD8055，一种特异性TORC1/2抑制剂，证明了具有解除调控IRS2表达的p110α稳定KD细胞系比其CONSH对应物对mTOR抑制更敏感(图2B和C). 此外，稳定的KD系对ZSTK474（一种对p110δ具有选择性的泛PI3K抑制剂）的敏感性增加，对mTor（IC）的活性适中500.377μM(24))(补充图S4A和E). 尽管所有稳定的KD株系都表达pERK水平增加，但只有RMS-1 KD株（缺乏p110α和p110δ）对MEK抑制剂AZD6244的敏感性显著增强(图2D). 这表明p110α和/或p110δ可以通过PI3K/AKT/mTOR支持MAPK通路抑制的代偿信号，而p110β则不能。

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PI3K和MAPK信号通路的重新编程在IRS2表达解除的稳定p110αKD细胞中诱导对mTOR抑制的敏感性增加，但仅在p110α和δ表达降低的RMS-1 KD细胞对MEK抑制的敏感性升高

答：。1A类PI3K亚型的Western Immunoblot证实稳定KD系（PI3K-KD）中的p110αKD以及ERMS KD稳定系中p110δ表达的上调（与CONSH对应物相比）。此外，还显示了稳定的p110αKD细胞系中PI3K和MAPK通路的选定元件，这些元件显示了细胞系特异性上调pThr308型AKT（但不是pSer473系列AKT）和IRS2，上调所有KD株系中的pERK和pAMPK水平，增加自噬（LCBI/II），尤其是ERMS KD株。B。和C、。在分别用NVP-BEZ235和AZD8055处理成对的CONSH和KD株系后，具有代表性的生长抑制曲线（MTS分析）表明，在IRS2表达解除的KD株中，对mTOR抑制的敏感性增加。D。AZD6244处理后的代表性生长抑制曲线显示，仅在缺乏p110α和δ的RMS-1细胞中对MEK抑制的敏感性增加。

总的来说，这些数据表明，不仅应该抑制pan-PI3K（或AKT）和mTOR活性以实现对PI3K/AKT/mTOR通路的最大抑制，而且还需要同时抑制RAS/RAF/ERK通路以防止代偿性串扰，从而最大限度地发挥抗增殖作用。

PI3K/AKT/mTOR和RAS/RAF/ERK信号的双重阻断在RMS细胞系中是协同作用的

为了确定PI3K和MAPK通路的双重阻断是否能提高RMS细胞的疗效，联合GI50利用亲本ARMS和ERMS细胞系以及组合AZD8055/AZD6244、ZSTK474/AZD5244和NVP-BEZ235/AZD6245构建等位基因图。AZD8055/AZD6244组合在RH30、RD和RMS-YM细胞系中具有协同作用，但在RMS-1细胞系（对单一药物PI3K通路抑制最敏感的细胞系）中更接近加性作用(图3A). ERMS细胞系用于确认与组合ZSTK474/AZD6244和NVP-BEZ235/AZD6245的协同作用(图3B和C).

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PI3K和MAPK通路的双重阻断在RMS细胞系中是协同作用的在体外

A.、B.和C。分别使用组合AZD8055/AZD6244、ZSTK474/AZD5244和NVP-BEZ235/AZD6241的组合等深线图。GI公司50化合物A和B的值沿着GI绘制在X轴和y轴上50在各种固定浓度的化合物A存在下获得的化合物B的值。GI之间的对角线50这两种化合物在y轴和x轴上的值是可加性的理论线。所有GI50此行左侧的值表示协同作用。D。pERK1/2，p水平Ser473系列AKT和p序列240/244AZD8055、AZD6244和AZD8025/AZD5244联合0.5×和1.0×GI处理后RD细胞中的S650浓度。在处理后的指定时间点提取对照细胞和药物处理细胞的蛋白质。将每个时间点的对照和处理样品并排装入西方免疫印迹，并使用ImageQuant软件进行定量。每个时间点的药物处理/对照磷酸化生物标记物水平表示为时间0时水平的%。注意：。当细胞达到汇合点时，对照样品中的pERK水平在48小时时一直低于可量化水平。

具有美国国家科学院突变(5)并对AZD8055和AZD6244均具有相对抗性，研究单药和联合用药对PI3K/mTOR通路生物标志物的影响（pSer473系列AKT和pS6）和MAPK途径（pERK）活性超过48小时。为了更容易评估联合治疗后对通路生物标记物的任何协同效应，用0.5×和1.0×GI处理细胞50浓度。AZD8055增加pERK水平，AZD6244增加pSer473系列16小时治疗后的AKT水平，证实了PI3K和MAPK通路在分别抑制每条通路后的相互代偿性串扰(图3D). AZD8055处理后S6的抑制程度（而非AKT磷酸化）呈浓度依赖性，表明在低浓度下，通过激活MAPK通路的串扰，TORC1比TORC2更有效地受到抑制。AZD6244治疗在所有时间点消融pERK水平，两种浓度以及AKT和S6磷酸化的激活/抑制曲线在两种浓度下均相似。这些数据表明AZD6244后的生长抑制与MEK抑制无关（IC5014nM MEK1/2的浓度(25))，可能是由于偏离目标的影响。

AZD6244与AZD8055联合使用，pERK水平降低的程度与单独使用AZD5244相同，而pS6水平降低的时间比单独使用任何一种治疗都更早、程度更大、持续时间更长(图3D). AKT磷酸化降低的程度与单独使用AZD8055治疗相同，但在以后的时间点没有恢复到控制水平。这些数据表明，mTOR活性的显著和长期抑制对于最大限度地发挥抗肿瘤活性至关重要，而ERK和AKT信号的联合抑制是实现这一点的必要条件。

PI3K和MAPK通路的生物标志物发生了等效变化体内单独或联合使用AZD8055（10mg/kg p.o.）和AZD6244（10mg/kg p.o.）治疗携带RD异种移植物的小鼠6小时后(补充图S5A). 然而，所有三种生物标志物的水平在治疗后16小时恢复到控制水平或以上，并与两种药物的血浆清除率相关，接近或低于此时的检测限(补充图S5B). 本次及后续PK分析(补充图S6)联合用药显示两种药物之间存在相互作用。当与AZD8055联合给药时，AZD6244的峰值血浆浓度降低，消除期延长，而当与AZD6244联合给药时，AZD8055的血浆和肿瘤水平更高。重复给药后，这些变化更加明显。使用药物相互作用分析消除了P450酶在代谢水平上相互作用的可能性(补充方法，数据未显示）。

AZD8055（而非NVP-BEZ235）与AZD6244联合治疗RD异种移植瘤后显著增强抗肿瘤疗效

一项初步的剂量发现治疗研究确定了AZD8055（20mg/kg p.o.）和AZD6244（10mg/kg p.o）的每日一次治疗计划，以及联合用药时的耐受性和活性(补充图S7A-D). 先前的研究表明，NVP-BEZ235对Her2过度表达的乳腺癌细胞的治疗导致ERK信号的代偿激活，NVP-BEZ235（25mg/kg）和AZD6244（8mg/kg）的联合作用是协同作用的体内(26). NVP-BEZ235是一种双PI3K/mTORC1/2抑制剂，其浓度可能达到500nM以上体内(23)与特异性TORC1/2抑制剂AZD8055相比，具有更有效地抑制MEK抑制中pAKT水平代偿性增加的潜力。因此，在一项面对面的治疗研究中对这两种组合进行了比较。

当单独给药时，NVP-BEZ235比AZD8055更大程度地抑制肿瘤生长。然而，只有当AZD6244与AZD8055结合使用时，才显示出协同作用，而当与NVP-BEZ235结合使用时则不显示协同作用(图4A和B). 所有三种药物的PK分析表明，当联合用药时，NVP-BEZ235降低AZD6244的血浆浓度的程度与AZD8055相似(图4C). 单独给药时，AZD8055和NVP-BEZ235的血浆浓度在同一范围内，与AZD6244合用时，两种药物的浓度范围均增加(图4C).

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AZD8055（而非NVP-BEZ235）与AZD6244联合治疗RD异种移植物后，显著增强了抗肿瘤疗效

答：。和B。分别用AZD6244和AZD8055或NVP-BEZ235单独和联合治疗指定剂量的RD异种移植物的头对头治疗研究。肿瘤体积表示为第0天每个肿瘤的体积百分比。最终肿瘤重量（g）显示，与单独的AZD6244（**p=0.015）或单独的AZD8055（*p=0.038）相比，AZD8055/AZD6244组合的疗效显著增加，并且与单独的AZD6244（p=0.13）或单独的BEZ235（p=0.82）相比，NVP-BEZ235/AZD6244组合的疗效没有显著差异（Mann-Whitney t检验）。C、。AZD6244单独或与AZD8055或NVP-BEZ235联合治疗的小鼠的最终剂量后3小时的血浆AZD5244浓度，以及上述相同小鼠的血浆AZD8055和NVP-BEZ235浓度。D。肿瘤PD生物标记物pERK:磷酸（T/Y:202/204:185/187）ERK/总ERK1/2，pAKT:磷酸（Ser473）AKT/总AKT和pS6:磷酸（240/244）S6/总S6，由MSD免疫分析测定。

PD生物标志物、pERK、pAKT的评估Ser473系列在治疗的肿瘤中，pS6证实了AZD8055或NVP-BEZ235抑制PI3K通路或AZD6244抑制MAPK通路的相互代偿信号体内治疗环境(图4D). 单独而言，AZD8055和NVP-BEZ235在降低AKT和S6磷酸化方面同样有效，尽管AZD80 55比NVP-BEZ235更能提高pERK水平。然而，虽然AZD8055/AZD6244组合治疗将所有三个生物标志物降低到30%以下的对照水平，但NVP-BEZ235/AZD6241组合未能将pAKT降低到对照水平以下，S6磷酸化的抑制也相应降低。因此，NVP-BEZ235对PI3K和TORC2的抑制效力不足以阻止MEK抑制在该肿瘤类型中诱导的AKT磷酸化的代偿性上调体内因此，建议将AZD8055/AZD6244组合用于临床。

讨论

以前的报告表明，PI3K/AKT/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK途径的双重激活可能导致对单独靶向任一途径的先天性抵抗(10-13). 虽然RMS中分别记录了这两种途径的激活(4，5，8，9)，尚未评估双重激活状态。通过对TMA的免疫组织化学分析，我们发现43%的原发性RMS样本存在双重激活，其中55%的样本显示mTOR信号强烈激活。在没有pERK染色的情况下，ARMS样本中pAKT阳性的比例高于ERMS样本（分别为59%和29%）。因此，虽然理论上，一些ARMS患者可能受益于PI3K通路的靶向抑制，但ERMS患者的情况不太可能如此。重要的是，我们为RMS中PI3K通路抑制后MAPK通路的代偿性上调提供了证据，正如在其他肿瘤类型中所显示的那样(15). 这有可能绕过PI3K途径抑制剂的抗增殖作用，导致治疗失败。

PI3K小分子抑制剂主要靶向1类PI3K，即p110α、β、δ和γ，其中只有p110α在癌症中发生突变(19). PI3K p110α也是主要参与IGF1R信号传导的亚型，（通常在RMS中激活(6))和细胞生长。使用LV shRNA颗粒靶向皮克3卡我们证明，在PI3K p110αKD作用下，四种RMS细胞系中只有一种细胞生长受到抑制，这表明p110α特异性抑制剂在RMS临床中没有普遍用途。对RMS细胞系中基本的1类PI3K亚型表达谱的检测显示，p110α的表达均匀，p110β的表达变化更大，p110γ的表达没有检测到。出乎意料的是，之前未报告的p110δ的表达，通常仅限于造血来源的细胞，也在四个ARMS系中的两个中发现。与此相一致，挖掘RMS原发肿瘤样本的基因表达谱数据(三)显示出较高水平的PI3KCD公司mRNA与骨骼肌的比较（数据未显示）。据报道，p110δ在乳腺癌和神经母细胞瘤细胞中也有高水平表达(27，28). 然而，在RMS细胞系中，无论是p110δ的表达还是总的亚型表达谱都与对p110αKD的敏感性/耐药性无关。

短期和长期替代信号通路的补偿性上调和重编程为靶向抑制剂的先天性和后天性耐药机制提供了线索。在这里，我们已经表明，细胞系特异性、广泛的补偿和适应性信号传导发生在PIK3CA公司KD，即使没有任何显性表型效应。在稳定的p110αKD细胞系中，使用各种PI3K途径抑制剂和MEK抑制剂来抑制这些旁路机制，我们确定了必须抑制PI3K和MAPK途径的哪些元素才能达到最大的抗增殖效果。

短期内，p110αKD诱导p110β的代偿性上调，尽管这在p110αKD稳定系中没有维持。然而，在ERMS稳定的KD系中发现p110δ显著上调，这既突出了PI3K亚型表达的可塑性，也支持功能冗余，尤其是p110α和δ亚型之间的功能冗余。与CONSH对应物相比，稳定的p110αKD系对pan-PI3K抑制剂BMK120的敏感性没有差异，只有p110α和δ表达最低的RMS-1 KD系表现出对选择性p110β抑制剂TGX221的敏感性增加。这些数据表明，pan-PI3K抑制剂应该对所有1A类亚型具有强大的活性，以确保RMS中最大限度的生长抑制。

尽管在所有四种细胞系中S6磷酸化早期受到抑制，但p110αKD后AKT磷酸化并没有持续受到抑制。值得注意的是，我们证明p增加Thr308型AKT、pAKT的延迟总抑制和磷酸酶PTEN的下调PIK3CA公司KD，一个新的观察结果。相比之下，其他3个品系的AKT磷酸化早期受到抑制，PTEN表达上调。PTEN的转录调控以前在各种环境中都有显示，但其功能作用和机制尚不清楚。例如，在TSC2缺失或失活的细胞中，有报道称PTEN表达减少对mTOR的抑制(29)同时PTEN上调以响应c-6月-NH公司2末端激酶（JNK）(30)，以及活化的NFκB信号传导对PTEN表达的抑制(31)也有报道。

pERK水平的补偿性上调PIK3CA公司在抗p100αKD作用的三种细胞系中，在第5天观察到KD，但在敏感的RMS-1细胞中，KD延迟出现。然而，在所有四个稳定的KD系中，ERK磷酸化水平都有所增加。缺乏ERK信号的早期刺激，加上基础mTOR活性极低，可能是RMS-1细胞对皮克3卡KD，而随后ERK信号的上调可能有助于其最终恢复和存活。尽管先前的报告表明活化的MAPK信号传导介导对PI3K抑制剂的耐药性，但这些研究表明，不一定是MAPK活性的基本速率决定了对PI3K途径抑制剂的耐药性的程度，而是代偿性串扰的程度和动力学。因此，虽然所有四个都稳定PIK3CA公司KD株表现出较高水平的pERK，与CONSH株相比，KD株对任何PI3K途径抑制剂都没有更高的抵抗力。同样，增加MAPK信号的激活并没有改变四个稳定KD系中三个对MEK抑制的敏感性。只有表达110β但不表达p110α或δ的RMS-1 KD株对MEK抑制剂AZD6244表现出更高的敏感性。这表明p110β不支持MEK抑制后PI3K通路的代偿激活，而p110α和δ支持。

已证明激活的ERK信号通过TSC2和猛禽的磷酸化激活mTOR(32)以及激活AMPK，从而增加Rb磷酸化并刺激细胞生长(21). 此外，活化的AMPK作为一种生存因子，通过增加葡萄糖摄取和通过改变中间代谢转变为无氧呼吸来保护细胞免受缺氧和营养剥夺（Warburg效应），通常伴随着通过抑制mTOR信号抑制蛋白质合成和细胞生长（在(33))AMPK的激活、IRS2表达的解除以及自噬基础速率的增加（后者在ERMS系中突出）表明，稳定的p110αKD系中mTOR信号部分受损。重要的是，这些细胞对TORC1/TORC2抑制剂更敏感，这表明mTOR是整合PI3K和MAPK通路之间串扰的中心节点，也是最大限度抑制PI3K通路的重要靶元件。

PI3K和MAPK通路的双重阻断被证明是协同作用的在体外并被证明是由于在分别抑制每条通路之后，交替通路的代偿激活受到相互抑制。正如预测的那样美国国家科学院突变RD肿瘤异种移植物体内与TORC1/TORC2抑制剂AZD8055或MEK抑制剂AZD 6244合用，没有任何疗效，而双重PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235更为有效。然而，结合使用AZD8055/AZD6244后，肿瘤生长受到显著抑制，而NVP-BEZ235/AZD6242与单独使用NVP-BEZ235相比没有额外的益处。这是由于NVP-BEZ235不能抑制MEK抑制诱导的AKT代偿激活。因此，有效活性的生物标志物是pAKT、pS6和pERK的同时降低。

利用从第一阶段临床试验收集的数据，最近的一项研究评估了双重靶向PI3K和MAPK信号通路与单独靶向任一通路的临床结果(34). 结果表明，在许多肿瘤类型中疗效提高，但代价是增加了毒性。而体内这里使用的联合剂量耐受性良好，PK分析显示两类化合物之间的相互作用导致AZD6244的血浆和肿瘤水平降低，但PI3K途径抑制剂水平升高，重复给药后这两种作用更加明显。然而，AZD6244的浓度达到体内仍超过MEK抑制所需的水平。进一步进行PK/PD驱动的临床前研究，以确定抑制甲乙酮所需的最低AZD6244剂量，然后增加AZD8055以达到治疗效果，这将有助于为早期临床试验提供信息。此外，需要在重复给药后仔细监测两种药物的血浆PK，以评估患者体内药物相互作用的程度。

总之，在本文提出的临床前原理验证RMS异种移植物研究中，AZD8055和AZD6244的组合比NVP-BEZ235/AZD6244的组合显示出显著增加的治疗益处。我们表明，ERK、S6和AKT三种磷酸化生物标志物必须减少才能发挥协同作用。这些研究证实，PI3K和MAPK通路的双重抑制为治疗诸如RMS等肿瘤类型提供了一条新的途径，这些肿瘤类型预计对单独阻断这两条通路具有抵抗力。即使在天生敏感的肿瘤中，在PI3K抑制剂的基础上添加MEK抑制剂可能会阻止耐药性的出现。

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翻译相关性

支持PI3K/AKT/mTOR和RAS/RAF/MAPK途径抑制剂治疗应用的分子基础至关重要。在这里，我们显示43%的原发性横纹肌肉瘤中这些通路共同激活，其余大部分显示PI3K通路激活，而不是MAPK通路。前者预测对单途径靶向药物的耐药性，后者预测对PI3K途径抑制剂的潜在敏感性。然而，我们也证明了PI3K/MAPK途径之间广泛的代偿信号和相互作用，这两种途径都单独抑制了其中一种途径在体外和体内因此，同时抑制这两条通路对横纹肌肉瘤的有效治疗至关重要。这个体内联合使用AZD8055/AZD6244而非NVP-BEZ235/AZD6242实现的协同抗肿瘤反应反映在药效学生物标记物pERK/pS6/p的减少服务器473AKT公司。初步药代动力学分析显示，研究的PI3K/MAPK抑制剂之间的药物相互作用表明，在未来的有希望的AZD8055/AZD6244组合临床试验中，需要在重复给药后进行药代动力学研究。

补充材料

1

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2

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三

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致谢

作者感谢克里斯·琼斯、苏珊娜·加茨、保罗·克拉克和保罗·沃克曼对手稿的审阅和有益的评论。我们非常感谢儿童癌症和白血病小组在肿瘤收集和注释方面的帮助。

拨款支持：这项工作得到了NHS对NIHR生物医学研究中心、皇家马斯登医院慈善基金、英国癌症研究中心（赠款参考号C309/A11566和C5066/A10399）和克里斯·卢卡斯信托基金的资助。

基金：JR：NHS对NIHR生物医学研究中心的资助，KRT，RB：皇家马斯登医院慈善基金，MV，ADHB，SG，SAE，RRR，LDJ，FIR：英国癌症研究（赠款编号C309/A11566）JLS：克里斯·卢卡斯信托，ADP：CRUK和JS:CRUK（赠款编号C5066/A10399）。

脚注

潜在利益冲突的披露：JR、MV、ADHB、SG、SAE、RRR、LDJ、FIR、JLS、ADP和JS是癌症研究所的现任员工，该研究所对PI3K途径抑制剂的开发具有商业利益，并实施发明人奖励计划。

工具书类

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