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.2013年11月1日；19(21):5940-51.
doi:10.1158/1078-0432.CCR-13-0850。 Epub 2013年8月5日。

双重阻断PI3K/AKT/mTOR（AZD8055）和RAS/MEK/ERK（AZD 6244）通路在体内外协同抑制横纹肌肉瘤细胞生长

简·伦肖 1, 凯瑟琳·泰勒, 瑞安·毕晓普, 梅兰妮·瓦伦蒂, 亚历克西斯·德黑文·布兰登, 沙伦·戈万, 苏珊娜·埃克勒斯, 露丝·R·拉德尔, 路易斯·约翰逊, 佛罗伦萨一世雷诺, 乔安娜·L·塞尔夫, 钦哲威, 托尔斯滕·皮埃奇, 安德鲁·皮尔逊, 珍妮特·希普利
附属公司

双重阻断PI3K/AKT/mTOR（AZD8055）和RAS/MEK/ERK（AZD 6244）通路在体内外协同抑制横纹肌肉瘤细胞生长

简·伦肖等。 临床癌症研究. .

摘要

目的：为使用磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和/或丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径抑制剂治疗横纹肌肉瘤（儿童和青少年癌症死亡的主要原因）提供理论依据。

实验设计：采用免疫组织化学方法评估横纹肌肉瘤临床样本中PI3K/MAPK通路激活的患病率。p110α短发夹RNA介导的缺失后，在横纹肌肉瘤细胞系中检测到PI3K/MAPK通路之间的补偿信号和串扰。利用稳定的p110α敲除株中重编程信号的药理学抑制来确定诱导最大生长抑制的靶向抑制谱。单独或成对评估TORC1/2（AZD8055）、MEK（AZD 6244）和P13K/mTOR（NVP-BEZ235）抑制剂的体外和体内疗效。

结果：82.5%的横纹肌肉瘤中PI3K通路激活，36%的肺泡型和胚胎型的MAPK协同激活。短期和长期内，细胞系中p110α的敲除与其他p110亚型的代偿表达、MAPK通路的激活以及重新激活PI3K通路的串扰有关。PI3K通路和MAP-ERK激酶（MEK）抑制剂的组合在体外协同抑制细胞生长。用AZD8055和AZD6244处理RD细胞可阻断双向通路的激活，AKT/ERK/S6磷酸化降低就是证明。在体内，使用AZD8055/AZD6244组合（而非NVP-BEZ235/AZD6245）对生长和药效学生物标记物变化的协同效应进行了概述。药代动力学分析提供了药物与这两种组合相互作用的证据。

结论：两种横纹肌肉瘤亚型中的双重PI3K/MAPK通路激活和代偿信号预测，针对任一通路的单一药物缺乏临床疗效，支持TORC1/2与MEK抑制剂联合的治疗策略。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。PIK3CA公司shRNA-介导的敲除诱导细胞株特异性代偿信号转导和MAPK和PI3K通路之间的相互串扰
答：。代表性增长曲线如下PIK3CA公司敲除：两个ARMS（RH30和RMS-1）和两个ERMS（RD和RMS-YM）细胞系用对照（CONSH）或PIK3CA公司靶向shRNA(PIK3CA公司KD）或仅用聚乙烯处理（CONUT）。对d2、d5和d8细胞进行计数，对d2和d5细胞进行适当稀释后，放入新鲜平板中，以便计算和绘制d5和d8的累积细胞计数。在d2上引入嘌呤霉素（2.5μg/ml）选择并在整个实验中保持，CONUT和CONSH生长曲线之间的差异反映了病毒转导效率。B。1A类PI3K亚型的西方免疫印迹，证实在8天内PIK3CA公司shRNA转导的细胞系，以及凋亡标记（PARP裂解）和自噬标记（LCBI/II表达）。在d5上看到的PARP切割反映了嘌呤霉素在d2-d5之间的选择。C、。PI3K通路生物标记物的西方免疫印迹显示上述细胞中PTEN、pAKT、pS6、IRS2、pERK和pAMPK的细胞系特异性破坏。*RMS-1细胞中的pS6水平低于PhosphorImager检测水平。因此，在X射线胶片曝光10分钟后收集此图像。D。pERK和总ERK免疫印迹的定量显示C、。使用ImageQuant软件，表示为pERK:总ERK的比率。每个条上的数字：在每个细胞系中，CONUT细胞中pERK:总ERK的比率设置为1.0，并计算每个样品的相对倍数变化。
图2
图2。PI3K和MAPK信号通路的重新编程在IRS2表达解除的稳定p110αKD细胞中诱导对mTOR抑制的敏感性增加，但仅在p110α和δ表达降低的RMS-1 KD细胞对MEK抑制的敏感性升高
答：。1A类PI3K亚型的Western Immunoblot证实稳定KD系（PI3K-KD）中的p110αKD以及ERMS KD稳定系中p110δ表达的上调（与CONSH对应物相比）。此外，还显示了稳定的p110αKD细胞系中PI3K和MAPK通路的选定元件，这些元件显示了细胞系特异性上调pThr308型AKT（但不是pSer473系列AKT）和IRS2，上调所有KD株系中的pERK和pAMPK水平，增加自噬（LCBI/II），尤其是ERMS KD株。B。和C、。在分别用NVP-BEZ235和AZD8055处理成对的CONSH和KD株系后，具有代表性的生长抑制曲线（MTS分析）表明，在IRS2表达解除的KD株中，对mTOR抑制的敏感性增加。D。AZD6244处理后的代表性生长抑制曲线显示，仅在缺乏p110α和δ的RMS-1细胞中对MEK抑制的敏感性增加。
图3
图3。PI3K和MAPK通路的双重阻断在RMS细胞系中是协同作用的在体外
A.、B.和C。分别使用组合AZD8055/AZD6244、ZSTK474/AZD5244和NVP-BEZ235/AZD6241的组合等深线图。GI公司50化合物A和B的值沿着GI绘制在X轴和y轴上50在各种固定浓度的化合物A存在下获得的化合物B的值。GI之间的对角线50这两种化合物在y轴和x轴上的值是可加性的理论线。所有GI50此行左侧的值表示协同作用。D。pERK1/2，p水平Ser473系列AKT和p序列240/244AZD8055、AZD6244和AZD8025/AZD5244联合0.5×和1.0×GI处理后RD细胞中的S650浓度。在处理后的指定时间点提取对照细胞和药物处理细胞的蛋白质。将每个时间点的对照和处理样品并排装入西方免疫印迹，并使用ImageQuant软件进行定量。每个时间点的药物处理/对照磷酸化生物标记物水平表示为时间0时水平的%。注意：。当细胞达到汇合点时，对照样品中的pERK水平在48小时时一直低于可量化水平。
图4
图4。AZD8055（而非NVP-BEZ235）与AZD6244联合治疗RD异种移植物后，显著增强了抗肿瘤疗效
答：。和B。分别用AZD6244和AZD8055或NVP-BEZ235单独和联合治疗指定剂量的RD异种移植物的头对头治疗研究。肿瘤体积表示为第0天每个肿瘤的体积百分比。最终肿瘤重量（g）显示，与单独的AZD6244（**p=0.015）或单独的AZD8055（*p=0.038）相比，AZD8055/AZD6244组合的疗效显著增加，并且与单独的AZD6244（p=0.13）或单独的BEZ235（p=0.82）相比，NVP-BEZ235/AZD6244组合的疗效没有显著差异（Mann-Whitney t检验）。C、。AZD6244单独或与AZD8055或NVP-BEZ235联合治疗的小鼠的最终剂量后3小时的血浆AZD5244浓度，以及上述相同小鼠的血浆AZD8055和NVP-BEZ235浓度。D。肿瘤PD生物标记物pERK:磷酸（T/Y:202/204:185/187）ERK/总ERK1/2，pAKT:磷酸（Ser473）AKT/总AKT和pS6:磷酸（240/244）S6/总S6，由MSD免疫分析测定。
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