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癌症发现。作者手稿；PMC 2015年6月10日提供。
以最终编辑形式发布为：
癌症发现。2014年2月；4(2): 216–231.
2014年1月23日在线发布。 doi（操作界面）：10.1158/2159-8290.CD-13-0639
预防性维修识别码：项目经理4462130
尼姆斯：美国国立卫生研究院548679
PMID：24436047

横纹肌肉瘤的综合基因组分析揭示了影响融合阳性和融合阴性肿瘤共同遗传轴的改变

杰克·谢恩,1,* 李晨,1,* 朱利安·奇米列基,2,三 Jun S.Wei（魏军）,1 拉杰什·帕蒂达尔,1 玛拉·罗森博格,2 劳伦·安布罗基奥,2 丹尼尔·奥克莱,2 王建军,1 年轻的K.Song,1 凯瑟琳·托尔曼,1 劳拉·赫德,1 廖红玲,1 张士乐,1 多米尼克·博根,1 安德鲁·S·布罗尔,1 西瓦西什·辛迪里,1 丹尼尔·卡奇普尔,4 托马斯·巴格特,1 加德·盖兹,2 杰姆·莫拉,5 詹姆斯·安德森,6 斯蒂芬·X·斯卡佩克,7 弗雷德里克·巴尔,8 马修·梅尔森,2,三，9 道格拉斯·霍金斯,10和官员扎维德1,#
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关联数据

补充资料

摘要

尽管生存率有所提高，但转移性或复发性横纹肌肉瘤（RMS）患者的预后仍不容乐观。在国家癌症研究所、儿童肿瘤学小组和布罗德研究所的合作下，我们进行了全基因组、全基因组和转录组测序，以表征147对肿瘤/正常人的体细胞改变。RMS肿瘤有两种基因型；那些以PAX3或PAX7融合为特征的基因，以及那些缺乏这些融合但在关键信号通路中存在突变的基因。RMS体细胞突变的总体负担相对较低，尤其是在含有PAX3/7基因融合的肿瘤中。除了先前报道的突变外NRAS、KRAS、HRAS、FGFR4、PIK3CA、CTNNB1，我们在FBXW7型、和BCOR公司为治疗干预提供潜在的新途径。此外，受体酪氨酸激酶的改变/RAS/PIK3CAaxis影响了93%的病例，为基因组定向治疗提供了框架，可能会改善RMS患者的预后。

关键词：横纹肌肉瘤，全基因组测序，全外显子组测序，RNAseq

介绍

横纹肌肉瘤（RMS）是一种肌源性肿瘤，是儿童最常见的软组织肉瘤(1). 随着多模式化疗方案的发展，局部疾病患者的无复发生存率提高到70-80%，尽管有显著的毒性(2). 不幸的是，尽管进行了积极的治疗，转移性疾病患者的5年生存率仍然只有30%(三). 目前，RMS肿瘤按组织学分为两大亚型：肺泡型（ARMS）和胚胎型（ERMS），这两种肿瘤具有不同的分子和临床特征。ARMS预后不良，往往发生于青少年。从遗传学角度来看，ARMS在大多数情况下是由PAX3系列或PAX7和FOXO1系列基因（综述于(4)). ERMS亚型通常影响较年幼的儿童，并预示着局部预后良好。先前的报道已经确定了ERMS中的广泛遗传畸变，包括11p15.5的杂合性缺失(5)以及基因突变TP53型(6),NRAS、KRAS、HRAS(7),PIK3CA公司,CTNNB1公司(8)和FGFR4型(9).

尽管人们对这些肿瘤的分子机制有了越来越多的了解，但很少有新的药物能够通过早期临床试验，生存率的提高主要是通过优化细胞毒化疗方案实现的(10). 进一步描述这种肿瘤类型的遗传事件对于制定更有效的诊断、预后和治疗策略至关重要。在这里，我们报告了国家癌症研究所、儿童肿瘤研究小组和博德研究所之间的合作，使用全基因组、全基因组和全转录组测序以及高分辨率SNP阵列的组合来表征147个肿瘤/正常对中的体细胞变化。我们的发现描述了RMS中发生的遗传事件，并为今后针对该肿瘤类型的靶向分子治疗研究提供了一幅地图。

结果

用全基因组配对测序（WGS）对一组44例具有匹配正常白细胞DNA的RMS肿瘤进行测序，作为发现集。WGS平均每个样本产生294千兆字节（Gb）的序列，平均深度为105X。这种覆盖深度使得高质量通话覆盖了97%的基因组(补充表S1). 为了扩展和验证我们的发现，我们还对103个额外的肿瘤及其匹配的种系（共147个肿瘤，临床数据汇总于补充表S2). 通过全转录组测序（WTS）分析了80例肿瘤，使我们能够评估与观察到的基因组改变相关的表达变化。

RMS肿瘤中PAX基因重排

正如预期的那样，在整个队列中发现的明确的基因组改变是反复出现的t（2；13）或t（1；13），这导致了PAX3系列或PAX7到的C终点FOXO1系列(11,12)（35人PAX3-氧气1和15PAX7-FOXO1系列) (图1a和图1b). 当有足够的RNA可用时，通过逆转录聚合酶链（RT-PCR）反应证实在WGS或WTS中发现的融合。除了这些典型的融合外，三种肿瘤在组织学上被归类为ARMS，但没有典型的PAX3/7-FOXO1系列通过RT-PCR融合，发现有替代方法圣像牌通过WGS或转录组测序检测到的融合。RMS235和RMS2031案件包含PAX3-NCOA1型融合是由先前描述的具有类似致癌特性的基因内重排引起的PAX3-氧气1(13). 我们还发现了一部小说圣像牌RMS2046中2q染色体大规模重排区域的融合(图1c和​和2a）。2a个). 这种重排导致PAX3的N末端（前七个外显子）和INO80D的C末端融合，INO80D是ATP依赖性染色质重塑复合物的一个亚单位。RMS2046的RNA测序显示新融合转录物的框内表达(图2b). 使用全转录组测序数据进行的无监督聚类显示，PAX基因重排的肿瘤与未重排的癌症之间有明显的区别。值得注意的是，具有选择性PAX基因融合的肿瘤与其他携带经典PAX基因的ARMS紧密聚集第3页/7-第1页融合表达谱(图2c). 除了三个携带新的PAX基因重排的肿瘤外，在这一组中，还有七个融合阴性的肺泡组织学肿瘤没有PAX基因改变，但体细胞突变和表达谱与胚胎性肿瘤更一致(图2d和补充图S1A-D).

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RMS的Circos图代表肿瘤。圆圈图轨迹表示来自外圆的经验证的体细胞突变；突变基因错义突变（黑色）、无义突变和indel突变（红色）；基因组位置、全基因组拷贝数变化（灰色）、较小等位基因频率（绿色）LOH（点迹）、杂合SNP（橙色）纯合SNP密度（蓝色）。染色体内重排（内圈灰色）和染色体间重排（内圈红色）。一，NCI-40：PAX7-FOXO1易位，注意到相关的高水平拷贝数增加。该肿瘤在第2染色体上也有高水平的MYCN拷贝数增加。b条，RMS224：再现PAX3-氧气1融合无体细胞点突变。注意Chr11p短臂上的LOH。c（c），RMS2046：第2染色体上的多重重排，具有相应的连接和拷贝数变化。这种重排产生了一种新的基因融合PAX3-编号80D.d日，RMS216：再现PFN RMS。注意点突变的相对增加，包括美国国家科学院Chr1突变和非整倍体增加，包括Chr8的增加。Chr10和Chr11短臂的杂合性完全丧失e（电子），RMS2030:肿瘤中的多基因组范围的改变TP53型突变。的点突变FGFR4公司在第5号染色体上。

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RMS2046中2号染色体的重排产生PAX3-编号80D融合。一、WGS接头。紫色线表示尾部对头部连接，绿色线表示头部对尾部连接（可能是串联复制），橙色线表示尾部到尾部连接或头部对头部连接（倒置）。LogR比率和VAF（可变等位基因频率）显示了具有多个断点的两种不同拷贝数模式。b条，RNA测序发现22个高质量读数跨越PAX3系列和INO80D公司基因。融合连接第7外显子PAX3系列第9外显子INO80D公司预测的融合蛋白维持PAX3蛋白的配对盒结构域（白色标记的PAX）和同源盒DNA结合结构域（白色标记的HBD）。INO80D的两个预测的N末端DNA结合域在融合中丢失。c（c），转录组表达数据的无监督聚类表明融合阳性（红色）和融合阴性（蓝色）肿瘤之间有明确的定义，包括与NCOA1号机组和INO80D公司强调了“融合阴性”肺泡组织学肿瘤。RMS 2080是一种融合阴性胚胎性肿瘤，似乎与融合阳性肿瘤聚集在一起，但通过RT-PCR或转录组测序未发现PAX基因的重排d日，通过转录组测序评估的肿瘤组织学诊断显示10个肺泡组织学为“融合阴性”的肿瘤。

RMS中复发性染色体结构重排

除了重新安排PAX3/PAX7基因，WGS鉴定出553个影响44个RMS肿瘤基因组中419个基因的体细胞结构变异（SV）(补充表S3). 当拷贝数发生变化时，高分辨率SNP阵列证实了90%的高置信SV（参见方法）。48个基因反复受到SV的影响，包括之前与RMS病理相关的基因(MIR17HG、CNR1、CDKN2A) (14-16)，酪氨酸激酶信号(ERBB4、RPTOR、FRS2、CACNA1A)和肌肉发育(NRG1、FOXP2) (补充表S4). 通常（341/553，61%），连接事件发生在复杂重排或串联重复的区域，最常与高拷贝数扩增区域相关。据预测，10%的连接会导致缺失。当两个基因之间的DNA水平发生连接事件时，19%（55/296）的时间在RNA水平产生融合转录物。在这些事件中，PAX基因的融合占融合转录本的三分之一，没有检测到额外的重复融合(补充表S3).

PAX基因融合的存在与否决定了两种不同的肿瘤基因型

值得注意的是，当PAX基因融合阳性（PFP）肿瘤与PAX基因聚合酶阴性（PFN）肿瘤进行比较时，我们发现PFN人群的突变负荷显著增加(图3a). 平均而言，PFN肿瘤与PFP肿瘤相比，每个肿瘤的体细胞非同义突变显著更多（分别为17.8和6.4）(P（P）=2×10-4). 与PFP样品相比，PFN样品的非整倍体总体增加(P（P）=1×10-5) (图3b). 一个3个月大的显著PFP肿瘤（RMS224），除了PAX3-氧气1染色体11p杂合性的融合和拷贝中性丢失（LOH）(图1b). 有趣的是，PFP和PFN基因型似乎在突变频率和年龄之间有着明显的关系，随着诊断年龄的增长，体细胞突变的数量越来越多，PFN肿瘤的曲线斜率也越来越大(图3c).

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融合阳性和融合阴性RMS具有不同的基因型。一，融合阳性肿瘤（红色）和融合阴性肿瘤（蓝色）中蛋白质编码突变的数量。b条融合阳性肿瘤（红色）和融合阴性肿瘤（蓝色）的非整倍体染色体数目存在显著差异。c（c）融合阳性（红色）与融合阴性（蓝色）的诊断年龄与全基因组突变。

RMS突变反复影响的基因

在44个肿瘤的发现集中，我们总共鉴定了542个体细胞突变（包括错义、无义、剪接位点和小插入/缺失），改变了495个基因（40个复发）(补充表S5); SIFT分析预测58%的这些变化是有害的(17). 选择这些基因在整个队列中进行进一步的验证和验证，并使用复发率、背景突变率、基因大小和非同义：同义比率进行排名(表1). 该列表包含之前在RMS中报告为改变的基因，包括，HRAS、KRAS、NRAS(7),FGFR4型(9),PIK3CA公司、和NF1型(18)以及之前未涉及RMS的基因，如FBXW7型和BCOR公司(图4).

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儿科RMS的基因组景观突出了候选改变。147例横纹肌肉瘤患者的人口学特征、组织学亚型和具有拷贝数改变或体细胞突变的选定基因。独特的样本标识符和测序平台。性别，男性穿蓝色，女性穿粉红色。年龄，诊断时的年数分为5年以下和5年以上。组织学诊断，红色，肺泡；蓝色，胚胎型，包括纺锤形和葡萄状亚型；灰色，RMS未另行规定。绿色的混合肺泡和胚胎组织学。选定基因的拷贝数增益和损耗。蓝色，损失；红色，收益；绿色，杂合性缺失。具有体细胞突变的选定基因。紫色，融合蛋白；黑色，错义；橙色，无义/剪接位点/indel突变。

表1

147例横纹肌肉瘤中体细胞突变频率高的基因
基因工作组WES公司RMS（有效值）
重复		RMS（有效值）
频率		PAX融合
积极的
重复		PAX融合
积极的
频率		PAX融合
否定
重复		PAX融合
否定
频率		财务总监
美国国家科学院47117.5%001111.7%5.10至09
FGFR4公司三696.1%0099.6%3.15E-12段
PIK3CA公司三585.4%11.9%77.4%5.86E-10号机组
BCOR公司三585.4%11.9%77.4%2008年11月21日
FBXW7型三474.8%0077.4%2008年11月21日
KRAS公司三三64.1%0066.4%5.51E-06年
TP53型1453.4%0055.3%5.51E-06年
NF1型三253.4%0055.3%2.06E-03版
人力资源管理系统2242.7%0044.3%1.12E-05

全基因组测序；WES，全外显子序列测定；FDR，错误发现率

RAS/PIK3CA/酪氨酸激酶突变主要影响PAX融合阴性肿瘤

影响受体酪氨酸激酶的突变/RAS/PIK3CA通路是本研究中观察到的最常见的突变。RAS基因的改变，美国国家科学院（代表性基因组图1d; PFN频率，11.7%），KRAS公司（PFN 6.4%），人力资源管理系统（PFN 4.3%）影响致癌密码子12、13或61，如前所述，主要在ERMS亚型中发现(19)然而，一个ARMS组织学为“融合阴性”的肿瘤（RMS2051）美国国家科学院突变。PFP肿瘤中未发现RAS突变。RAS的直接效应物也发现了突变，包括肿瘤抑制因子的改变NF1型（PFN 5.3%突变，17q11.2 LOH 9%补充图S2)还有一个肿瘤有致癌突变布拉夫密码子V600E（RMSS013）。PIK3CA公司突变（PFN 7.4%）发生在已知致癌密码子Q546或H1047处，分别影响螺旋结构域和激酶结构域。有趣的是，两个样本（RMS2028，RMS217）同时发生了PIK3CA公司和RAS家族基因。尽管ERMS肿瘤较常见（6/7），但一个融合阳性ARMS肿瘤（RMS244）在PIK3CA公司PI3K的直接效应器也被发现发生改变，包括在PIK3CD公司（RMS2107）和PTEN公司（2117令吉）。在整个人群中，发现几个酪氨酸激酶基因反复突变，包括FGFR4型（PFP 0%，PFN 9.6%），PDGFRA公司（1.4%），以及ERBB2号机组(1.4%).

细胞周期基因和其他关键途径的突变

控制细胞周期的基因在研究人群中也经常发生突变。FBXW7型E3泛素连接酶在7.4%的PFN肿瘤中发生突变。该基因的所有突变均发生在参与底物识别的WD40重复区内保守精氨酸残基（R387P、R441G、R367P）的PFN亚型中。WNT信号分子的突变CTNNB1公司是结直肠癌和髓母细胞瘤的已知驱动因素，最近已在RMS中描述(8). 在这项研究中，我们发现三种肿瘤（PFN 3%）在已知致癌密码子S33（n=1）和T41（n=2）发生改变，其中一种发生在融合阴性的ARMS肿瘤中。体细胞突变TP53型仅发生于PFN肿瘤（PFN 5.3%；代表性基因组图1e)12%的肿瘤的LOH为17p13.1，其中包括TP53型(补充图S2). 一名患者（RMS 212）被发现在TP53型R248时(补充图S3A-C). 其他有丝分裂细胞周期检查点基因在低频下发生突变，包括BUB1B型(1.4%),FOXM1型(1.4%),CCND1号机组(1%),CCND2号机组(1%). 一个值得注意的发现是BCOR公司位于染色体Xp11.4上，占所有RMS病例的7%。在这些变更中BCOR公司在PFN肿瘤中发现9个（7个突变，2个局部纯合子缺失），在PFP肿瘤中发现1个小indel(表1和补充图S4).

RNA测序强调候选癌基因的表达

为了进一步丰富潜在癌基因和靶向突变的分析，我们对80个肿瘤（29个PFP和51个PFN）的RNAseq数据进行了突变分析，以确定在DNA水平上发现的哪些体细胞突变也表达在转录组中。在DNA水平上发现的经验证的体细胞突变中，有58%有RNA表达的证据(补充图S5A和S5B). 每个肿瘤都有五种表达的体细胞突变中位数（范围0-26；PFN中位数，9种突变；PFP中位数，2.5种突变；补充表S6). 发现33个基因反复携带表达突变，包括PTPN11号机组（0 PFP与。2 PFN）(20)，DNA修复基因自动取款机（2.5%；1 PFP与。1 PFN），BRCA1相互作用蛋白ZNF350型（2.5%；1 PFP与。1 PFN），以及MYCN公司-相互作用蛋白TRPC4AP公司（2.5%；0 PFP与.2 PFN）。此外，我们发现在FOXO1系列和ARID1A公司(图5a)以前未在横纹肌肉瘤中观察到。通过基因本体论，表达的突变显著丰富了参与细胞周期的基因(P（P）=2e-6），蛋白质磷酸化(P（P）=6.9e-5）DNA损伤（P=1.3e-4），肌细胞分化(P（P）=3.3e-4），MAP激酶活性的调节（P=3.3e-3），染色质修饰（P=9e-4）和诱导凋亡（P=2.8e-3）(补充表S7). 许多肿瘤似乎在这些途径中积累了多个基因命中(图5b).

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80例RMS肿瘤的表达突变。一.在整个转录组测序中发现的候选体细胞变化以及按频率排列的发现基因。顶部，按样本显示的突变数量；蓝色，PAX基因融合阴性，红色，PAX融合阳性。标记的颜色（黄色到红色）代表变异等位基因频率（VAF），许多突变似乎有利于突变等位基因。圆圈的大小与每百万次映射读取（FPKM）中每千基转录本的片段数成正比。b条表达突变的基因本体分析揭示了细胞周期、细胞对应激的反应、蛋白质氨基酸磷酸化、对DNA损伤刺激的反应、微管运动、染色体组织、肌肉细胞分化、MAP激酶活性的调节、有丝分裂细胞周期检查点、，染色质修饰、细胞内信号诱导凋亡、细胞器定位、Rac蛋白信号转导的调节和转移酶活性的调节。许多肿瘤似乎在同一途径中积累了多重突变（蓝色=2，黑色=3或更多）。

副本编号更改

为了评估体细胞拷贝数改变（CNA）在RMS中的重要性，对所有肿瘤进行了高分辨率（250万或500万）SNP阵列分析，并对研究人群中复发的病灶扩增和缺失进行了频率分析(补充图S6). 在50%（16 PFP）中发现11p15.5的LOH与。59 PFN）。重叠的最小公共区域包含11p15.5的区域(补充图S7)包括父系印记基因IGF2型。通过局部放大观察到RMS中胰岛素受体信号改变的进一步证据胰岛素样生长因子1受体2.7%（1PFP与。3PFN）例(补充图S8a) (21)和一个体细胞indel在3′非翻译区胰岛素样生长因子2（2037令吉；补充表S5). 与以前的报告一致，9.7%的肿瘤显示染色体区域12q13-q14扩增，这与RMS患者的总体生存率较差有关，与基因融合状态无关(22). 12q13-q14扩增子主要见于PFP肿瘤（12PFP与。1 PFN）。最小放大器尺寸(补充图S8b)包括25个基因，包括细胞周期蛋白依赖性激酶川东北412q15的复发性局灶性放大（9%；补充图S8c)包含了基因财务报告准则2和MDM2型主要发生在PFN肿瘤（9个PFN与。1 PFP）。2p24的扩增涉及MYCN公司（5%）主要发生在PFP肿瘤（8 PFP与。1个PFN）(补充图S8d); 放大PAX7-FOXO1系列融合基因发生于12/15PAX7-FOXO1系列肿瘤(补充图S8e)和13q31-32的放大，包括MIR17HG型该位点仅出现在PFP肿瘤中（4.5%）(补充图S8f). 抑癌基因纯合缺失CDKN2A型在3%的样本中发现，该位点（9p21.3）的LOH发生在9%（1个PFP）与。13 PFN）。该等位基因丢失率低于先前报道的25%的频率(15). 如前所述(23)在46%的PFN人群中，8号染色体重复扩增。其他染色体水平的事件包括第2、7、11和13号染色体的周期性增加和第1p、9和16号染色体的重复性丢失(补充图S9).

整合突变、拷贝数变化和结构变化的通路分析暗示FGFR信号的改变

为了确定与RMS病理学相关的失调途径，对WGS发现集中发现的结构变异、拷贝数变化和体细胞突变进行了分析。使用发现队列中发现的2119个身体改变基因(补充表S8)，反应器(24)过表达分析表明FGFR信号通路是最显著的改变途径(P（P）= 4.6×10-5)代表29/112个候选基因。该途径发生显著突变(图6a)在WGS分析的88%的PFN样本（22/25个肿瘤）中发现。单独检查时，PFP肿瘤中改变的基因（2119例中的435例）没有显著丰富的典型途径。

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一，反应体通路分析的基因相互作用图，发现FGFR信号的改变是最改变的通路。22/25例融合阴性肿瘤改变了通路中至少一个基因。b条融合阴性RMS肿瘤中改变基因与PAX3-FOXO1表达模型细胞系（7250_PF）中改变基因的GSEA富集图，每个基因的富集分数沿着排列的基因列表向下移动。7250_PF细胞系中改变的基因在融合阴性肿瘤中显著富集（FDR q值=0.004）。已发表PAX3-FOXO1小鼠模型中改变基因的GSEA富集图c（c），体节细胞（FDR q值=0.009）和d日，前肢细胞（FDR q值0.0009）。

PAX3-FOXO1模型系统揭示融合阳性和融合阴性肿瘤中共同遗传轴的改变

值得注意的是，在PFN肿瘤中发现的几个基因发生了改变，包括MYOD1年,MET、CNR1和FGFR4公司，是PAX3和PAX3-FOXO1的已知下游目标(P（P）=1.54×10-3) (25)这使我们假设PFN肿瘤中的突变可能富集了PAX融合蛋白下游调控的基因。为了实验验证这一假设，我们构建了稳定表达PAX3-FOXO1的人成纤维细胞系（细胞系7250_PF），并使用表达阵列将其与等基因对照进行比较(26). 该分析确定了表达PAX3-FOXO1时444个基因的变化超过四倍。顶级上调基因包括多个在PFN肿瘤中发现突变的基因，如FGFR4、CCND2、和IGF2型(补充表S9). 作为模型系统的确认，这些差异表达基因在最近报道的76个PAX3-FOXO1靶基因中也有过多表达(P（P）=1.7×10-3)使用ChIPseq(27). 值得注意的是，在使用基因集富集分析（GSEA）进行的成纤维细胞系实验中，在我们的全基因组测序样品中发现的2119个体变基因在PAX3-FOXO1调节的差异表达基因中显著富集(P（P）=3×10-3) (图6b). 观察到的PFN肿瘤突变基因的富集更为显著(P（P）=7×10-3)比来自PFP样品的那些(P（P）=0.08). 为了进一步验证这一假设，我们使用已发表的数据重复了GSEA分析，这些数据来源于在发育中的前肢或体节中表达PAX3-FOXO1融合基因的转基因小鼠模型(28). 与我们的一致在体外结果，PFN肿瘤中的突变基因在前肢和体节数据集中均显著富集(P（P）=0.001和0.01）(图6c和6d)而PFP肿瘤中的细胞没有富集(P（P）=0.159和0.543）。一组116个常见基因，包括FGFR4公司在GSEA分析中发现的所有三个PAX融合模型系统的前沿(补充表S10).

讨论

据我们所知，本研究代表了迄今为止报道的RMS基础基因组改变的最全面特征。我们发现，通过PAX基因融合的存在或不存在进行亚分类比传统的ARMS/ERMS组织学区分更准确地捕捉到RMS的真实基因组景观和生物学。这一发现与临床观察一致，即是否存在PAX3/7-FOXO1系列基因融合是该病重要的预后指标(29,30)融合阴性ARMS似乎模拟了大多数患者ERMS的临床过程(23). 尽管如此，我们的研究结果表明，有一个融合阴性ARMS亚群，其包涵着一种重组PAX3系列带有隐秘伴侣的基因；这一发现可能对患者的适当治疗分层产生重要的临床影响。

总的来说，我们观察到的低体细胞突变率与其他儿童实体瘤的大量测序工作相一致，并提出了巨大的相关性和临床挑战(31-34). 在RMS中，这在含有易位癌基因的肿瘤中尤其明显（每兆碱基0.1个蛋白编码变化）。这一发现强调了圣像牌基因融合是该亚型的主要驱动因素，通过其转录重编程改变了许多下游靶点。然而，值得注意的是，多个遗传模型系统已经表明PAX3-FOXO1本身不能引起RMS，并且共存的遗传损伤是必要的(35,36). ARMS小鼠模型中经实验验证的协同病变包括TP53型和墨水4a/ARF损失(37). 我们的数据表明，最常见的合作事件是由于基因扩增（例如MYCN公司,川东北4,MIR-17-92型)或删除(CDKN2A型（Chr11p15.5的LOH），并且只有在极少数情况下才能指定额外的候选体细胞驱动突变。相反，融合阴性肿瘤在临床表现时似乎积累了较高程度的非整倍体和突变负担。

尽管RMS肿瘤的突变率相对较低，但其确有一系列显著的改变，包括染色体重排、扩增、缺失和复发驱动因素的突变以及新的候选治疗靶点。本研究中发现的许多基因改变包括FGFR4、IGF1R、PDGFRA、ERBB2/4、MET、MDM2、CDK4和PIK3CA公司被批准或后期治疗药物作为靶点，这些药物可以立即为RMS的临床试验提供信息(图7). 在这项研究中，我们发现RAS通路（包括FGFR4公司，RAS，NF1型,PIK3CA公司)在至少45%的PFN肿瘤中被突变激活。虽然直接靶向组成活性RAS仍然具有挑战性，但MEK1/2抑制剂Trametinib最近在突变的黑色素瘤中的成功美国国家科学院证明了抑制由突变改变的效应通路的效用(38). 早期临床前证据已发现该方法在RMS中的有效性(39)目前正在进一步努力，以精确剖析对RMS至关重要的RAS效应器通路。

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横纹肌肉瘤模型通路改变。在融合阳性肿瘤中发现红色基因，而在没有PAX基因融合的肿瘤中发现蓝色基因。群体中的变化及其频率包括突变和小指数（M）、拷贝数缺失和扩增（C）或影响基因的结构变异（S）。

这项研究的一个新发现是发现了BCOR公司影响7.4%的PFN肿瘤。BCOR是一种转录阻遏物，已被证明与I类和II类组蛋白脱乙酰化酶相互作用(40)和体细胞突变BCOR公司在包括AML在内的其他儿童肿瘤中也有报道(32)、视网膜母细胞瘤(33)和髓母细胞瘤(34). 我们发现其在RMS中反复发生的改变加强了这种染色质修饰(41)作为潜在的治疗靶点。对发现的突变进行进一步的功能验证BCOR公司,亚利桑那州FBXW7,ZNF350、TRPC4AP以及其他可能为RMS患者的新治疗提供靶点。将所发现的基因纳入前瞻性、注释良好的临床试验，对于将这些发现作为治疗性生物标记物的实用性扩展至关重要。

尽管存在复发率低的挑战，但儿童癌症的基因研究通过减少衰老过程中自然发生的乘客突变背景，为肿瘤发生的可能驱动因素提供了显著的见解。PFP和PFN基因型似乎在突变频率和年龄之间具有明显的关系，PFN肿瘤的斜率更大，这一观察可能具有有趣的意义。这一发现表明，PFN肿瘤在出现之前需要积累突变，而PFP肿瘤的恶性转化只需要融合基因发生以外的少量体细胞改变。这也可能是由于不同肿瘤类型的起源细胞、增殖和凋亡率的差异或潜在的DNA修复缺陷所致。我们观察到，在DNA水平上发现的经验证的体细胞突变中，58%有证据表明RNA表达，这一比例高于在乳腺癌等成人癌症中观察到的36%(42)或淋巴瘤(43)这可能反映出这些儿科患者中驾驶员突变增多或乘客突变累积较少。在许多情况下，突变基因的表达似乎相对增加，有利于变异等位基因。这一发现，至少在理论上，提供了易于控制的基因靶点，可以针对这些靶点开发治疗方法。

最后，我们的综合分析表明，尽管存在显著的遗传和分子异质性，RMS肿瘤似乎劫持了一个共同的受体酪氨酸激酶/RAS/PIK3CA基因轴。这通过两种替代机制发生，一种是PAX基因重排，另一种是作为PAX融合蛋白下游靶点的基因突变积累。在WGS调查的93%（41/44）的肿瘤中可以找到这一共同遗传轴改变的证据，并且似乎围绕着成纤维细胞和胰岛素受体途径。这些观察结果与之前对RMS的蛋白质组研究一致(44,45)并保证对该轴进行持续的生物学研究和药理学靶向，这对于扩大可用的治疗选择至关重要。总之，我们报告了横纹肌肉瘤基因组图谱的最全面分析。我们的发现为新的转化研究途径提供了一个合理的框架，包括分子亚分类和为患有横纹肌肉瘤的儿童开发新的治疗策略。

方法

样品选择

所有患者样本采集均由参与机构的机构审查委员会批准。样本收集自国家癌症研究所儿科肿瘤学分所、儿童肿瘤学小组、澳大利亚新南威尔士州韦斯特米德儿童医院肿瘤银行和西班牙巴塞罗那圣琼德德肿瘤学部。除复发时收集的样本NCI0040和NCI0080外，所有肿瘤均在初次诊断时和任何治疗前收集。对样本进行鉴定，并汇编组织学诊断和临床信息。所选肿瘤>70%为肿瘤：组织学检查中的正常组织（如有）。对全基因组样本进行质量控制基因分型，以确保肿瘤正常配对的匹配。

核酸提取和全基因组扩增

根据制造商协议，分别使用QIAamp DNA Mini Kits（加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen）或Agencourt Genfind v2试剂盒（加利福尼亚州Bechman Coulter）从10-25mg肿瘤或1ml全血中分离DNA。对于全基因组测序，根据完整基因组学（CG）方法对大约6 ug（范围5-10 ug）的天然基因组DNA进行测序(46). 使用高保真Phi29聚合酶（Qiagen REPLI-g）的全基因组扩增基因组DNA，根据制造商协议用于整个外显子组验证队列（Qiangen，Valencia，CA）。使用Quanti-iT DNA分析（纽约州格兰德岛生命科技公司）对DNA进行量化。每个DNA样本在1%琼脂糖凝胶上通过电泳进行检测，以确保高质量。根据制造商协议，使用Qiagen RNeasy微试剂盒完成RNA提取（加利福尼亚州巴伦西亚市Qiangen）。

背景突变率的计算

使用张描述的方法计算背景突变率(47). 简言之，背景突变率是编码区中的沉默突变率，由编码区的静音-非静音比率（TCGA联盟估计为0.350）进行调整。

用于全基因组测序的小变异发现

小变异，包括单核苷酸变异和indels被称为cgatools(http://cgatools.sourceforge.net/docs/1.6.0/)内置hg19。首先通过比较肿瘤与匹配的白细胞正常DNA来确定体细胞变异。为了消除测序平台特有的伪影，我们消除了除RMS患者以外的正常受试者中也发现的任何体细胞变异（50个内部正常样本和69个完整基因组样本(http://www.completegenomics.com/public-data/69-基因组/). 躯体得分(48-50)http://info.completegenomics.com/rs/completegenomics/images/Cancer_Application_Note)基于贝叶斯模型，考虑了生殖系变体和肿瘤变体的读取深度、基本调用质量、映射/对齐概率以及测序错误率的先验值。利用一个独立的平台（SOLiD外显子组测序）验证全基因组测序中的体细胞变异，通过选择体细胞得分≥0的变异，我们找到了灵敏度和特异性之间的最佳平衡(补充图S10A和S10B). 最后，从UCSC基因组浏览器的“自链”轨迹中获取与基因组中其他区域有显著相似性的区域内的小变异(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks？org=人类)，已被删除，因为它们可能是由于映射错误造成的。

然后使用ANNOVAR对体细胞变异进行注释(51)其中详细说明了变化的同步/非同步性质、相应的氨基酸变化以及dbSNP135和1000基因组项目中是否存在变化。SIFT公司(http://sift.jcvi.org/www/sift_chr_cords_submit.html)和Polyphen(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/bgi.shtml)使用评分来确定SNP变体的潜在影响。Oncotator公司(http://www.broadinstitute.org/oncatator网站/)用于添加来自COSMIC和TCGA的癌症特异性注释。

验证WGS预测的体细胞突变

通过比较在30/44个肿瘤样本上进行的重叠外显子组测序，验证了WGS预测的体细胞分数不小于0的小变异。在外显子组测序数据中，检查每个体细胞位置的相同变化以及覆盖率。当大于3个外显子组读取支持WGS读取时，调用变异验证。利用44个WGS肿瘤制成的条形码DNA库，使用设计的定制AmpliSeq癌症面板和AmpliSerq库试剂盒2.0，在Ion Torrent个人基因组机器上进行测序，进行额外的现场验证。根据制造商的协议进行多重PCR文库制备、ePCR模板制备和半导体测序。测序产生868Mb高质量碱基，平均扩增子覆盖率为206X。使用这种方法，敏感性计算为84%（假设CG全基因组测序报告的小变异包括所有真阳性变异），特异性计算为93%。中报告的突变的额外验证图1,表1通过使用65°C的均匀退火温度对基因组DNA进行PCR扩增，然后使用Sequencer 4.10软件进行标准Sanger测序和分析（Gene Codes Corporation）。

从全基因组测序中发现拷贝数

CG拷贝数片段（基于2-kb窗口）剖面用于调用扩增（>=5拷贝）和纯合缺失。拷贝数改变分为两组：1）长度小于一臂的局灶性放大或缺失；2） 全臂或全染色体事件。

交叉路口发现

根据肿瘤样本和配对生殖系样本的高置信连接报告，我们将体细胞连接称为仅存在于肿瘤样本中的体细胞连接。去除其他正常样本（50个内部种系样本和69个CG基线种系样本）中存在的体细胞连接，以减少系统伪影。将预测的体细胞连接与相应的SNP阵列拷贝数数据进行比较，结果表明90%的连接在预测的断点处拷贝数状态或等位基因比率发生了变化。

马戏团绘图

使用Complete Genomics提供的Circos绘图软件为每个样本生成Circos图(http://www.completegenomics.com/analysis-tools/cgatools)，内部定制修改。

PAX-FOXO基因融合的RT-PCR

我们确定了PAX3-氧气1或PAX7-FOXO1系列根据已发表的方法，使用特异性寡核苷酸引物，使用肿瘤RNA的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）进行融合状态(52).

RNA测序

根据制造商协议（加利福尼亚州圣地亚哥Illumina®），使用TruSeq v3化学试剂制备PolyA选择的RNA文库，用于Illuminia HiSeq2000上的RNA测序。对100个碱基长配对阅读进行质量评估，并使用CASAVA（Illumina®，加利福尼亚州圣地亚哥）绘制阅读地图。生成的fastq文件用作TopHat2的输入(53). 使用Samtools(http://samtools.sourceforge.net/)将生成的BAM文件与DNA中发现的体突变位点进行比较，并计算总覆盖率和变异等位基因频率。表达的融合转录物通过磷酸-融合0.1.0检测(54)和去保险丝0.4.3(55)与hg19人类基因组组装。

RNAseq表达分析和无监督聚类

袖扣(http://cufflinks.cbcb.umd.edu/) (56)用于组装和估计在基因和转录物水平（FPKM）上用TopHat2定位的转录物的相对丰度。FPKM值进行log2转换。基于欧氏距离的Wards算法对样本进行聚类。

固体外显子序列测定和数据分析

我们构建了测序库，并使用安捷伦SureSelect人类全外显子试剂盒进行了靶向富集，该试剂盒根据制造商的说明设计用于靶向所有人类外显子的37.8 Mb区域（安捷伦，圣克拉拉，加利福尼亚州）。使用50x35bp配对测序协议（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）在SOLiD™4系统上对PCR-扩增文库进行测序。测序用于评估120对肿瘤/正常人编码序列的改变。使用BFAST版本0.7.0a，每个样本的平均3.3 Gb非冗余序列在目标上映射到hg19(57). 使用Picard删除重复项(http://picard.sourceforge.net/command-line-overview.shtml)，正常/肿瘤bam文件用作GATK版本2.1-11的输入(http://www.broadinstitute.org/gatk/)(58-60). 使用默认参数进行局部重新校准和基础质量重新校准。使用GATK UnifiedGenotyper对单核苷酸多态性和indels进行命名(http://www.broadinstitute.org/gatk/gatkdocs/org_broadiinstitute_sting_gatk_walkers_genotyper_UnifiedGenotyper.html). 通过质量分数大于50、肿瘤和正常的覆盖率大于10、肿瘤的VAF（Variant Allele Frequency）大于15%、正常的VAF为0%的变异用ANNOVAR、SIFT、PPH2和COSMIC进一步注释。

Illumina Exome方法

100ng的肿瘤和肿瘤DNA经过剪切、末端修复、磷酸化和连接到条形码测序适配器。为200-350 bp之间的片段选择了大小不等的连接性DNA。使用SureSelect v2 exome诱饵（安捷伦，圣克拉拉，加利福尼亚州）对制备好的DNA进行了外显子捕获。捕获的DNA在Illumina HiSeq流式细胞上进行多重化和测序。利用Broad Institute管道进行外显子分析(61,62). MuTect和MutSig算法分别用于调用体细胞突变并确定统计显著性。

PFP突变率与PFN突变率的比较

我们假设PFP中的体细胞非同义突变比PFN RMS中的少(图3). 为了验证这一假设，我们比较了PFP和PFN RMS患者中经验证的体细胞非同义突变的数量。随机排列测试（RPT）是通过排列患者的组标签来进行的，以避免对突变数量的未知分布以及该假设带来的偏差进行任何假设。汇总统计被定义为组间变异性除以组内变异性，以测量两个患者组之间的差异，同时考虑每个患者组内的变异性。

量化突变频率与年龄之间的关系

我们观察到PFP和PFN RMS在突变频率和年龄之间有明显但一致的关系(图3c). 因此，我们分别对PFP（16名具有年龄信息的患者）和PFN（24名具有年龄数据的患者）的WGS SNV数量（因变量）和相应的诊断年龄（解释变量）之间的关系进行了线性回归建模。每个线性回归模型的拟合优度通过t吨-对WGS报告的突变数与线性回归模型预测的突变数之间的皮尔逊相关系数进行检验（由于已知的正相关，因此进行了单尾检验）。

确定具有统计学意义的基因的方法

在WGS研究中，621个携带体细胞分数不低于0的小变异基因被应用于外显子验证样本（103个肿瘤/正常对-90 SOLiD/13 Illumina）。递归计算中包括使用上述SOLiD或Illumina GATK分析管道调用的任何小变体。然后将总复发率计算为WGS数据和WES数据中的基因突变数。采用Wei等人报告的二项式方法对该基因列表进行排名(63)以计算基因突变的重要性。该方法考虑了观察到的基因突变的重复性、基因编码区的长度、背景突变率以及同步与非同步比率。根据错误发现率≤0.05选择重要基因(64).

SNP阵列

Illumina Omni®2.5M（97个配对肿瘤加上30个非配对肿瘤）或5M（10个配对样本）根据制造商（Illuminia，加利福尼亚州圣地亚哥）在国家癌症基因组研究实验室的标准程序进行。当可用的匹配正常：分析肿瘤配对阵列。对于拷贝数分析，行数据在Illumina GenomeStudio中进行了处理和规范化(http://www.illumina.com/Documents/products/technotes/technote_infinium_genotyping_data_analysis.pdf). 最终报告导出并导入Nexus BioDiscovery(http://www.biodiscovery.com/downloads/pdfs/SimplifyingDataInterpretationWithNexusCopyNumber.pdf)软件处于配对模式。在Nexus中，对数据进行GC含量校正，并使用SNP-FASST2进行分段。使用STAC算法分析整个人群的频率和融合状态(65). 使用行探针水平的对数相对比绘制高拷贝放大器。

路径分析

反应体途径分析(网址：http://www.reactome.org/)如前所述执行(24). 对躯体改变的基因进行了过度表达分析。Fisher精确测试用于计算P（P）-值决定了数据集中的基因和观察到的路径之间的关联仅由偶然性解释的概率。通过使用IPA（Ingenuity®Systems，网址：www.intenuity.com). 进行功能分析，提取对数据集最重要的生物功能。使用右尾Fisher精确测试计算P（P）-值确定分配给该数据集的每个生物功能仅由于偶然性的概率。

PFN RMS基因改变与PAX-FOXO1结合基因的相关性

我们观察到FN RMS肿瘤中许多经常改变的基因是PAX-FOXO1结合基因。为了测试这两个基因组之间的重叠是否偶然，我们比较了25例FN RMS肿瘤中的体细胞突变、拷贝数扩增、拷贝数纯合性缺失或结构变异（WGS报道的1957个基因）的基因，最近报道的PAX3-FOXO1结合位点染色质沉淀鉴定中显著改变的基因（Cao报告的76个基因(28)). 进行Fisher精确检验以评估这两个基因组之间的关联，以及P（P）=4.5×10-3，拒绝零假设（显著性阈值设置为0.05）。这一结果表明PFN RMS患者中改变的基因与PAX-FOXO1结合基因显著相关。

7250_PF细胞系

如前所述，从母细胞系CRL7250（ATCC）构建稳定转染表达PAX3-FOXO1的细胞系(26,66). 美国国家癌症研究所癌症流行病学和遗传学部门使用短串联重复DNA指纹对这些细胞系进行了验证。用RT-PCR评估PAX3-FOXO1融合癌基因的预期表达(补充图S11). 所有细胞在85%的DMEM中与300ug/ml的G418和10%的胎牛血清在相同的条件下生长，并在80-85%的汇合度下收获。根据制造商的方案，使用Qiagen AllPrep mini-kit纯化细胞总RNA。使用人类基因组U133 Plus 2.0阵列（Affymetrix）进行微阵列表达分析，并使用RMA（Affmetrix）将数据归一化。这将为log2空间中的每个探测生成表达式值。然后，我们计算了相对折叠变化分数的绝对值(补充表S8)如下所示：绝对值[（7250_PF RMA信号）-（7250-PF Nil RMA信号]。使用GSEA算法对这些值进行了进一步分析（见下文方法）。(http://www.broad.mit.edu/gsea/).

PAX3-FOXO1在体节或前肢表达的小鼠模型

的表达式数据PAX3系列-FOXO1系列小鼠体节和前肢的表达来源于上述实验(28).

GSEA分析

为了测试融合阴性RMS中的体变基因是否与融合阳性RMS下游的基因重叠，我们进行了基因集富集分析（GSEA）(67)在三个PAX基因融合模型系统上。每个模型系统的基因表达根据相应对照组的绝对折叠变化表达进行排序。GSEA分析(http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)使用默认参数设置执行。P（P）-这些值是根据Kolmogorov-Smirnov统计和随机排列测试计算的。

​

重要性声明

这是迄今为止对横纹肌肉瘤进行的最全面的基因组分析。尽管突变率相对较低，但多个基因反复改变，包括美国国家科学院,KRAS公司,人力资源管理系统,FGFR4公司,PIK3CA公司,CTNNB1公司,FBXW7型、和BCOR公司此外，大多数横纹肌肉瘤改变酪氨酸激酶/RAS/PIK3CAaxis为基因组学指导干预提供了机会。

补充材料

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致谢

作者感谢儿童肿瘤组织软组织肉瘤委员会和生物病理学中心，特别是Julie Gastier Foster博士对临床样本的仔细收集和注释。我们感谢NCI癌症基因组研究实验室和核心RNA测序设施的工作人员对本研究的贡献。这项研究利用了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）的Biowulf Linux集群的高性能计算能力(http://biowulf.nih.gov)得到了美国国立卫生研究院、美国国立癌症研究所、美国癌症研究中心的校内研究计划的支持。本出版物的内容不一定反映卫生与公众服务部的观点或政策，提及商品名称、商业产品或组织也不意味着美国政府的认可。另外，扎克曼（M.B.Zuckerman）和Pan-Mass Challenge的蜻蜓队（Team Dragonfly）向MM提供了慷慨的礼物。JC由美国癌症学会阿斯利康博士后奖学金资助。DC得到了与悉尼大学悉尼医学院儿科和儿童健康学科联合任命的支持，并通过儿童癌症项目获得资金支持。

财务支持–JFS、LC、JSW、RP、JW、YKS、CT、LH、HL、SZ、DB、AB、SS、TB、FB、JK，由国家卫生研究院、国家癌症研究所、癌症研究中心的内部研究计划提供支持。MM得到了M.B.Zuckerman和Pan-Mass挑战赛蜻蜓队的支持。JC由美国癌症学会阿斯利康博士后奖学金资助。DC得到了与悉尼大学悉尼医学院儿科和儿童健康学科联合任命的支持，并通过儿童癌症项目获得资金支持。

缩写

RMS（有效值）横纹肌肉瘤
工作组全基因组测序
WES公司全外显子组测序
PFP公司PAX基因融合阳性
PFN公司PAX基因融合阴性

脚注

作者透露没有潜在的利益冲突。

作者贡献：所有序列数据均已上传至dbGAP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gap). 如有要求，可提供转载和权限信息。JK、JS和MM构思并领导了该项目。JS、LC、JSW和JK撰写并编辑了手稿。LC进行了全基因组分析和相关统计测试，JS对数据进行了解释。JS、JC和RP执行SNP阵列分析。RP和JJW对SOLID外显子组测序进行了分析和解释。JS、LH、YS执行了验证排序。JS、RP、SZ、SS进行了RNAseq分析。JC、MR、GG、MM进行了外显子组捕获并分析了Illumina测序结果。LA和DA促进了样品的转移、测序和分析。JM和DC提供了样品。TB、DB和AB提供了数据分析方面的专业知识，并编辑了手稿。DH、JA、SS和FB选择并表征样本，提供疾病特异性专业知识，并编辑手稿。

竞争性金融利益：作者声明没有相互竞争的经济利益。

工具书类

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