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.2016年8月9日；113(32):9015-20.
doi:10.1073/pnas.1603883113。 Epub 2016年7月22日。

联合化学遗传学方法鉴定横纹肌肉瘤细胞溶质HSP70依赖性

阿米特·萨布尼斯 1, 克里斯托弗·格雷罗 2, 维克托·奥利瓦斯 三, 安妮·萨亚娜 4, 乔纳森·舒伊 4, 詹妮弗·弗拉纳根 4, 索拉拉·阿斯塔纳 三, 阿德里安·巴顿 5, 詹姆斯·巴顿 5, 杰森·盖斯特威基 6, 彼得·沃尔特 7, 乔纳森·魏斯曼 8, 彼得·威普夫 9, 杰弗里·L·布罗茨基 2, 特雷弗·G·比沃纳 10
附属公司

联合化学遗传学方法鉴定横纹肌肉瘤细胞溶质HSP70依赖性

阿米特·萨布尼斯等。 美国国家科学院程序. .

摘要

细胞质和基于细胞器的热休克蛋白（HSP）伴侣确保新生和受损多肽的适当折叠和功能，以支持细胞生长。在细胞应激条件下，包括致癌转化，蛋白质组分保持体内平衡并防止凋亡。尽管这种与癌症相关的功能为以蛋白质平衡调节剂（例如HSP90）为治疗靶点提供了理论基础，但癌症对特定蛋白质平衡成分的亚型依赖性相对不明确。在这里，我们表明人类横纹肌肉瘤（RMS）细胞依赖热休克蛋白70 kDA（HSP70）生存，而不是其他几种癌症细胞类型。HSP70靶向治疗（而非化疗药物）通过触发未折叠蛋白反应（UPR）促进RMS细胞凋亡，UPR诱导PRKR样内质网激酶（PERK）-真核翻译起始因子α（eIF2α）-CEBP同源蛋白（CHOP）信号传导和CHOP介导的细胞死亡。有趣的是，仅抑制细胞溶质HSP70可诱导UPR，这表明RMS细胞中HSP70的基本活性位于内质网-细胞溶质界面。我们还发现，临床标本中CHOP mRNA的增加是化疗治疗RMS患者预后不良的生物标志物。数据表明，与乳腺癌中的人类表皮生长因子受体2（HER2）扩增一样，RMS中CHOP的增加是化疗反应降低但靶向治疗反应增强的生物标志物。我们的研究发现，细胞溶质HSP70-UPR轴是RMS发病机制的意外调节器，揭示了HSP70-靶向治疗是一种有希望的策略，可以参与CHOP介导的凋亡并改善RMS治疗。我们的研究强调了解剖癌症亚型对蛋白质组网络的依赖性，以揭示意外癌症脆弱性的实用性。

关键词：HSP70；癌症；伴侣；肉瘤；未展开的蛋白质反应。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
人RMS细胞的存活取决于HSP70的激活。(一个)将细胞系接种在96周的平板中，并用增加的MAL3-101（HSP70耳蜗酮激活抑制剂）处理。使用CellTiter-Glo分析测定72小时的存活率；集成电路50剂量采用非线性回归计算。数据显示为平均值±SEM(n个= 3). (B类和C)13令吉(B类)和RD(C)用10μM MAL3-101处理细胞指定时间，并对全细胞裂解物进行PARP裂解、PAX3-FOXO1、c-RAF、AKT和β-actin的印迹。数据代表三个独立的实验。(D类)用10μM MAL3-101或DMSO处理RMS13和RD细胞，并在指定时间通过台盼蓝排除法计算活细胞数。显示了与二甲基亚砜相比活细胞的平均百分比（±SEM）(n个= 6).
图S1。
图S1。
MAL3-101和四种MAL3-102立体异构体在RMS13横纹肌肉瘤细胞中的毒性。立体异构体的制备如SI方法细胞在指示浓度下与立体异构体或MAL3-101孵育72 h，并用CellTiter-Glo分析细胞活力。数据表示三个独立实验的平均值±SD。立体异构体1（分数1）：t吨R 23.3分钟；立体异构体2（馏分2）：t吨R25.3分钟；立体异构体3（馏分3）：t吨R 29.3分钟；立体异构体4（分数4）：t吨R 32.0分钟（ChiralPak IA）；立体异构体1和4以及立体异构体2和3是对映体对。
图2。
图2。
HSP70抑制触发UPR，并使CHOP参与促进RMS凋亡。(一个)RMS13细胞中由9-h MAL3-101与DMSO处理调节的基因。日志2根据日志绘制折叠式更改10-调整后的P（P）值（Benjamini–Hochberg校正）。衣霉素（29）后小鼠胚胎成纤维细胞中CHOP和ATF4调节的基因以红色突出显示，CHOP(DDIT3公司)显示。(B类)中突出显示的基因的GSEA一个.NES，归一化富集分数；FDR，错误发现率。(C)用10μM MAL3-101处理的RMS13和RD细胞的免疫印迹，代表三个独立实验。裂解液在与图1相同的凝胶上运行B类，因此重复加载控制。(D类)用抗荧光素酶的shRNAs（对照）或DDIT3公司（印章）。IC50如图1所示进行测量一个条形图显示平均值±SEM；P（P）值由unparied计算t吨测试(n个= 6–9).
图S2。
图S2。
CHOP对于MAL3-101诱导PAX3-FOXO1阳性和PAX3-FXO1阴性RMS细胞的凋亡是必要的。(一个和B类)PAX3-FOXO1–阳性RMS13细胞(一个)和PAX3-FOXO1–阴性RD细胞(B类)用抗荧光素酶的shRNA转导（对照）或DDIT3公司（CHOP）。MAL3-101集成电路5072小时后由CellTiter-Glo测量。(C)用靶向荧光素酶或CHOP的shRNAs转导RMS13细胞，然后用10μM MAL3-101或DMSO处理6 h。收集总RNA，并使用qPCR测量CHOP诱导的折叠变化，归一化为GAPDH。误差条显示SEM；n个= 3. (D类)先前用shRNA转导的RMS13细胞DDIT3公司用CHOP cDNA或空载体转导，IC50测量结果为一个.P（P）值由unparied计算t吨测试(n个= 3). (E类)用GADD34 C末端、CHOP（31）的负调控因子或空载体和IC转导RMS13细胞50测量结果为C. (F类)用抗CHOP的shRNA或抗荧光素酶的对照shRNA转导的RMS13细胞，或表达长尾仓鼠GADD34的C'末端的细胞，或含有空载体的细胞，用10μM MAL3-101处理6小时。免疫印迹显示，CHOP诱导减少与PARP裂解减少相关。(G公司)用DMSO或PERK抑制剂0.1μM GSK2656157预处理RMS13细胞30 min，然后用10μM MAL3-101或1μg/mL衣霉素预处理6 h。用全细胞裂解物测定预处理是否阻断ATF4和CHOP诱导。(H（H）)MAL3-101敏感性RMS13细胞和MAL3-101-抗性A673、CHLA10的裂解物(EWS-飞行1+、尤因肉瘤）、H3122和STE-1(EML4-确认+非小细胞肺癌）细胞经10μM MAL3-101或DMSO处理8小时。耐药细胞要么完全不能激活UPR以响应药物，要么选择性激活适应性ATF4臂，而CHOP诱导和凋亡最少。印迹是三个独立实验的代表。
图3。
图3。
RMS生存需要细胞溶胶HSP70。(一个)RMS13细胞用二甲基亚砜、10μM MAL3-101、125 ng/mL催化失活的枯草蛋白酶细胞毒素（SubAB S272A）或125 ng/mL活性毒素（SubAB）处理6小时。使用全细胞裂解物检测PARP切割和BiP水平。所示数据代表三个独立的实验。(B类)从RMS13细胞中提取RNA进行qPCR，如一个。基因表达标准化为GAPDH公司; 数据显示平均值±SD(n个= 3). (C)用指示的siRNA转染RMS13细胞72小时。免疫印迹证实敲低并测量UPR激活。所示数据代表三个独立实验。用CellTiter-Glo测量转染后120 h的细胞存活率，并将其归一化为用对照siRNA转染的细胞。每个基因的两个siRNA的平均存活率±SEM如下所示(n个= 4). (D类)剂量-等基因RMS13-R细胞系和亲代RMS13细胞对MAL3-101的反应。(E类)用10μM MAL3-101或5μg/mL衣霉素处理RMS13和RMS13-R细胞6 h。用qPCR检测CHOP诱导。数据显示为平均折叠变化±SEM(F类)如图所示，用siRNA转染RMS13和RMS13-R细胞，然后用MAL3-101处理；使用CellTiter-Glo测定存活率。集成电路50剂量采用非线性回归计算。集成电路50用对照siRNA处理的RMS13-R细胞在测试的最高剂量（30μM）下未达到。平均IC50显示了三个独立重复的（±SEM）。
图S3。
图S3。
诱导性和组成性细胞溶质HSP70是RMS细胞中MAL3-101的相关靶点。(一个和C)融合阳性RMS13(一个)或熔断负极RD(C)用指定浓度的对照siRNA或靶向siRNA池转染细胞热休克蛋白A1A/B（可诱导）和热休克蛋白A8（构成）72小时，然后用MAL3-101处理。48小时后，CellTiter-Glo和IC测量存活率50剂量采用非线性回归计算。所示数据来自三个独立的副本；误差条代表SEM(B类和D类)细胞的免疫印迹一个和C证明随着siRNA数量的增加，敲除作用增强。注意，在低浓度siRNA下热休克蛋白A1A/B导致更多HSP72（可诱导），如图3所示C.
图S4。
图S4。
击倒热休克蛋白12a恢复MAL3-101对RMS13-R细胞的敏感性。(一个)如图所示，用siRNA转染亲代RMS13和耐药RMS13-R细胞热休克蛋白A12A用qPCR测定转录物（数据显示平均折叠变化±SEM）。用对照siRNA（siCTL）处理的RMS13和用靶向HSPA12A的siRNA处理的RMS13-R之间的差异在双尾t吨测试(P（P）=0.13（对于siRNA#1）和0.26（对于siRNA#2）。(B类)转染siRNAs的RMS13和RMS13-R细胞一个用越来越多的MAL3-101进行处理，并使用CellTiter-Glo测定存活率。误差条显示了三个独立副本的SEM。
图S5。
图S5。
RMS13-R细胞对多种细胞毒性化合物仍然敏感。将RMS13和RMS13-R细胞接种到96-well板中，并用(一个)MAL3-101(B类)硼替佐米(C)Vernalis 155008(D类)萨普西加金(E类)放线菌素D(F类)高三尖杉酯碱(G公司)长春新碱，或(H（H）)紫杉醇，代表蛋白质平衡网络不同节点的抑制剂和RMS中活性的常规化疗药物。通过CellTiter-Glo测定活性。所示数据代表三个独立实验的平均值。
图S6。
图S6。
RMS13-R细胞不上调多药耐药转运蛋白。对RMS13和RMS13-R细胞进行裂解，并用免疫印迹法检测p-糖蛋白（MDR1）通道的丰度。H630R1细胞显示为阳性对照。所示的斑点是三个独立重复的代表。
图4。
图4。
CHOP升高是RMS患者化疗后生存率低下的生物标志物。(一个)120个RMS样本通过表达DDIT3公司（CHOP）来自Affymetrix U133A微阵列（36）。P（P）生存值采用log-rank检验计算。(B类)用10μM MAL3-101、5 nM长春新碱、5 nM放线菌素D、5μg/mL 4-氢过氧化-环磷酰胺或1μM阿霉素处理RMS13细胞的免疫印迹，持续指定时间。(C)RMS中HSP70依赖性的模型。胞质HSP70降解或重折叠未折叠的蛋白质（1），这些蛋白质在MAL3-101处理后回到ER中（2），从而激活PERK磷酸化eIF2α（3）。当CHOP mRNA丰富时，eIF2α磷酸化导致CHOP蛋白（4）快速翻译，激活致命程序，最终激活caspase 8。
图S7。
图S7。
AJSR1电池PAX3-氧气1–表达RMS细胞。(一个)扩增嵌合物的RT-PCR引物示意图PAX3-氧气1成绩单但非本地PAX3系列或FOXO1系列顺序见表S4。(B类)从指定的细胞系（A204，恶性横纹肌样肿瘤，阴性对照；RMS13，肺泡RMS，阳性对照；Rh18，胚胎RMS；AJSR1，肺泡RNS）中提取RNA。对cDNA进行逆转录酶PCR以检测嵌合转录物的存在或不存在。所示凝胶是三个独立复制品的代表。
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