儿童实体瘤原位患者衍生异种移植

患者同意书和MAST协议

根据当地机构伦理法规和机构审查委员会的批准，从圣犹德儿童研究医院的实体肿瘤患者中收集了多余的未经鉴定的肿瘤材料。根据MAST方案的指导原则，获得患者对组织采集的同意。

主要患者组织处理

大多数病例在手术切除后2小时内处理原发肿瘤组织进行植入。原发肿瘤通过酶解分离成单个细胞悬浮液，并在可能的情况下注射到符合疾病类型的解剖位置。如果最初的肿瘤样本太小而无法分离，则将肿瘤组织植入侧翼位置。除了视网膜母细胞瘤被植入C57BL/6 scid小鼠外，最初的植入主要在受体NSG雌性小鼠中进行。在植入并充分生长肿瘤后，采用相同的分离和植入技术将肿瘤收获并传代到裸鼠体内。

原位注射

(骨髓注射）为了减少手术过程中的痛苦和运动，使用了异氟烷气体麻醉。注射前，将小鼠置于鼻锥上的仰卧位置。膝关节的皮肤用交替的碘伏擦洗剂和70%异丙醇擦拭布进行处理。准备好的腿在膝关节处弯曲，并固定在工作面上。触摸股骨，直到股骨髁可见。50μL Hamilton玻璃注射器（Hamilton Cat#80920）上的25号针头与小鼠呈45度角，针尖通过股骨髁间切迹插入股骨，同时将髌骨和髌腱收回至内侧，以避免韧带损伤。针头向下推进至股骨头，根据小鼠的大小大约为5–10 mm，并将10μL细胞悬浮液缓慢注入股骨。(肌肉注射）老鼠被软毛法轻轻但牢固地束缚住。离研究者最近的后脚固定在小指和下拇指下方。用70%乙醇擦洗待注射区域。将针头以45度角斜向插入大腿尾部，并将50–100μL细胞悬浮液缓慢注入肌肉，同时避免损伤坐骨神经。(玻璃体内注射）C57BL/6 scid小鼠通过持续吸入浓度为1–3%的异氟醚进行全身麻醉，氧气流速为2升/分钟。将小鼠置于显微镜下，眼睛在显微镜下凸出，在巩膜和角膜之间用18号针头切开一个小切口。使用5μL玻璃Hamilton注射器（Hamilton公司，7633-01，65RN），通过33号小中心针将细胞以每次5μL的剂量注入眼睛的玻璃体。(肾上腺旁注射）所有超声程序均使用VEVO 2100高频超声进行，该超声配有一个运行频率为40 MHz的MS-550S换能器。接受免疫功能低下小鼠通过持续吸入浓度为1–3%的异氟醚进行全身麻醉，氧气流速为2升/分钟。麻醉受体横向放置在成像床上，左侧面朝上。为了提供植入物的输送通道，将一根22号导管（BD Worldwide，Cat#381423）通过皮肤和背部肌肉轻轻插入肾上腺旁区域，并取下中心。装有27号1.5英寸针头的冷却50μL Hamilton玻璃注射器（Hamilton Cat#80920）装有10μL悬浮液，通过导管引导立体定向，并使用超声波定位在肾脏和肾上腺之间。然后将细胞悬浮液注射到该区域中，并将针留在原位30秒以使基质凝胶组分凝固。然后慢慢取出针头，然后轻轻取出导管。将老鼠放在温暖的干净笼子里，以便从麻醉中恢复。（侧翼植入）对于一些材料充足的肿瘤，我们将组织植入免疫功能低下小鼠的侧面，作为原位注射的备用。接受免疫功能低下小鼠通过持续吸入浓度为1–3%的异氟醚进行全身麻醉，氧气流速为2升/分钟。将小鼠腹侧朝下放置，鼻子朝下，以提供持续麻醉。用70%乙醇清洁从脊椎中部到尾部底部的区域。使用无菌小手术剪刀在侧翼区域做一个5毫米的水平小切口。将无菌剪刀的尖端直接插入切口的侧面，然后打开剪刀，在皮下空间引入一个口袋。用无菌镊子将一块肿瘤组织插入口袋。将一滴100X青霉素/链霉素溶液插入组织块上方的开口中。用Vetbond组织粘合剂（3M Cat#1469SB）封闭切口。用镊子将上覆皮肤固定在一起3-5秒，以便有足够的时间干燥。

酶促肿瘤分离

(神经母细胞瘤）用无菌手术刀将肿瘤切碎，并用不含钙或镁的磷酸盐缓冲盐水（PBS-减溶液）冲洗。将肿瘤悬浮液转移到50 mL锥形管中，并填充PBS-阴性溶液。通过添加600μl胰蛋白酶（10 mg/ml，Sigma Cat#T9935）并将试管置于37度水浴中10分钟，进行分离。通过添加60μL大豆胰蛋白酶抑制剂（10 mg/ml，Sigma Cat#T6522）阻止分离。以60μL的等量增量添加脱氧核糖核酸酶I（2 mg/ml，Sigma Cat#D4513）和氯化镁（1 M），直到肿瘤碎片容易沉淀在试管底部。用40微米细胞过滤器过滤肿瘤悬浮液，然后在500g（g=RCF）下离心5分钟。丢弃上清液，添加10 ml红细胞裂解液（5 Prime Cat#2301310），并在室温下培养10分钟。添加不含钙或镁的磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS-minus，Lonza Cat#17-516F）/10%胎牛血清（FBS，Biowest Cat#SO1520），填充50 ml锥形管和细胞悬浮液，以500 g（g=RCF）离心5分钟。丢弃上清液，将细胞颗粒重新悬浮在PBS-负/10%FBS中进行计数。然后以2×10的浓度将细胞重新悬浮在Matrigel™基底膜基质（BD Biosicences cat.354234）中⁵细胞每10μL，置于冰上注射。（软组织肉瘤）肿瘤通过肿瘤压榨机放置，然后用Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）冲洗（Lonza目录编号12-604F）。将肿瘤悬浮液转移到50 ml锥形管中，并填充DMEM。通过添加600μL胰蛋白酶（10 mg/ml；Sigma目录号T9935）和50 mg II型胶原酶（275 U/mg；Worthington生化目录号4177）进行分离，然后将试管置于37C水浴中1小时。通过添加600μL大豆胰蛋白酶抑制剂（10 mg/ml；Sigma目录号T6522）阻止分离。以60μL的增量等量添加脱氧核糖核酸酶I（2 mg/ml；Sigma目录号D4513）和氯化镁（1 M），直到肿瘤碎片容易沉积在试管底部。用40微米细胞过滤器过滤肿瘤悬浮液，并在500g（g=RCF）下离心5分钟。丢弃上清液，添加10 ml红细胞裂解液（5 PRIME目录号2301310），并在室温下培养10分钟。不含钙或镁的PBS溶液（PBS-负；添加Lonza目录号17-516F）/10%胎牛血清（FBS）（Biowest目录号SO1520）以填充50 ml锥形管，将细胞悬浮液在500 g下离心5 min。丢弃上清液，将细胞颗粒重新悬浮在PBS-负/10%FBS中进行计数。然后以1×10的浓度将细胞重新悬浮在基质凝胶（BD Worldwide目录号354234）中⁶每100μL，置于冰上注射。（骨肉瘤）将肿瘤通过肿瘤压机放置，然后用不含钙或镁的PBS（PBS减去；Lonza目录号17-516F）冲洗。将肿瘤悬浮液转移到100ml螺旋盖玻璃瓶中，并用PBS填充至100ml标记。通过加入600μL胰蛋白酶（10mg/ml；Sigma目录号T9935）和200mg II型胶原酶（275U/mg；Worthington Biochemical目录号4177）进行解离，并置于37度温水浴中90分钟，用磁珠以约200 rpm的速度搅拌，以使所有组织循环并从玻璃瓶底部取出。通过添加600μL大豆胰蛋白酶抑制剂（10 mg/ml；Sigma目录号T6522）阻止分离。以60μL的增量等量添加脱氧核糖核酸酶I（2 mg/ml；Sigma目录号D4513）和氯化镁（1 M），直到肿瘤碎片容易沉积在试管底部。用70微米细胞过滤器过滤肿瘤悬浮液，并在500 g（g=RCF）下离心5分钟。丢弃上清液，添加10 ml红细胞裂解液（5 PRIME目录号2301310），并在室温下培养10分钟。PBS-减去/10%胎牛血清（FBS）的溶液添加（Biowest目录号SO1520）以填充50 ml锥形管，将细胞悬浮液在500 g下离心5 min。丢弃上清液，将细胞颗粒重新悬浮在PBS-负/10%FBS中进行计数。然后以1×10的浓度将细胞重新悬浮在Matrigel™基底膜基质（BD Biosicences cat.354234）中⁶细胞每10μL，置于冰上注射。（视网膜母细胞瘤）用无菌手术刀将肿瘤切碎，并在RPMI（Lonza目录号12-167F）中冲洗。将肿瘤悬浮液转移到50 mL锥形管中，并填充RPMI。通过添加600μL胰蛋白酶（10 mg/ml，Sigma Cat#T9935）并将试管放置在37度水浴中10分钟来进行分离。通过添加600μL大豆胰蛋白酶抑制剂（10 mg/ml，Sigma Cat#T6522）阻止分离。以60μL的等量增量添加脱氧核糖核酸酶I（2 mg/ml，Sigma Cat#D4513）和氯化镁（1 M），直到肿瘤碎片容易沉淀在试管底部。用40微米细胞过滤器过滤肿瘤悬浮液，然后在500g（G=RCF）下离心5分钟。丢弃上清液，加入10ml红细胞裂解液（5 Prime Cat#2301310），并在室温下孵育10分钟。添加不含钙或镁的磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS-minus，Lonza Cat#17-516F）/10%胎牛血清（FBS，Biowest Cat#SO1520），填充50 ml锥形管和细胞悬浮液，以500 G（G=RCF）离心5分钟。丢弃上清液，将细胞颗粒重新悬浮在PBS-负/10%FBS中进行计数。然后以1×10的浓度将细胞重新悬浮在RPMI中⁵每5μL注射用细胞数。

肿瘤冷冻保存

分离后，未用于传代或高通量筛选的肿瘤细胞被冷冻保存以备储存和以后使用。细胞计数并重新悬浮在6×10浓度的冷冻FBS/10%DMSO中⁶除1×10浓度的视网膜母细胞瘤外，所有肿瘤类型每1ml每管的细胞数⁶将每1ml的细胞放入泡沫塑料容器中，在−80°C下冷冻3天，然后转移到液氮中进行长期储存。

组织病理学评分

对患者H&E染色切片和O-PDX衍生切片的组织病理学特征进行组织学相似性比较。根据对以下属性的评估，将这些患者-异种移植物对分为相似类别：总体肿瘤细胞数、生长模式、细胞形态（包括多形性程度）和有丝分裂活性。使用了以下分类系统：

相同：患者和异种移植衍生样本之间没有差异。

类似：生长模式和总细胞数的变化在多形性或有丝分裂活性上没有差异。

形态变化：显著变化，导致两个病灶在形态学上不同，在细胞数量、细胞形态特征、多形性程度、生长模式和有丝分裂活性方面存在显著差异。

免疫组织化学染色和评分

对患者样本和匹配的异种移植物组织进行Caspase 3（总量）、Caspase 2（裂解）和Ki-67评估。此外，根据组织病理学诊断，进行了一些诊断性标记，包括：Fli-1（尤因肉瘤）、Vimentin（高级肉瘤，未另行指定）、S100-蛋白（脂肪肉瘤），INI-1（恶性横纹肌样肿瘤）、CRX（视网膜母细胞瘤）、突触素（神经母细胞癌）、SATB2（骨肉瘤）、，以及肌生成素和MyoD1（横纹肌肉瘤）。除对照组外，总共对446张免疫组织化学染色的玻片进行了检查和评分。通过H&E染色对51个异种移植物样本进行了检查，以及来自主要患者样本的所有相关幻灯片（~676张H&E着色幻灯片）。显微镜检查的载玻片总数：1173张。使用福尔马林固定石蜡包埋组织（厚度4μm）进行染色，并评估适当的阳性和阴性对照。抗体提供于补充表2评估患者样本-异种移植物对的整体免疫组化一致性。已考虑案例不和谐的如果任何选定的诊断标记（Fli-1、Vimentin、S100-蛋白、INI-1、SATB2和CRX）不一致（肿瘤细胞中的阳性与阴性）。只有预期的染色定位被认为是阳性的证据（或像INI-1一样失去染色）。由于已知肌生成素和MyoD1在横纹肌肉瘤亚型中显示不同程度的阳性，因此这些染色的得分最接近核阳性的5%。如果估计的任何一个患者和异种移植物样本之间的肌生成素或MyoD1。使用Aperio®ImageScope（徕卡生物系统公司）获得组织学图像。

电子显微镜

肿瘤样品用2.5%戊二醛、2%半甲醛固定在pH为7.4的0.1 M二氯代甲酸钠缓冲液中，并在含有0.3%亚铁氰化钾的0.1 M四氧化锇缓冲液中后固定1.5小时。在同一缓冲液中冲洗后，通过一系列分级乙醇将组织脱水成环氧丙烷，渗透并嵌入环氧树脂中，并在70°C下聚合过夜。半薄切片（0.5微米）用甲苯胺蓝染色用于光学显微镜检查。使用FEI Tecnai 200Kv FEG电子显微镜和ATM XR41数字相机对超薄切片（80 nm）进行切割和成像。

全基因组测序

如前所述进行全基因组测序和文库构建^17–19进行以下修改；使用Illumina兼容适配器输入250–500 ng基因组DNA用于文库构建，使用Kapa HiFi Hotstart ReadyMix（Kapa Biosystems）进行4–6个周期的扩增。如前所述，对SNV、CNV、SVs和Indels进行鉴定^17–19.

全外显子序列测定

根据制造商说明，使用SeqCap EZ HGSC VCRome（Roche）进行全外显子组测序。

RNA制备和RNA-Seq

通过酚-氯仿萃取法从单个TRIzol（生命技术）制剂中分离出RNA。样品首先用组织匀浆器（Polytron，PT10-35GT）在17000 rpm下匀浆30秒。然后向每个样品中添加1:4体积的氯仿（Sigma），并在室温下培养3分钟，然后在4°C下12000 rcf下离心15分钟。然后将水层转移到硅化eppendorf管中，然后添加2.0μL糖原（Roche）和500μL异丙醇（Fisher）。样品在室温下培养10分钟，然后在4°C下12000 rcf下离心15分钟。然后用冰镇80%EtOH（Fisher）清洗样品两次，以去除盐分，再悬浮在DEPC H中₂0，并使用纳米液滴（热科学）测定浓度。使用RNeasy Plus Mini试剂盒（Qiagen#74134）从新分离的视网膜提取RNA。根据制造商的说明（Illumina），使用TruSeq Straded total RNA Library Prep Kit从大约500 ng总RNA制备文库。按照制造商的说明，对HiSeq 2000或HiSeq 2500测序器进行配对100周期测序（Illumina）。如前所述，在RNA-Seq中进行基于基因的FPKM量化¹计算每个原发肿瘤-O-PDX对的Spearman相关性。

克隆分析

根据Kapa工作流程的供应商说明，使用Seqcap EZchoice试剂盒（Roche）进行靶向富集，500ng基因组DNA作为文库构建的起始输入。如前所述进行克隆分析¹为了检测单个肿瘤不同区域内的克隆变化，采集了一组原位异种移植瘤进行节段克隆分析。切除的肿瘤被切成两半，切边朝上。每一半肿瘤被视觉分割成4个象限，并使用活检针对每个象限的组织进行取样，从单个肿瘤中产生8个样本。如上所述，对8个象限样本中的每个样本进行克隆分析。根据原发性和O-PDX肿瘤之间的肿瘤克隆进化，将样本分为4组：第1组O-PDX瘤保留原发性肿瘤的克隆结构。与匹配的原发性肿瘤相比，第2组O-PDX肿瘤获得了大量的新突变。在第3组的O-PDX肿瘤中，原发肿瘤中的一个小克隆丢失。在第4组样本中，O-PDX肿瘤来源于原发肿瘤中的一个小克隆。

ChIP-Seq公司

SJRHB000026_X1、SJRHB010463_X16、SJOS001112_X1和SJNBL046_X被提交到Active Motif^®用于7个组蛋白标记（H3K27Ac、H3K27 me3、H3K 36me3、H 3K 4me1、H 3K4 me2、H 3k 4me3、H 3 K9-14Ac、H 3k9 me3）、RNA Pol II、CTCF和BRD4的ChIP测序。我们首先使用BWA（版本0.5.9-r26-dev，默认参数）将ChIP-Seq读数与人类基因组hg19（GRCh37-lite）对齐。Picard（版本1.65（1160））则用于标记重复读取。然后，samtools只保留非重复读取（参数“-q 1-F 1024”版本0.1.18（r982:295））。我们遵循ENCODE标准进行质量控制（QC），使用非重复版本SPP（版本1.11）的数据绘制互相关，并在R（版本2.14.0）支持下使用软件包caTools（版本1.17）和bitops（版本1.0-6）计算相对链相关值（RSC），并估计片段大小。我们需要对点源因子（H3K4me2/3、H3K9/14Ac、H3K27Ac、CTCF、RNAPolII、BRD4）进行>10M的唯一映射读取，RSC>1。我们需要20M的宽标记（H3K9me3、H3K27me3和H3K36me3）的唯一映射读取。对于INPUT和RSC<1，我们需要10M唯一映射读取。我们注意到H3K4me1在某些阶段是点源因子，而在其他阶段是广谱因子，因此我们将H3K4me1作为广谱标记进行了质量控制。然后通过手动检查，使用SPP生成的互相关图、估计的最佳碎片大小（SPP在所有情况下估计的最小碎片大小）来扩展每次读取并生成bigwig文件以在IGV上查看（版本2.3.40）。手动检查所有剖面，以确定是否有清晰的峰值和良好的信噪分离。

染色质隐马尔可夫模型

非重复对齐读取通过上文定义的片段大小进行扩展，ChromHMM（1.10版，BinarizeBed使用“-colfields 0,1,2,5-center”）用于染色质状态建模。为了选择状态编号，我们首先对所有鼠标开发阶段（从7个状态到33个状态）进行建模，并在手动检查后选择16个状态的模型。为了更好地显示HMM状态跨阶段的动态，我们通过覆盖基因和侧翼区域的状态的最大总百分比对颜色强度进行了标准化。为了确定代表基因的最佳区域，我们首先通过TSS在任何发育阶段任何H3K4me3/H3K4me2/H3K27Ac/H3K9-14Ac峰值的2kb范围内筛选注释亚型，然后我们选择在任何发育时期由cuffdiff估计的最高表达亚型，或者如果没有由cuffdiff估计的表达水平，则选择最长的亚型。最后，我们将HMM状态的间隔减少到半巴，如果HMM状态没有排在基因的前2位，则强度减少到标准化强度的一半。由于HMM状态可以由多个基因分配，因此跨基因的最大总百分比已用于归一化。利用ChIP-seq图谱计算4种肿瘤中单个基因的HMM状态百分比。根据以下标准选择肿瘤类型特异性上调基因：肿瘤类型间差异表达（FDR<0.05），特定肿瘤类型中高表达（FPKM>8），与其他肿瘤相比高表达（至少高4倍）。肿瘤类型特异性抑制基因被选为：在不同肿瘤类型中差异表达（FDR<0.05），在至少12个其他肿瘤类型中高表达（FPKM>8），与其他肿瘤相比高抑制（至少低4倍）。肿瘤类型特异性表观遗传调控基因被选为肿瘤特异性上调或抑制基因，至少有一种状态在特定肿瘤和其他肿瘤之间的分数变化>=0.25。

统计分析

使用Benjamini&Hochberg方法对p值进行多次比较调整²⁰为了比较植入效率，我们使用了MedCalc软件(https://www.medcalc.org/calc/comparison_of_ratios.php)按照坎贝尔和理查森的建议，使用N-1卡方检验对比例进行比较^21,22为了比较植入时间，我们使用了MedCalc上的平均值比较。圣犹达儿童研究医院生物统计学系对临床前III期研究进行了研究前咨询。数据包括来自4个O-PDX模型的4个不同治疗组中总共140只小鼠。该研究的目的是评估和比较各治疗组的肿瘤反应和无肿瘤进展生存率。按照生物统计学部提供的随机化代码，将小鼠随机分为每个治疗组。采用Kaplan-Meier方法绘制肿瘤进展时间的生存曲线。采用对数秩检验比较各组的生存曲线。肿瘤反应由治疗结束时的生物发光定义，如下表所示。如果一只小鼠在入组后的任何时间点因肿瘤大小大于小鼠体重的20%而退出研究，则会自动分配给它们进行性疾病的反应。信号小于10⁵光子/秒/厘米²/sr被归类为完全应答（CR）。信号在10之间的动物⁵–10⁶分类为部分反应（PR）。稳定疾病（SD）与登记信号10相同⁶–10⁸光子/秒/厘米²/sr和进行性疾病（PD）大于10⁸光子/秒/厘米²/斯里兰卡。观察到的反应数据记录在补充表7和8结果表明，三重组合AZD1755+Irinotecan+VCR对SJRHB013757_X2的完全应答率（CR）最高，为40%（4/10），为90%（9/10），SJRHB13759_X1为37.5%（3/8），SJCHB012_Y为22%（2/9），ARMS O-PDX均为65%（13/20），ERMS O-PDXs均为29%（5/17）。肿瘤进展时间定义为从登记日期到肿瘤大小>20%小鼠体重或外源信号>10的日期之间的时间间隔⁸在研究结束时。下表总结了治疗组在第25天、第66天和第126天的生存概率。同样，两种三重组合AZD1755+Irino+VCR的无进展生存率最高，在研究结束时（第126天），SJRHB013757_X2、SJRHB013759_X1、SJVHB000026_X1和SJRHB 012_Y的生存率分别为100%、100%、62.5%、55.6%、100%和59%。

Kaplan-Meier生存曲线如图所示，并附有log-rank检验p值（所有研究中4个治疗组之间的比较中，所有log-rank检验p值均为0）。

细胞筛选

(镀层密度和DMSO敏感性）将每个肿瘤模型的细胞接种在平底白色384孔板（康宁Cat#8804BC）上，细胞密度为6–8个，从125个细胞/孔到15000个细胞/孔不等。电镀后24小时，用不同DMSO浓度（0%、0.083%、0.197%和0.443%DMSO）处理细胞，得到给定DMSO密度下每细胞12孔的结果。在添加二甲基亚砜72小时后，以25μl/孔的速度添加CellTiter-Glo®（“CTG”，Promega Cat#G7573）试剂，并使用PerkinElmer EnVision平板阅读器读取平板。对相对光单位（RLU）信号进行处理，以确定哪种电镀密度产生了最佳的信噪分离，同时保持电镀后72小时的对数增长和最低的DMSO灵敏度。(阳性对照化合物选择）将每个肿瘤模型的细胞以上述确定的最佳密度放置在384孔板中。电镀后20小时，用含有六种阳性对照化合物候选物（盐酸阿霉素、staurosporine、足叶乙甙、SN-38、硼替佐米和环己酰亚胺）的复合板以高单点浓度和1:3系列稀释系列（每个系列16个点）对细胞进行药物处理。给药后72小时，使用上述CTG方案读取平板。阳性对照组的选择基于该化合物实现完全细胞杀伤（背景水平附近的RLU）的能力，具有明确的s形剂量-反应曲线形状。我们选择staurosporine（初级）和bortezomib（次级）作为所有药物敏感性实验的阳性对照。(化验验证）对于每个肿瘤模型，我们通过在至少两天内使用三个具有交替最大/最小/中间控制信号的独立板进行CTG分析，评估384孔板中分析的变异性，然后检查Z-prime和其他相关统计数据。仅DMSO处理细胞对应的最大信号；最小信号用约30μM staurosporine处理细胞；mid信号使用在上述阳性对照选择期间确定的staurosporine的细胞系特异EC50值。总的来说，我们观察到井之间没有系统的位置依赖性效应，三个信号水平很好地分离，z-prime值高于0.4。(剂量反应中的细胞培养实验通过标准细胞培养技术制备细胞系。从新鲜分离的肿瘤中获得异种移植细胞。对细胞系和O-PDX细胞进行计数，并在384孔板（康宁Cat#8804BC）中进行电镀，电镀密度和电镀条件如所示补充表6.电镀24小时后，使用配备针具的Biomek FX（Beckman Coulter）液体处理仪，用复合板和阳性对照板给每个细胞系或O-PDX样品注入药物。化合物以干粉形式获得，并溶解在二甲基亚砜中，目标浓度为10mM或2mM（对于报告的具有高细胞效价或溶解度限制的化合物）。销工具转移了约65 nL的化合物储备，导致约370倍的化合物稀释。在给药后72小时，用上述25μL/孔CTG试剂溶解细胞。复合板中含有溶解在二甲基亚砜中的化合物，以1:3的稀释倍数排列在1–20列中，每块板含有32种化合物。阳性对照板在第1列至第20列为空；在第21–24列中，它包含溶解在二甲基亚砜中的一级和二级阳性对照物（分别为staurosporine和bortezomib）的单点和1:3系列稀释液，以获得约10 mM的顶部储备浓度，还包含仅含有二甲基亚磺酸盐的微孔（阴性对照）。每个生物复制有三个技术复制。使用UV UV/TWC和蒸发光散射检测（ELSD）光谱法验证了这些研究中使用的每种化合物的纯度>95%，并且在可能的情况下，使用氮化学发光法量化每种溶液的浓度。

细胞筛选分析

（原始数据处理–log2 RLU剂量-反应拟合）对每种浓度下每种化合物的原始发光RLU（相对光单位）值进行log2变换，使用以下等式进行归一化，以获得%活性：100*[（平均值（negctrl）-化合物）/（平均数（negcrl）-平均值（posctrl）]；然后在拟合之前从重复实验中汇总。这里，negctrl和posctrl指的是每个板上的阴性和阳性对照。使用稳健统计（低于[第一个四分位–1.5×IQR]或高于[第三个四分位数+1.5×IQR]，其中IQR=四分位间距）检测对照的异常值，并在计算平均值之前删除。（质量控制指标）z-prime统计量使用以下公式计算：1−（（3×sd（negctrl））+（3×sd（posctrl））/abs（mean（negctrol）–mean（posctr1））。在计算平均值和标准偏差统计数据之前，如上所述去除阴性和阳性对照中的异常值。在本项目总共筛选的1960块平板中，49块（2.5%）的z-prime<0，不包括在进一步分析中。在其余的平板中，平均z-prime为0.57，95%的平板的z-prim在0.27到0.82之间。(拟合log2 RLU剂量-反应曲线）使用数字版权所有[REF:Ritz等人.使用R的生物分析分析，《统计软件杂志》，2005，12，5]R中的包[REF:R核心团队（2012）.R:统计计算的语言和环境.R统计计算基金会，奥地利维也纳。ISBN 3-900051-07-0，URL网址：http://www.R-project.org/]. 使用S形函数拟合三参数（y0，无药物反应，设为零）和四参数模型（y0允许变化）LL2.4型.山坡坡度限制在−10和0之间，ec50限制在10之间⁻¹⁰和10⁻⁴（相当于在这些实验中测试的药物浓度范围）。对于3参数模型，yFin，即剂量-反应曲线的最大反应，被限制在零和在所有合并测量中在每个浓度下计算的中值活性的最大值之间。对于4参数模型，y0和yFin均限制在所有集合测量中在每个浓度下计算的中间活性的最小值和最大值之间。对每种化合物测试的最高浓度值进行10%的加权，以减少曲线拟合伪影。选择修正后的Akaike信息准则（AICc）最低的模型作为最佳拟合模型。曲线下面积（auc）使用梯形规则从拟合曲线计算得出。如果无法拟合S形剂量反应曲线平滑样条线R中的选项用于拟合可用于确定曲线下面积的曲线。(增长率测定）本研究中每个肿瘤细胞模型的生长速率是通过量化细胞板在39到15000个细胞/孔密度范围内的细胞板后第1-4天的RLU值来确定的。RLU值进行log2变换，以拟合y截距为零的线性模型。由此产生的斜率是log2 RLU信号每天的变化。值为1意味着每天RLU信号加倍。（基于观察到的生长速率的剂量反应分析）我们使用sigmoid函数拟合一个三参数模型LL2.4型在drc程序包中，通过回归“观察到的增长率”作为浓度的函数。通过估算x计算观察到的增长率₀来自x_ctrl公司（给定上述确定的特定肿瘤模型的生长速度，以及这些实验中的生长天数-4天），然后确定产生x（c）所需的生长速度、药物浓度下的细胞计数c（c）实验结束时（4天）。我们假设细胞计数与RLU成正比，因此使用RLU进行所有计算。对于这些回归，y0的值设置为未处理细胞的生长速率，并采用以下约束条件：10≤山坡≤0；在所有合并测量中，在每个浓度下计算的药物存在下观察到的中位数增长率的最小值≤yFin≤未处理细胞的增长率；10⁻¹⁰≤ec50≤10⁻⁴如前所述，从每种化合物的最高测试浓度观察到的生长速率加权为10%，以减少曲线拟合伪影。根据观察到的生长速率，从剂量-反应曲线计算出两个有用的指标。预计起飞时间₀是实现零增长或细胞抑制行为所需的有效剂量。对于观察到的增长率从未达到零的曲线，将该值设置为测试的最高浓度。对于生长速率为负的肿瘤模型的曲线，将该值设置为测试的最低浓度。第二个指标，AUC_0中，是曲线下观察到的生长速率-剂量-反应曲线低于零的区域。

药物动力学

(AZD1775）在单次口服120 mg/kg的剂量后，评估雌性裸鼠（Jax Laboratories，8–16周龄）体内AZD1775的血浆和肿瘤匀浆总PK。将AZD11775（AbMole，M2143，纯度>98%，MolWt 500.60）悬浮在0.5%甲基纤维素（400 cPs，Sigma型）中标称浓度为12 mg/mL，灌胃容量为10 mL/kg。使用IACUC批准的方法在给药后30分钟、1小时、2小时、4小时和8小时处死小鼠，每个时间点3只小鼠。通过心脏穿刺用肝素钠收集全血，立即离心至血浆中，并储存在干冰上，以供研究剩余时间使用。然后通过主动脉给小鼠灌注PBS，从后肢切除RMS原位异种移植物，用PBS冲洗，然后放在干冰上。在体内程序结束时，将所有样品从干冰中转移，并置于−80°C下，直到进行分析。使用灵敏和特异的液相色谱-串联质谱分析法评估总血浆和肿瘤匀浆AZD1775的浓度。首先，对肿瘤样本进行浸渍，用5:1体积的Ringer溶液（Frey Scientific）稀释，并用基于珠的技术进行均质⁷在FastPrep-24系统上（MP Biomedicals，加州圣安娜）。将溶钢基质珠（MP Biomedicals，Metal Bead lysing matrix，每毫克肿瘤3毫克）添加到含有样品的微离心管中。然后在FastPrep-24系统上对样品进行三次60 M/S的振动循环，每次1分钟。为了防止摩擦导致过热，在每个循环之间将样品放置在湿冰上5分钟。然后将匀浆储存在−80°C下，直至分析。在甲醇中制备AZD1775（AbMole，M2143，纯度>98%）储备溶液，并用于添加基质校准器和质量控制。血浆和肿瘤匀浆样品（各25μL）用100μL的5 ng/mL克里唑替尼（ApexBio，A8802，第1批，纯度>99%）在甲醇中进行蛋白质沉淀，作为内部标准。通过LEAP CTC PAL自动取样器将2μL等分提取的上清液注入岛津LC-20ADXR高效液相色谱系统。使用Phenomenex Synergi Hydro-RP 80 Au LC柱（4.0μm，30 mm×2.0 mm）在60°C下进行LC分离，梯度洗脱，流速为0.35 mL/min。二元流动相由储层a中超纯水中的0.1%甲酸和储层B中甲醇中0.1%甲酸组成。初始流动相由5%B组成，在1.5分钟内线性增加到70%B。然后将色谱柱在100%B下漂洗2.5分钟，然后在初始条件下平衡2分钟，总运行时间为6分钟。在这些条件下，分析物和IS分别在0.98和0.93分钟洗脱。使用SCIEX API 5500 Q-TRAP在正ESI模式下用串联质谱法检测分析物和IS，并监测以下质量转变：AZD1775 501.20−>442.20，crizotinib 450.10−>260.20。方法鉴定和生物分析运行均通过了我们的非GLP分析性能验收标准。二次模型（1/X²称重）在0.5至100 ng/mL范围内拟合校准品，相关系数（R）≥0.9982。定量下限（LLOQ）定义为峰面积信噪比为5或更大，与IS的基质空白相比为0.5 ng/mL。批内精密度和准确度分别为<6.28%CV和88.2%至107%。结果AZD1775浓度-时间（Ct）数据按矩阵和时间点分组，并使用R软件生成汇总统计数据（算术平均值、标准偏差、%CV、最小值、中间值、最大值）⁸然后使用Phoenix WinNonlin 6.4（Certara USA，Inc.，Princeton，NJ）对每个基质的AZD1775算术平均Ct数据进行非部门药代动力学分析（NCA）。应用血管外模型（模型202），并使用“线性上升-下降”方法估计Ct曲线下面积（AUC）值。终相被定义为Ct曲线末端的三个时间点，使用终相的未加权对数线性回归估计消除速率常数（Ke）。终端消除半衰期（T1/2）估计为0.693/Ke，从时间0到无穷大的AUC（AUCinf）估计为到最后一个时间点的AUC+预测的Clast/Ke。估计的其他NCA参数包括观察到的最大浓度（Cmax）、Cmax时间（Tmax）和最后一个观察到的时间点的浓度（Clast），碎屑时间（Tlast）、表观清除率（CL/F=剂量/AUCinf）和表观终末分布体积（Vz/F）。给药间隔（Cavg）的平均浓度估计为AUCinf/给药间隔小时数。AZD1775从血浆到肿瘤（Kp，肿瘤）的表观分配系数估计为可用时AUCinf，肿瘤和AUCinf-血浆的比值。为了估计与临床相关的小鼠剂量，将合成的小鼠血浆AUCinf和Cavg与报告的人类血浆PK值在假定的单药AZD1775最大耐受剂量或第2阶段推荐剂量下进行比较²³所有推论都是在小鼠和人类的非时间依赖性、线性和剂量比例PK假设下进行的。(硼替佐米）在单次腹腔注射（IP）1 mg/kg后，评估荷瘤雌性裸鼠（Jax Laboratories，年龄8-16周）的硼替佐米血浆和肿瘤PK。硼替佐米布（LC Labs，批号BBZ-106，纯度>99%，摩尔重量384.24）溶解在二甲基亚砜中，并用0.9%氯化钠进一步稀释以供注射，USP（NS，Baxter），在2%二甲基亚砜/98%NS中的最终标称浓度为0.1 mg/mL，注射体积为10 mL/kg。鉴于疗效研究所需的每周两次间歇给药，IP途径被认为是一种方便的方法。使用IACUC批准的方法在给药后10分钟、1小时、3小时、24小时和72小时处死小鼠，每个时间点3只小鼠。通过心脏穿刺用肝素钠收集全血，立即离心至血浆中，并储存在干冰上，以供研究剩余时间使用。然后通过主动脉用PBS灌注小鼠，切除RMS原位异种移植瘤，用PBS冲洗，并放在干冰上。在体内程序结束时，从干冰中转移所有样品，并将其置于-80°C下，直至分析。使用灵敏和特异的液相色谱-串联质谱分析法评估总血浆和肿瘤匀浆硼替佐米浓度。首先，对组织样品进行浸渍，用5:1体积的超纯水稀释，并用基于珠的技术进行均质²⁴在FastPrep-24系统上（MP Biomedicals，加州圣安娜）。将陶瓷溶珠基质（MP Biomedicals，Ceramic Bead lysing matrix，3mg/mg组织）添加到含有肿瘤样本的微离心管中。然后在FastPrep-24系统上对样品进行三次60 M/S的振动循环，每次1分钟。为了防止摩擦导致过热，在每个循环之间将样品放置在湿冰上5分钟。然后将匀浆储存在−80°C下，直至分析。硼替佐米（LC Labs，BBZ-106，纯度>99%）储备溶液在80%甲醇/20%超纯水和0.1%甲酸中制备，用于加标基质校准品和质量控制。血浆和组织匀浆样品各25μL，用10μL内标物（硼替佐米-d8，Toronto Research Chemicals，3-GBH-170-2，纯度98%）50 ng/mL加标溶液处理，然后用100μL含0.1%甲酸的乙腈沉淀蛋白质，剧烈旋涡1分钟，在4°C和13000g下离心5分钟。通过岛津SIL-20ACXR自动采样器将提取的上清液的3μL等分液注入岛津LC-20ADXR高效液相色谱系统。使用Phenomenex Luna C8 80 Au LC柱（4.0μm，30 mm×2.0 mm）在室温下进行LC分离，梯度洗脱，流速为0.25 mL/min。二元流动相由储层a中超纯水中的0.1%甲酸和储层B中乙腈中0.1%甲酸组成。初始流动相由30%B组成，在2分钟内线性增加至100%B。然后将色谱柱在100%B下漂洗2.5分钟，然后在初始条件下平衡2分钟，总运行时间为6.5分钟。在这些条件下，分析物和IS分别在2.56和2.53分钟洗脱。使用SCIEX API 4000在正ESI模式下使用串联质谱法检测分析物和IS，并监测以下质量转变：硼替佐米367.4−>226.2，硼替佐米布d8 374.8−>234.0。实验生物分析运行均被发现可用于单一非GLP临床前PK评估。线性模型（1/X²称重）在1至100 ng/mL范围内拟合校准品，相关系数（R）≥0.99。在校准范围以上，以足够的精度和准确度稀释质控样品。定量下限（LLOQ）定义为峰面积信噪比为5或更大，与IS的基质空白相比，由于稀释因子，血浆为1 ng/mL，组织为6 ng/mL。整个矩阵的批内精密度和准确度分别为<5.56%CV和87.1%至107%。将得到的硼替佐米浓度-时间（Ct）数据按矩阵和时间点分组，手动插补低于定量下限（BLOQ）的数据如下：如果在任何时间点≥2/3的Ct结果高于LLOQ，则BLOQ数据替换为½LLOQ值，ELSE将整个时间点的数据视为缺失。然后，使用Phoenix WinNonlin 6.4（Certara USA，Inc.，Princeton，NJ）生成Ct数据汇总统计数据（算术平均值、标准偏差、%CV、最小值、中位数、最大值），并对每个基质的硼替佐米算术平均Ct数据进行非部门药代动力学分析（NCA）。应用血管外模型（模型202），并使用“线性上升-下降”梯形规则估计Ct曲线下面积（AUC）值。终相被定义为Ct曲线末端的两到三个时间点，使用终相的未加权对数线性回归估计消除速率常数（Ke）。终端消除半衰期（T1/2）估计为0.693/Ke，从时间0到无穷大的AUC（AUCinf）估计为到最后一个时间点的AUC+预测的Clast/Ke。估计的其他NCA参数包括观察到的最大浓度（Cmax）、Cmax时间（Tmax）和最后一个观察到的时间点的浓度（Clast），碎屑时间（Tlast）、表观清除率（CL/F=剂量/AUCinf）和表观终末分布体积（Vz/F）。给药间隔（Cavg）的平均浓度估计为AUCinf/给药间隔小时数。硼替佐米从血浆到相关组织的表观分配系数（Kp，组织)估计为可用时AUCinf、组织与AUCinf血浆的比值。为了估计与临床相关的小鼠剂量，将合成的小鼠血浆AUCinf和Cavg与报告的人类血浆PK值进行比较，该值为假定的单药硼替佐米最大耐受剂量1.3 mg/m²治疗第11天静脉注射²⁵所有推论都是在小鼠和人类的非时间依赖性、线性和剂量比例PK假设下进行的。(Panobinostat）在一次性腹腔注射20 mg/kg（IP）后，评估雌性荷瘤裸鼠（Jax Laboratories，8–16周龄）的帕诺司他血浆和组织总PK。将帕诺司特（LC Labs，批号PNB-101，纯度>99%，MolWt 349.43）作为游离碱形式悬浮在5%葡萄糖中注射，USP（D5W，Baxter）标称浓度为2 mg/mL，注射量为10 mL/kg。考虑到啮齿类动物中报告的低口服生物利用度，选择IP途径，²⁶而且在已综述的小鼠研究中，这似乎是首选的途径^27,28在给药后15分钟、40分钟、2.25、8和24小时，采用IACUC批准的方法处死小鼠，每个时间点3只小鼠。通过心脏穿刺用肝素钠收集全血，立即离心至血浆中，并储存在干冰上，以供研究剩余时间使用。然后通过主动脉向小鼠灌注PBS，切除RMS原位异种移植物和组织，用PBS冲洗，并置于干冰上。在体内程序结束时，从干冰中转移所有样品，并将其置于−80°C的温度下，直至分析。使用灵敏且特异的液相色谱法和串联质谱法评估血浆和组织匀浆中的帕诺司他总浓度。首先，对组织样品进行浸渍，用5:1体积（对于肿瘤和大脑）或3.1-7.0:1体积（对于不同质量的视网膜和玻璃体）的超纯水稀释，并用基于珠的技术进行均质⁷在FastPrep-24系统上（MP Biomedicals，Santa Ana，CA）。将陶瓷溶出基质珠（MP Biomedicals，溶出基质D，10 mg/mg组织）添加到含有样品的微离心管中。然后在FastPrep-24系统上对样品进行三次60 M/S的振动循环，每次1分钟。为了防止摩擦导致过热，在每个循环之间将样品放置在湿冰上5分钟。然后将匀浆储存在−80°C下，直至分析。在甲醇中制备Panobinostat（LC实验室，批号PNB-101，纯度>99%）储备溶液，并用于加标基质校准品和质量控制。血浆和组织匀浆样品（各25μL）用100μL 240 ng/mL盐酸帕诺司他丁盐酸盐（多伦多研究化学品公司，P180502，批号5-KSS-175-5，纯度96%）在甲醇中沉淀蛋白作为内标。通过LEAP CTC PAL自动取样器将2μL等分提取的上清液注入岛津LC-20ADXR高效液相色谱系统。使用Waters XBridge BEH C18 LC柱（2.5μm，75 mm×2.1 mm）在60°C下进行LC分离，梯度洗脱，流速为0.35 mL/min。二元流动相由超纯水-100 mm甲酸铵，pH=3.0-甲醇（850:50:100 v/v）组成在储液罐A和甲醇-乙腈-100 mM甲酸铵中，储液罐B的pH值=3.0（475:475:50 v/v）。初始流动相由42.5%的B组成，并保持1.6分钟。然后在100%B下将色谱柱冲洗1.4分钟，然后在初始条件下平衡2分钟，总运行时间为5分钟。在这些条件下，分析物和IS分别在0.85和0.83分钟洗脱。

使用SCIEX API 5500 Q-TRAP在正ESI模式下用串联质谱法检测分析物和IS，并监测以下质量转变：panobinostat 350.18−>158.18，panobinotat-d8 357.91−>147.19。实验生物分析运行均被发现可用于单一非GLP临床前PK评估。线性模型（1/X²称重）在5至1000 ng/mL范围内拟合校准品，相关系数（R）≥0.99。定量下限（LLOQ）定义为峰面积信噪比为5或更大，与IS的基质空白相比，由于稀释因子，血浆为5 ng/mL，组织为30 ng/mL。血浆、大脑、视网膜和玻璃体的批内精密度和准确度分别为<0.312%CV和99.4%至113%。肿瘤基质显示出较差的精确度和准确性，其值分别为<1.79%CV和108%至119%。生成的帕诺司他浓度-时间（Ct）数据按矩阵和时间点分组，手动插补低于定量下限（BLOQ）的数据如下：如果在任何时间点≥2/3的Ct结果高于LLOQ，则BLOQ数据替换为½LLOQ值，ELSE将整个时间点的数据视为缺失。然后，使用Phoenix WinNonlin 6.4（Certara USA，Inc.，Princeton，NJ）生成Ct数据汇总统计数据（算术平均值、标准偏差、%CV、最小值、中位数、最大值），并对每个基质的panobinostat算术平均Ct数据进行非部分药代动力学分析（NCA）。应用血管外模型（模型202），并使用线性梯形法和稀疏采样选项估计Ct曲线下面积（AUC）值。终相被定义为Ct曲线末端的三个时间点，使用终相的未加权对数线性回归估计消除速率常数（Ke）。终端消除半衰期（T1/2）估计为0.693/Ke，从时间0到无穷大的AUC（AUCinf）估计为到最后一个时间点的AUC+Clast/Ke。估计的其他NCA参数包括观察到的最大浓度（Cmax）、Cmax时间（Tmax）和最后一个观察到的时间点的浓度（Clast），碎屑时间（Tlast）、表观清除率（CL/F=剂量/AUCinf）和表观终末分布体积（Vz/F）。给药间隔（Cavg）的平均浓度估计为AUCinf/给药间隔小时数。帕诺司他从血浆到相关组织的表观分配系数（Kp，组织)估计为可用时AUCinf、组织与AUCinf血浆的比值。为了估计与临床相关的小鼠剂量，将合成的小鼠血浆AUCinf和Cavg与报告的人血浆PK值在假定的单药帕诺司他最大耐受剂量或FDA批准的剂量下进行比较。所有推断都是在小鼠和人类中时间无关、线性和剂量比例PK的假设下进行的。

临床前测试

(临床前阶段I）使用无瘤裸鼠进行以下组合的耐受性试验：VCR+IRN、AZD1775+VCR+IR和帕诺司他+硼替佐米。小鼠接受4个周期的化疗，每个周期21天。所使用的化疗药物组合和时间表旨在模拟潜在的人类临床试验。每个治疗组包含3只小鼠。在第1天、第8天和第15天，每周腹腔注射一次长春新碱。伊立替康在第1-5天和第8-12天每天腹腔注射一次。AZD1775在第1-5天通过灌胃给药，每天两次。在第1天、第3天、第5天、第8天、第10天和第12天每天腹腔注射一次Panobinostat。在第1、4、8和11天每天腹腔注射一次硼替佐米。对每个治疗组的小鼠体重和标准全血计数进行监测。在整个治疗过程中，每天监测动物的健康状况。(临床前阶段II）采用上述肌肉注射技术，将来自SJRHB000026_X1（ERMS）、SJRHB012_Y（ERMS，ERMS）和SJRHB13759_X1的荧光素酶标记细胞注射到受体CD-1裸鼠体内，建立RMS原位异种移植物。每周用Xenogen筛选小鼠，并测量生物发光。小鼠在达到目标生物发光信号10后被纳入研究⁶–10⁷光子/秒/厘米²或2周以上，或可触及肿瘤，并于下周一开始化疗。进行了以下临床前II期试验(表S10)以下为：

SJRHB012_Y（术语）

AZD1775组和帕诺司他+硼替佐米组在两个独立的II期临床前试验中进行测试。在第一次试验中，小鼠被随机分为4个治疗组：AZD1775+VCR+IRN（低剂量延长计划）、AZD11775+VCR+IRN。第二次试验将小鼠随机分为两个治疗组，帕诺司他+硼替佐米和安慰剂。AZD1775的剂量为60 mg/kg，每天两次，连续服用1-5天。在第1-5天和第8-12天，IRN为1.25 mg/kg，每天腹腔注射一次。在第1-5天，这些小鼠也使用了另一种IRN方案，剂量为3.125 mg/kg，每天腹腔注射一次。这是临床上儿童最常用的两种时间表。在第1、3、5、8、10和12天每天腹腔注射长春新碱0.38 mg/kg。硼替佐米在第1、4、8和11天每天腹腔注射1 mg/kg。小鼠接受6个疗程的化疗，第一次试验每周监测一次生物发光，第二次试验每疗程（每3周）监测一次。根据生物发光信号对疾病反应进行分类。信号为10的老鼠⁵光子/秒/厘米²或更少（与背景相似）被归类为完全应答，10⁵–10⁶光子/秒/厘米²作为部分响应，10⁷最多10个⁸光子/秒/厘米²（与登记信号相似）为稳定疾病，且大于10⁸光子/秒/厘米²作为进行性疾病。任何时候肿瘤负担超过体重20%的小鼠也被归类为进行性疾病。在接受化疗的同时，每天对小鼠进行监测。

SJRHB013759_X1（臂）

AZD1775组和帕诺司他+硼替佐米组在两个独立的II期临床前试验中进行测试。在第一次试验中，小鼠被随机分为3个治疗组：AZD1775+VCR+IRN（低剂量延长计划）、VCR+IR（低剂量延迟计划）和安慰剂。第二次试验将小鼠随机分为两个治疗组，帕诺司他+硼替佐米和安慰剂。AZD1775的剂量为60 mg/kg，每天两次，连续服用1-5天。在第1-5天和第8-12天，IRN为1.25 mg/kg，每天腹腔注射一次。在第1、3、5、8、10和12天每天腹腔注射长春新碱0.38 mg/kg。硼替佐米在第1、4、8和11天每天腹腔注射1 mg/kg。小鼠接受6个疗程的化疗，第一次试验每周监测一次生物发光，第二次试验每疗程（每3周）监测一次。根据生物发光信号对疾病反应进行分类。信号为10的老鼠⁵光子/秒/厘米²或更少（与背景相似）被归类为完全应答，10⁵–10⁶光子/秒/厘米²作为部分响应，10⁷最多10个⁸光子/秒/厘米²（与登记信号相似）为稳定疾病，且大于10⁸光子/秒/厘米²作为进行性疾病。任何时候肿瘤负担超过体重20%的小鼠也被归类为进行性疾病。在接受化疗的同时，每天对小鼠进行监测。

（临床前阶段III）我们使用来自4种不同O-PDX系的140只小鼠进行了一项随机、双盲、安慰剂对照的临床前III期试验。采用上述肌肉注射技术，将来自SJRHB000026_X1（ERMS）、SJRHB012_Y（ERMS，SJRHB13757_X2（ARMS）和SJRHB 013759_X1的荧光素酶标记细胞注射到受体裸鼠体内，建立RMS原位异种移植物。每周用Xenogen筛选小鼠，并测量生物发光。小鼠在达到目标生物发光信号10后被纳入研究⁶–10⁷光子/秒/厘米²或2周以上，或可触及肿瘤，并于下周一开始化疗。接受化疗的患者和进行生物发光成像的患者对所服用的药物以及特定的O-PDX肿瘤细胞系一无所知。以下药物和剂量用于临床前III期试验，该试验基于药物动力学研究中获得的AUC引导剂量，与患者临床相关的人体剂量相匹配。AZD1775的剂量为48 mg/kg，每天两次，连续服用1-5天。在第1-5天和第8-12天，IRN为1.25 mg/kg，每天腹腔注射一次。在第1、3、5、8、10和12天每天腹腔注射长春新碱0.38 mg/kg。小鼠接受6个疗程的化疗（每个疗程3周），并在每个疗程的第3周和治疗结束时监测生物发光。根据上述生物发光信号对疾病反应进行分类。AZD1775用0.5%甲基纤维素、IRN和VCR在无菌生理盐水中重建，帕诺司他在5%葡萄糖和无菌水（D5W）中重建，硼替佐米在2%二甲基亚砜/98%无菌生理盐中重建。

氙气成像和量化

小鼠腹腔注射萤火虫D-荧光素（Caliper Life Sciences 3 mg/小鼠）。五分钟后，使用IVIS®200成像系统拍摄生物发光图像。在整个图像采集过程中进行麻醉（O中异氟醚1.5%₂以2升/分钟的速度输送）。使用Living Image 4.3软件（Caliper Life Sciences）生成包含最大生物发光信号下最大肿瘤的标准感兴趣区域（ROI）。使用相同的ROI来确定平均辐射（光子/s/cm²/sr）用于所有异种移植物。

我们感谢安吉拉·麦克阿瑟编辑手稿。这项工作得到了癌症中心支持（CA21765）、NIH向M.A.D提供的资助（EY014867、EY018599和CA168875）以及美国黎巴嫩叙利亚联合慈善机构（ALSAC）的支持。医学博士也得到了HHMI、Alex Lemonade Stand、Tully Family和Peterson Foundations的支持。E.S.得到了圣鲍德里克基金会和国家儿科癌症基金会（NPCF）的支持。