化学-遗传联合方法鉴定横纹肌肉瘤细胞溶质HSP70依赖性

HSP70抑制激活RMS细胞中的未折叠蛋白反应。

接下来，我们使用一种无偏见的方法来确定MAL3-101抑制HSP70在RMS细胞中的致死作用的基础。伴侣组分的扰动可导致基因表达发生深刻而特殊的变化，从而决定细胞对伴侣调制的反应(23)。因此，我们推断转录组分析可能揭示MAL3-101治疗导致RMS细胞死亡的特定细胞程序。我们发现DNA损伤诱导转录物3(DDIT3公司)编码CEBP同源蛋白（CHOP）的基因是MAL3-101治疗后上调最强烈的基因之一(图2A类)。因为CHOP与内质网（ER）中未折叠蛋白积累下游的凋亡有关(24)我们的发现增加了HSP70抑制参与未折叠蛋白反应（UPR）并诱导CHOP杀死RMS细胞的可能性。

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图2。

HSP70抑制触发UPR，并使CHOP参与促进RMS凋亡。(A类)RMS13细胞中由9-h MAL3-101与DMSO处理调节的基因。日志₂根据日志绘制折叠式更改₁₀-调整后的对值（Benjamini–Hochberg校正）。衣霉素对小鼠胚胎成纤维细胞CHOP和ATF4基因的调控(29)以红色突出显示，CHOP(DDIT3公司)显示。(B类)中突出显示的基因的GSEAA类.NES，归一化富集分数；FDR，假发现率。(C类)用10μM MAL3-101处理的RMS13和RD细胞的免疫印迹，代表三个独立实验。裂解液在与图1B类，因此重复加载控制。(D类)用抗荧光素酶的shRNAs（对照）或DDIT3公司（CHOP）。IC₅₀测量值为图1A类条形图显示平均值±SEM；对值由unparied计算t吨测试(n个= 6–9).

UPR是一个保守的信号通路网络，可以对内质网中错误折叠的蛋白质产生适应性存活或凋亡反应(25)。三种不同的UPR传感器，PRKR样内质网激酶（PERK）、肌醇需要酶1（IRE1）和激活转录因子6（ATF6）在哺乳动物细胞中具有不同的转录输出。PERK激活增强激活转录因子4（ATF4）和CHOP的转录和翻译(25)。双创路径分析(26)和基因集富集分析(27，28)MAL3-101处理诱导的基因表达变化中，CHOP和ATF4转录因子的直接靶基因表现出强烈的富集(图2A类和B类和表S2) (29)。此外，我们发现MAL3-101对HSP70的抑制在生物化学上参与了RMS细胞中的PERK–真核翻译起始因子α（eIF2α）–CHOP信号轴，如PERK的电泳迁移率变化（与磷酸化和活化一致）、PERK靶点eIF2 a的磷酸化、，在PAX3-FOXO1阳性和PAX3-FXO1阴性RMS细胞系中诱导ATF4和CHOP(图2C类)。此外，我们观察到caspase 8的蛋白水解裂解和激活，这与最近的报告一致，表明caspase 9促进CHOP下游的细胞死亡(30).

抑制HSP70导致CHOP依赖性细胞凋亡。

为了测试CHOP在诱导MAL3-101依赖性凋亡中的重要性，我们使用shRNAs敲除DDIT3公司（CHOP）在融合阳性RMS13细胞和融合阴性RD细胞中表达。在这两个系统中，CHOP敲除促进了MAL3-101抵抗(图2D类和图S2A类——C类)表明CHOP是MAL3-101治疗诱导的细胞死亡所必需的。与这些发现一致，CHOP过度表达部分逆转了shRNA-介导的CHOP敲除的效应(图S2D类)。该观察结果表明，非靶向shRNA效应不太可能解释CHOP击倒表型，并且CHOP的增加使RMS细胞对HSP70的抑制敏感。

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图S2。

CHOP对于MAL3-101诱导PAX3-FOXO1阳性和PAX3-FXO1阴性RMS细胞的凋亡是必要的。(A类和B类)PAX3-FOXO1–阳性RMS13细胞(A类)和PAX3-FOXO1–阴性RD细胞(B类)用抗荧光素酶的shRNA转导（对照）或DDIT3公司（CHOP）。MAL3-101集成电路₅₀72小时后由CellTiter-Glo测量。(C类)用靶向荧光素酶或CHOP的shRNAs转导RMS13细胞，然后用10μM MAL3-101或DMSO处理6 h。收集总RNA，并使用qPCR测量CHOP诱导的折叠变化，归一化为GAPDH。误差条显示SEM；n个= 3. (D类)先前用shRNA转导的RMS13细胞DDIT3公司用CHOP cDNA或空载体转导，IC₅₀测量结果为A类.对值由unparied计算t吨测试(n个=3）。(E类)用CHOP的负调节因子GADD34C末端转导RMS13细胞(31)，或空向量，以及IC₅₀测量结果为C类(F类)用针对CHOP的shRNA或针对荧光素酶的对照shRNA转导，或表达长尾仓鼠GADD34的C’末端，或含有空载体的RMS13细胞用10μM MAL3-101处理6小时。免疫印迹显示CHOP诱导的减少与PARP切割的减少相关。(G公司)用DMSO或PERK抑制剂0.1μM GSK2656157预处理RMS13细胞30 min，然后用10μM MAL3-101或1μg/mL衣霉素预处理6 h。用全细胞裂解物测定预处理是否阻断ATF4和CHOP诱导。(H（H）)来自MAL3-101敏感性RMS13细胞和MAL3-101抗性A673，CHLA10的裂解物(EWS-飞行1⁺、尤因肉瘤）、H3122和STE-1(EML4-确认⁺非小细胞肺癌）细胞经10μM MAL3-101或DMSO处理8小时。耐药细胞要么完全不能激活UPR以响应药物，要么选择性激活适应性ATF4臂，而CHOP诱导和凋亡最少。印迹是三个独立实验的代表。

作为评估MAL3-101治疗后CHOP作用的独立方法，我们证实中国仓鼠GADD34的C末端过度表达(31)，一种催化磷酸酶亚单位，可使eIF2α去磷酸化并抑制CHOP，同样促进MAL3-101耐药性(图S2E类)。通过这些基因操作获得的CHOP抑制程度与MAL3-101治疗后观察到的聚ADP-核糖聚合酶（PARP）裂解量相关；也就是说，CHOP降低与PARP断裂减少相关(图S2F类)。UPR传感器PERK的药理抑制(32)MAL3-101治疗后未阻断CHOP诱导，尽管加入衣霉素后阻断了PERK自身磷酸化和CHOP诱导(图S2G公司)。这些数据突出了eIF2α激酶之间已知的功能冗余(33)。最后，MAL3-101耐药的癌细胞株要么没有足够的UPR激活来诱导CHOP，要么在MAL3-1101治疗后没有激活UPR(图S2H（H）)。这些集体数据表明CHOP诱导对MAL3-101诱导的细胞凋亡是必要的。

细胞溶胶HSP70是MAL3-101的基本靶点。

接下来，我们询问MAL3-101对UPR的毒性激活是否是由特定HSP70亚型的抑制引起的。由于内质网管腔中错误折叠的肽通常会激活PERK等内质网不稳定不规则重复反应传感器，我们推断，内质网限制性HSP70结合蛋白（BiP）的丢失足以重现药物的作用。为了解决这个假设，我们用枯草酶细胞毒素（SubAB）处理RMS13细胞，该毒素通过蛋白质水解分解BiP，从而消除其功能(34)，并询问该治疗是否概括了MAL3-101的生化和转录作用。令我们惊讶的是，在与MAL3-101相同的时间段内，SubAB没有诱导PARP切割所测得的细胞凋亡(图3A类)。此外，尽管从SubAB处理的细胞中完全清除了BiP蛋白，但SubAB诱导的CHOP mRNA仅为MAL3-101水平的一半(图3A类和B类)。相比之下，SubAB更强烈地激活了UPR传感器IRE1，这表现在XBP1型在用SubAB处理的细胞中，与用MAL3-101处理的细胞相比(图3B类)。最后，尽管SubAB毒素抑制BiP可诱导BiP mRNA的代偿性上调(热休克蛋白5)，MAL3-101反而引发了对热休克蛋白A1编码细胞溶质伴侣蛋白HSP72(图3B类)。因此，抑制ER受体HSP70亚型BiP导致转录程序和细胞命运与MAL3-101治疗不同。

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图3。

RMS生存需要细胞溶胶HSP70。(A类)用DMSO、10μM MAL3-101、125 ng/mL无催化活性的枯草酶细胞毒素（SubAB S272A）或125 ng/mL活性毒素（SubAB）处理RMS13细胞6小时。使用全细胞裂解物检测PARP裂解和BiP水平。所示数据代表三个独立的实验。(B类)从RMS13细胞中提取RNA进行qPCR，如A类将基因表达标准化为GAPDH公司; 数据显示平均值±SD(n个=3）。(C类)用指示的siRNAs转染RMS13细胞72小时。免疫印迹证实敲除并测量UPR激活。所显示的数据代表了三个独立的实验。用CellTiter-Glo测量转染后120 h的细胞存活率，并将其归一化为用对照siRNA转染的细胞。每个基因的两个siRNA的平均存活率±SEM如下所示(n个= 4). (D类)同基因RMS13-R细胞系和亲代RMS13细胞对MAL3-101的剂量反应。(E类)用10μM MAL3-101或5μg/mL衣霉素处理RMS13和RMS13-R细胞6 h。用qPCR检测CHOP诱导。数据显示为平均折叠变化±SEM(F类)如图所示，用siRNA转染RMS13和RMS13-R细胞，然后用MAL3-101处理；使用CellTiter-Glo测定存活率。集成电路₅₀剂量采用非线性回归计算。集成电路₅₀用对照siRNA处理的RMS13-R细胞在测试的最高剂量（30μM）下未达到。平均IC₅₀显示了三个独立重复的（±SEM）。

根据MAL3-101治疗后观察到的HSP72诱导(图3B类)，我们假设MAL3-101主要靶向细胞溶质伴侣(35)。为了验证这个假设，我们使用了遗传方法。我们发现诱导性细胞溶质伴侣蛋白HSP72（由热休克蛋白A1和HSPA1B型)对UPR激活或细胞活力几乎没有影响(图3C类)。主要组成性表达的细胞溶质HSP70、HSC70的敲除(热休克蛋白A8)产生了强大的eIF2α磷酸化和ATF4诱导，但CHOP诱导最小，细胞活力仅轻微丧失(图3C类)。这种效应伴随着应激诱导的HSP72亚型的上调(图3C类)。我们推断，HSP72的这种代偿性诱导提供了足够的伴侣活性，从而使细胞免于UPR介导的死亡。因此，我们击倒了HSP72(热休克蛋白A1和HSPA1B型)和HSC70(热休克蛋白A8)同时发现，细胞溶质HSP70的诱导型和组成型的联合敲除引起强烈的UPR激活，伴随PARP裂解和RMS细胞活性的丧失(图3C类)。此外，同时敲低HSP72和HSC70使融合阳性和融合阴性RMS细胞对MAL3-101敏感(图S3)，这与相关药物靶点的耗竭一致。

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图S3。

诱导性和组成性细胞溶质HSP70是RMS细胞中MAL3-101的相关靶点。(A类和C类)融合阳性RMS13(A类)或熔断负极RD(C类)用指定浓度的对照siRNA或靶向siRNA池转染细胞热休克蛋白A1A/B（可诱导）和热休克蛋白A8（组成型）72小时，然后用MAL3-101处理。48小时后，CellTiter-Glo和IC测量存活率₅₀剂量采用非线性回归计算。显示的数据来自三个独立的重复；误差条代表SEM(B类和D类)如中所述处理的细胞的免疫印迹A类和C类证明随着siRNA数量的增加，敲除作用增强。注意，在低浓度siRNA下热休克蛋白A1A/B导致更多HSP72（可诱导），如图3C类.

作为在RMS细胞中识别MAL3-101相关靶点的另一种方法，我们在化合物和克隆衍生耐药（RMS13-R）人群的稳定剂量增加下培养RMS13细胞。分离的MAL3-101耐药RMS13-R细胞系耐受高达30µM MAL3-102而不丧失活性(图3D类)。尽管用衣霉素治疗后RMS13-R细胞适当激活了UPR，但MAL3-101治疗后CHOP诱导不存在，这表明存在阻止UPR激活的耐药机制(图3E类)。RMS13-R细胞的全外显子组和转录组测序未能确定HSP70家族成员、PERK、eIF2α或CHOP中的点突变或拷贝数改变，这可能解释了耐药性，但却证明了不同细胞溶质HSP70的表达显著增加（但不是突变或基因组扩增），热休克蛋白家族A成员12A(热休克蛋白A12A) (表S3)。我们假设HSPA12A的上调可能通过增加相关药物靶点（即替代细胞溶质HSP70蛋白）的丰度来促进对MAL3-101的耐药性。正如预测的那样，沉默热休克蛋白A12ARMS13-R细胞中的表达导致MAL3-101敏感性的部分恢复(图3F类和图S4)。值得注意的是，这些RMS13-R细胞对广泛的其他治疗药物仍然敏感(图S5)并且没有上调多药耐药转运蛋白(图S6)。这些结果强烈表明，MAL3-101耐药的机制是抑制剂特异性的。总之，我们的数据确立了细胞溶质HSP70对RMS细胞生存至关重要的功能，并表明MAL3-101阻断细胞溶质热休克蛋白70激活致命的PERK–eIF2α–CHOP信号。

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图S4。

击倒热休克蛋白A12A恢复MAL3-101对RMS13-R细胞的敏感性。(A类)如图所示，用siRNA转染亲代RMS13和耐药RMS13-R细胞热休克蛋白A12A用qPCR测定转录物（数据显示平均折叠变化±SEM）。用对照siRNA（siCTL）处理的RMS13和用靶向HSPA12A的任一siRNA处理的RMS 13-R之间的差异在双尾分析中不显著t吨测试(对对于siRNA#1为0.13，对于siRNA#2为0.26）。(B类)转染siRNAs的RMS13和RMS13-R细胞A类用越来越多的MAL3-101进行处理，并使用CellTiter-Glo测定存活率。误差条显示来自三个独立复制的SEM。

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图S5。

RMS13-R细胞对多种细胞毒性化合物仍然敏感。将RMS13和RMS13-R细胞接种到96-well板中，并用(A类)MAL3-101(B类)硼替佐米(C类)Vernalis 155008(D类)萨普西加金(E类)放线菌素D(F类)高三尖杉酯碱(G公司)长春新碱，或(H（H）)紫杉醇，代表蛋白质平衡网络不同节点的抑制剂和RMS中活性的常规化疗药物。通过CellTiter-Glo测定活性。所示数据代表三个独立实验的平均值。

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图S6。

RMS13-R细胞不上调多药耐药转运蛋白。对RMS13和RMS13-R细胞进行裂解，并用免疫印迹法检测p-糖蛋白（MDR1）通道的丰度。H630R1细胞显示为阳性对照。所示的斑点是三个独立重复的代表。

活性分析。

将细胞以8000个细胞/100μL的密度放置在96周的透明板中。药物治疗72小时后，用CellTiter-Glo试剂（Promega）溶解细胞，并在SpectraMax M5（分子器件）上读取发光。

免疫印迹法。

细胞密度为2×10⁵在6孔培养皿中每孔2 mL培养基中培养，并在指定的处理前让其粘附过夜。收集上清液并用PBS清洗。用PBS冲洗粘附细胞，然后在放射免疫沉淀分析缓冲液中进行溶解【25 mM Tris HCl（pH 7.6）、150 mM NaCl、1%Nonide P-40、1%脱氧胆酸钠、0.1%添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的SDS（罗氏诊断）】与上清液中的颗粒细胞结合。裂解液通过超声和离心进行澄清，然后进行SDS/PAGE，然后用指示的抗体进行印迹，并通过ECL Prime（GE生命科学）在ImageQuant LAS 4000（GE生命科技）上进行检测。对于选择的抗体对（eIF2α/CHOP），在奥德赛成像仪（LI-COR Biosciences）上进行检测。

抗体购买方式如下：从细胞信号技术公司购买：PARP（#9542）、FOXO1（#2880）、c-RAF（#12552）、AKT（#4691）、PERK（#5683）、（p）-eIF2α（#3398）、eIF2α；来自StressMarq Biosciences:HSC70（SMC-151A）和HSP70（SMP-113A）；来自Sigma-Aldrich：β-actin（#A2228）；来自LI-COR Biosciences：IRDye 680抗兔（#925-68023）和IRDyde 800抗鼠（#925-23212）；来自Merck Millipore：抗P-糖蛋白C219（#517310）。

化学制品。

MAL3-101的立体异构体由非对映体和对映体的混合物制备而成，然后在手性固定相（CHIRALPAK IA）上通过超临界流体色谱（SFC）进行分离。通过液相色谱（LC）-MS和蒸发光散射（ELS）检测测定每个立体异构体的纯度（>95%）。Tunicamycin、thapsigargin和放线菌素D购自Sigma。VER-155008、紫杉醇、长春新碱和硼替佐米购自Selleckchem。高三尖杉酯碱购自圣克鲁斯生物技术公司。枯草酶细胞毒素的使用先前有描述(34).

深度排序和分析。

总计1×10⁶细胞在特定条件下进行电镀和处理。分别使用RNeasy和DNeasy试剂盒（Qiagen）提取RNA或基因组DNA。使用用于转录组测序的TruSeq RNA样品制备试剂盒（Illumina）和用于外显子组测序的SureSelect XT人类全外显子试剂盒（Agilent）制备用于测序的文库，并使用HiSEq进行测序。位于旧金山加利福尼亚大学先进技术中心的2500平台。读数与使用RSEM的人类基因组国家生物技术信息中心构建37（hg19）一致(50).

用DESeq进行转录组数据的差异表达。(51)。为了确定DMSO或MAL3-101处理后RMS13细胞中差异表达的基因，我们使用MSigDB进行了Ingenuity Pathway Analysis（Qiagen）和GSEA(27)以及CHOP和ATF4转录上调的基因的定义列表(29).

细胞系的病毒转导。

抗shRNAs慢病毒结构DDIT3公司购自Sigma并转导至RMS13或RD细胞，然后将其在1μg/mL嘌呤霉素（Gibco）中培养72小时，以选择稳定表达者。通过qPCR和Western blot验证敲除。

为了挽救CHOP敲除的影响，使用RNeasy试剂盒（Qiagen）从经MAL3-101处理的RMS13细胞中提取RNA，并使用SensiFAST cDNA合成试剂盒（Bioline）合成cDNA。DDIT3公司使用DDIT3-cDNA引物进行PCR-扩增(表S4)和Phusion Taq聚合酶（新英格兰生物实验室），然后将TA克隆到pCRII-TOPO载体（生命技术）。使用CHOP_CDS引物从该载体中PCR扩增CHOP编码DNA序列（CDS）(表S4)去除末端终止密码子并进行凝胶纯化。PCR产物和pENTR1A质粒（Life Technologies）用XhoI和Not I消化，然后连接，使用LR克隆酶将CHOP CDS重组为pCDNA6.2/V5-DEST（Life Technologies），以创建V5标记的CHOP构建体。该表达载体和pQCXIB逆转录病毒载体（Addgene质粒#17487）是加拿大卡尔加里Zenith Epigenetics Corporation的Eric Campeau赠送的，然后用AgeI和NotI消化、凝胶纯化并连接以产生pQCXIIB-CHOP-V5。然后用pQCXIB或pQCXIB-CHOP-V5转导靶向CHOP的shRNA稳定表达的RMS13细胞，并在5μg/mL杀鼠灵（生命科技）中筛选2周。通过免疫印迹法确认V5的表达。

为了测试长尾仓鼠GADD34C末端表达对MAL3-101敏感性的影响，用来自pBABE-puro（Addgene#1764）的逆转录病毒转导RMS13细胞，pBABE-puro是纽约州罗切斯特大学Harmut Land，Rochester，Jay Morgenstern，Warp Drive Bio，Cambridge，MA和Bob Weinberg的礼物，马萨诸塞州剑桥市怀特黑德生物医学研究所（Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，MA）或pBABE-GADD34C（Addgene#21813，出版名为haA1.pBABEpu），是英国剑桥市剑桥医学研究所大卫·罗恩（David Ron）赠送的礼物，被选入1μg/mL嘌呤霉素。p-eIF2α和CHOP的免疫印迹证实其表达。

siRNA敲除。

对细胞进行电镀，并允许其在一夜之间粘附。第二天，将从Sigma或对照siRNA（Thermo Scientific）购买的siRNA以指示浓度用Lipofectamine 2000（Life Technologies）在无血清培养基中重新悬浮，然后在吸入正常生长培养基后用移液管移到细胞上。在转染后6 h，将含有siRNA的培养基替换为常规生长培养基。细胞在转染48 h后收获并进行活性测定，并在指示的药物治疗48 h后测定活性。实验结束时，对平行放置的细胞进行qPCR或Western blotting以确认敲除。

耐药细胞的克隆衍生。

RMS13细胞在2×10的条件下培养⁵在六孔培养皿中每孔培养细胞，然后用500 nM MAL3-101处理。每3d更换一次培养基，细胞分裂回2×10⁵一旦融合，每个孔的细胞数。在给定剂量的MAL3-101进行两次分离后，剂量逐步增加，如下所示：500 nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、7.5μM和10μM。此时，细胞在10μM MAL3-101中扩增，胰酶化，并在5×10的条件下重新悬浮^三在具有3μM MAL3-101的15厘米培养皿中，每30毫升培养基培养细胞。2周后，可见单细胞集落。这些菌落被高压灭菌玻璃克隆柱（Sigma）包围，并进行胰蛋白酶消化和扩增。如上所述，使用CellTiter-Glo测定法再次确认对MAL3-101的耐药性。

qPCR。

共2×10⁵每个孔的细胞被镀在六孔培养皿中，并让其在一夜之间粘附。在指定的处理后，使用RNeasy试剂盒（Qiagen）提取RNA，并使用SensiFAST试剂盒（Bioline）从100 ng起始RNA合成cDNA。qPCR在QuantStudio 12k Flex热循环机（生命技术）上运行，使用Fast SYBR Green Master Mix（生命技术表S4PCR程序如下：95°C 10 min，然后40个95°C循环30 s，55°C 30 s，72°C 45 s。每个qPCR在三个或多个生物复制品上运行，每个反应具有技术副本。通过生物复制品中模板引物的连续三倍稀释计算扩增效率；然后按照描述计算相对基因表达(49)，引用GAPDH公司表达式作为内部控件。

我们感谢T.G.B.和J.L.B.实验室对实验设计和本手稿的投入；M.Kampmann、L.Gilbert、D.Acosta-Alvear以及J.S.W.和P.Walter实验室，为解释我们的结果提供建议和帮助；以及P.Wipf实验室，为MAL3-101的纯化和配方提供了宝贵的帮助。这项工作得到了霍华德·休斯医学研究所合作创新奖（授予J.S.W.、T.G.B.、J.L.B.、J.E.G.和P.Walter）以及NIH Grants GM75061和DK079307（授予J.L.B.）、DK101584（授予C.J.G.）和T32HD044331-10（授予a.J.S.）的支持。A.J.S.还得到了圣·鲍德里克基金会研究金A121893和达蒙·鲁尼昂·索恩基金会研究金6P-13的支持。UCSF儿童组织库由UCSF癌症中心拨款P30 CA082103支持。