Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry

doi:10.1016/bs.mie.2016.10.007

.2017:585:377-395.

doi:10.1016/bs.mie.2016.10.007。 Epub 2016年12月24日。

通过等压标记、广泛液相色谱和质谱法对蛋白质组和磷蛋白组进行深度剖析

B白¹, H棕褐色², V R帕加拉², A A高², V P Ichhaporia公司¹, L亨德肖特¹, J彭^三

附属公司

¹圣裘德儿童研究医院，美国田纳西州孟菲斯。
²美国田纳西州孟菲斯圣犹达儿童研究医院圣犹达蛋白质组学设施。
^三美国田纳西州孟菲斯市圣裘德儿童研究医院；美国田纳西州孟菲斯市圣裘德儿童研究医院圣裘德蛋白质组学设施。电子地址：junmin.peng@stjude.org。

PMID： 28109439
预防性维修识别码：项目编号：5441839
内政部： 2016年10月10日/bs.mie.2016.10.007

通过等压标记、广泛液相色谱和质谱法对蛋白质组和磷蛋白组进行深度剖析

B白等。酶学方法. 2017.

.2017:585:377-395.

doi:10.1016/bs.mie.2016.10.007。 Epub 2016年12月24日。

作者

B白¹, H棕褐色², V R帕加拉², A A高², V P Ichhaporia公司¹, L亨德肖特¹, J彭^三

附属公司

¹圣裘德儿童研究医院，美国田纳西州孟菲斯。
²美国田纳西州孟菲斯市圣裘德儿童研究医院圣裘德蛋白质组学设施。
^三美国田纳西州孟菲斯市圣裘德儿童研究医院；美国田纳西州孟菲斯市圣裘德儿童研究医院圣裘德蛋白质组学设施。电子地址：junmin.peng@stjude.org。

PMID： 28109439
预防性维修识别码：项目编号：5441839
内政部： 2016年10月10日/bs.mie.2016.10.007

摘要

基于质谱的蛋白质组学在蛋白质的综合分析和翻译后修饰方面取得了前所未有的进展，特别是在液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和等压标记复用能力方面取得了技术进步。在这里，我们介绍了一种深度蛋白质组学分析协议，该协议将10-plex串联质谱标签（TMT）标记与优化的LC-MS/MS平台相结合，以量化整个蛋白质组和磷酸蛋白质组。主要步骤包括蛋白质提取和消化、TMT标记、二维液相色谱、TiO₂-介导的磷酸肽富集、高分辨率质谱和计算数据处理。该方案通常导致哺乳动物样本中超过10000个蛋白质和大约30000个磷酸化位点的可靠定量。实施质量控制步骤，以排除故障并评估实验变化。这种复合稳健的方法为从细胞培养、动物组织到人类临床标本等各种复杂样品的系统水平上剖析蛋白质组特征提供了强有力的工具。

关键词：生物信息学；等压标记；液相色谱法；质谱；磷蛋白组；蛋白质组学；串联体量标记。

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数字

图1
TMT10-复合试剂。（A） TMT试剂标记胺反应基团（例如赖氨酸残基和肽的氨基末端）。（B） TMT10-plex试剂盒中的10种试剂（星号表示13C和15N重同位素的位置）。（C） MS/MS光谱中的TMT报告离子。这些报告的强度用于蛋白质定量。

图2
TMT-LC/LC-MS/MS用于分析整个蛋白质组和磷酸蛋白质组的工作流程。（A）分析方案。（B）用于全蛋白质组分析的基本pH RPLC分馏。（C）磷酸蛋白质组分析的基本pH RPLC分馏。

图3
通过Western blotting分析对一批10个样品进行质量控制分析。蛋白A是一种阳性对照蛋白，在样本6-10中以较高水平表达。蛋白质B是一种负荷控制，在样品中没有差异。

图4
标签效率分析。（A）在LC-MS/MS期间，在7.4分钟的保留时间下具有强强度的未标记肽。（B）7.2分钟时完全不存在相同肽，8.2分钟时存在标记肽，表明完全TMT标记。

图5
实验方差分析和对照比较。生物重复（无效实验）和对照病例比较之间的log2比率分布。

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