磷脂酰肌醇3-激酶在肌源性分化中的重要作用

摘要

在胚胎发生过程中，肌细胞谱系获得了更多的特化，其发育潜力逐渐受到限制。第一个被鉴定为肌源性分化重要调节因子的基因是MyoD(1，2). MyoD属于基本螺旋-环-螺旋肌调节因子（MRFs）家族，也包括myf5、肌生成素和MRF4。所有这些都在脊椎动物的肌肉发生中起作用；它们可以诱导非肌细胞表达肌肉特异性基因，并获得肌肉细胞的表型特征(2–6). 肌细胞增强因子2（MEF2）是MADS-box调节因子的一员，通过与MRF的相互作用加强肌原性测定和分化(7–9). Pax3蛋白可以作为这些肌肉特异性转录因子的调节器(10–13). 启动肌源性基因调控的上游信号的性质尚待确定。

癌基因的表达，如ras（拉斯维加斯）(14–19),src公司(20–24),myc公司(22，25，26)，或六月(27，28)通常抑制肌源性分化。最近发现的逆转录病毒癌基因v-3000像素，编码磷脂酰肌醇3-激酶（PI 3-激酶；EC）催化亚单位p110α的同源物2.7.1.137)，诱导培养的鸡胚成纤维细胞致癌转化并导致动物血管肉瘤(29). PI 3-激酶被几种生长因子激活(30)，在细胞信号传导中起着节点的作用，并与许多细胞功能有关，包括抗凋亡(31–40)，细胞生长(41)和细胞骨架结构的调节(42–44). 在这项研究中，我们发现癌基因3000像素可以调节肌源性分化，而PI 3-激酶活性是这一过程所必需的。

材料和方法

结果和讨论

为了研究v-P3k蛋白在肌源性分化中的潜在作用，我们使用鸡骨骼肌细胞的前体CEM。CEM发生肌源性分化在体外; 它们退出细胞周期，融合成多核肌管，并启动肌肉特异性基因程序。图。​图11一个通过证明PI3-激酶活性增加，记录了v-P3k蛋白在CEM中的表达。通过使用针对v-P3k蛋白的逆转录病毒Gag部分的多克隆抗体的免疫印迹证实了v-P3k在这些细胞中的存在（参考文献。29; 数据未显示）。v-P3k对CEM培养物的形态有显著影响。它增强了肌源性分化，诱导了多核肌管的形成，这些肌管明显大于对照培养物中的肌管。作为阴性对照，CEM表示src公司原癌基因未能像预期的那样分化（图。​（图11B类). v-P3k还提高了肌肉特异性基因的表达，高于单独感染RCAS载体的CEM培养物的分化水平。肌酸激酶（CK）活性在感染RCAS-v-P3k病毒后第4天开始增加，在第9天攀升至仅感染RCAS病毒的对照培养物水平的两倍以上。激活的Src激酶的表达将CK保持在分化前水平（图。​（图22一个). 与感染RCAS的成肌细胞相比，其他肌肉特异性蛋白在v-P3k表达中也同样上调。这些包括MyoD、肌球蛋白重链和结蛋白（图。​（图22B类). 为了确定肌源性分化是否需要PI3-激酶活性，我们使用PI3-激酶特异性抑制剂LY294002抑制CEM培养物中的内源性酶活性。将CEM培养物暴露于12.5μM浓度的LY294002中3天，强烈干扰肌管的形成（图。​（图3三 一个和B类). 在50μM LY294002下，肌管形成被完全抑制。PI 3-激酶抑制剂还以剂量依赖的方式干扰肌肉特异性蛋白的诱导。CK水平（图。​（图3三C类)、MyoD、肌球蛋白重链和结蛋白（图。​（图3三D类)与未经治疗的对照组相比，经LY294002治疗的CEM中的含量显著降低。肌动蛋白水平（图。​（图3三D类)细胞外信号调节激酶Erk1（数据未显示）不受抑制剂的影响。这些数据表明，PI 3-激酶不仅可以增强肌肉发生，起到速率限制成分的作用，而且对这一分化过程至关重要。PI3-激酶调节亚基的两个显性阴性突变体p85ΔiSH2-N和p85Δ的iSH2-C实验支持了这一结论(43)缺失突变体，缺乏调节亚单位p85与PI 3-激酶的催化亚单位p110相互作用所需的关键域。突变体通过干扰需要对接到p85的上游信号来阻止催化亚单位的激活。在CEM培养物中，这些来自鸟类复制能力（RCAS）载体的显性阴性突变体的表达抑制了肌管的形成（图。​（图44一个). 与单独感染空RCAS载体的CEM相比，它还降低了CK活性水平（显著性由Student’st吨测试：P（P）p85ΔiSH2-N和P（P）对于p85ΔiSH2-C，=0.006；图。​图44B类). 在对照实验中，RCAS-v-P3k显著增加CK活性和v-src公司抑制CK活性（图。​（图44B类). 其他肌肉特异性蛋白、MyoD、肌球蛋白重链和结蛋白的水平也被显性阴性突变体下调（图。​（图44C类). 这些结果表明PI3-激酶是控制MyoD表达的重要上游成分；通过诱导MyoD，它可能介导肌源性分化。最近一项关于胰岛素样生长因子在大鼠骨骼肌成肌细胞系L6E9培养物中诱导肌生成的机制的研究也证实了PI 3-激酶是这一过程中的一个重要成分(46). 这些结果证明了PI3-激酶在哺乳动物和鸟类来源细胞的肌源性分化中的一般作用。PI 3-激酶的组分活性形式，如培养中的v-P3k转化鸡胚成纤维细胞，并且在动物中致癌(29)然而，与其他癌基因不同的是，它们不仅不能干扰肌原性分化，而且强烈刺激肌源性分化。虽然癌基因诱导分化程序的情况并不常见，但这并非史无前例。致癌表达ras（拉斯维加斯）在PC12细胞中，可能通过丝裂原活化蛋白激酶的酪氨酸磷酸化导致轴突生长(47–49). v（v）-相对P19基因表达诱导胚胎癌细胞分化(50). 逆转录病毒癌基因v-滑雪也激活肌源性分化(51–53). 现在，进一步的工作必须确定引起PI 3-激酶分化诱导活性的所有上游信号和介导该活性的下游靶点。解释这种PI 3-激酶信号的组织特异性将是一个重大挑战。

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图1

(一个)表达v-P3k的CEM中PI3-激酶活性的增加。按照说明准备CEM(27)并且感染了逆转录病毒载体RCAS（第1道）或RCAS-v-P3k（第2道）。细胞在MG培养基中培养2天，然后在MD培养基培养3天，如材料和方法PI3-激酶活性测定在体外如前所述(29)磷脂酰肌醇3-磷酸；Ori，色谱图的来源。(B类)v-P3k增强肌源性分化。CEM感染RCAS载体、RCAS-v-P3k或布拉格株Rous肉瘤病毒A亚群（PR-A）并如上培养。感染后5天拍摄代表性区域的照片（×6.5客观，相对照）。

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图2

(一个)v-P3k诱导肌酸激酶（CK）活性。未感染的CEM或CEM感染了RCAS病毒或PR-A，如图所示。​图11在MG培养基中保存2天，然后保存在MD培养基。每天采集细胞，使用商业试剂盒（Sigma）检测CK活性。从两个（未感染和PR-A感染）或三个（RCAS和RCAS-v-P3k感染）独立实验（每个实验两个复制板）中获得平均±SE值。CK活性以每毫克总蛋白提取物每分钟形成的肌酸μmol表示（U/mg）。(B类)v-P3k诱导肌肉特异性蛋白。在感染后第8天，用RCAS载体（1区）、RCAS-v-P3k（2区）或PR-A（3区）从CEM中制备总蛋白。使用MyoD（Santa Cruz Biotechnology）、肌球蛋白重链（MHC）和结蛋白（ICN）特异性抗体，通过免疫印迹分析法分析肌肉特异性蛋白水平。用来自Sigma的抗体检测作为普遍表达对照的肌动蛋白。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。

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图3

(一个)PI 3-激酶特异性抑制剂LY294002抑制成肌细胞分化。CEM在播种后在MG培养基中培养1天，并在含有指示浓度的LY294002或二甲基亚砜溶剂的MD培养基上继续生长3天。第4天用LeukoStat试剂盒（Fisher）对细胞进行染色，以区分细胞质和细胞核，并拍摄代表性区域的照片（×16物镜，亮场照明）。(B类)LY294002抑制多核肌管形成。第4天的细胞如上所述染色，并在×16物镜下计数，以确定肌管中的细胞核百分比（每个细胞至少包含三个细胞核）。使用了三个独立的板，每个板有三个随机场。(C类)LY294002对CK活性的抑制。如图所示，在LY294002存在的情况下，用三个复制板在两个实验中测定第4天的CK活性。(D类)LY294002对肌肉特异性基因表达的抑制。如图所示，从用LY294002处理3天的CEM中提取总蛋白，并进行免疫印迹分析。​图22B类.

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图4

(一个)显性负性PI 3-激酶结构抑制肌生成。CEM感染了RCAS、PR-A或RCAS病毒，这些病毒表达PI3-激酶调节亚基的两个显性阴性突变体p85ΔiSH2-N和p85Δ的iSH2-C(43). 感染后在MG培养基中培养3天，然后在MD培养基上培养2天以诱导成肌细胞分化。在第5天拍摄代表性视野（×6.5物镜，相位对照）。(B类)显性负性PI 3-激酶突变体干扰CK的诱导。CK活性在如上所述感染CEM培养物或感染RCAS-v-P3k作为阳性对照物的CEM培养第6天测定。平均值±SE值来自两个实验和三个重复测定。(C类)显性负性PI 3-激酶突变体抑制肌肉特异性蛋白的表达。在感染PR-A（第1道）、RCAS（第2道）、RCAS-p85ΔiSH2-N（第3道）或RCAS-p85△iSH2-C（第4道）病毒后的第6天，研究细胞中的肌肉特异性蛋白质水平，并通过免疫印迹进行分析，如图所示。​图22B类在三个重复实验中获得了类似的结果。

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