FBW7型白血病细胞突变介导NOTCH通路激活及对γ-分泌酶抑制剂的耐药性

在一些T-ALL细胞系中，NICD水平很高，而在槽口1

用MRK-003处理后，可检测到细胞内蛋白的每个T-ALL细胞系中NICD水平降低，表明该化合物有效抑制了细胞表面NOTCH1的分裂(图1 E). 然而，20个T-ALL细胞系中只有一个子集具有GSI敏感的细胞表型，这表明无论是否有构成NOTCH信号的证据，都可以观察到耐药表型（即NICD未检测到表达；表一和图1 E). Western blot分析还表明，所有C末端截断突变的细胞系槽口1NICD高水平表达(表一和图1 E)，反映了NOTCH通路的异常激活。有趣的是，在槽口1也表达高水平的NICD（RPMI8402、CEM、BE13、DU528、HSB2、Jurkat和PEER），这意味着NOTCH通过非突变机制在这些细胞系中稳定槽口1.

FBW7型在T-ALL细胞系和原始样本中发生突变

NICD的细胞水平由蛋白质产生和破坏速率的净效应决定。SCF-FBW7泛素连接酶在依赖于NOTCH完整PEST结构域的NICD降解中起关键作用(25–30). 其他已知的FBW7底物包括cyclin E、MYC、SR-EBP和c-Jun(31). 在底物在高度保守的Cdc磷酸化试剂（CPD）中磷酸化后，FBW7通过其WD40重复序列形成的β螺旋桨与其底物相互作用(32,33). 人类肿瘤含有截断FBW7的无义突变以及针对WD40重复序列中关键精氨酸残基的错义突变。这些突变使FBW7与底物的相互作用失效，并损害FBW7对底物的降解(34–37). 肿瘤衍生等位基因中影响CPD的突变MYC公司和6月已被描述(38–41). 因此，去除或改变底物CPD的突变也可能导致FBW7失去调控。因为在人类T-ALL中发现的PEST域截断被预测会破坏FBW7与NICD的结合，我们假设FBW7型突变可能代表了人类癌症NOTCH失调的另一种机制。

为了验证这个假设，我们对FBW7型以确定影响该泛素连接酶基因的突变是否可以解释缺乏NOTCH1 PEST降解域截断的T-ALL细胞系中NICD的积累。的整个编码区域的排序FBW7型在20个T-ALL细胞系中，20个细胞系中有6个发生突变（30%）(表一). GSI耐药细胞株RPMI8402在465残基处存在精氨酸-组氨酸纯合突变；所有其他突变均为关键WD40精氨酸残基的杂合错义突变（465和505）。另外一个细胞系（BE13）有一个纯合子缺失FBW7型如通过定量DNA PCR测定的。NICD水平升高但无C末端截断突变的七种细胞系中的每一种槽口1（RPMI8402、CEM、BE13、DU528、HSB2、Jurkat和PEER）在FBW7型或基因纯合缺失，从而解释了NICD在这些系中持续表达(图1 E). 相反，没有一个细胞系FBW7型这些突变在槽口1这表明没有选择性压力FBW7型具有稳定NOTCH1的细胞发生突变。

我们还对编码底物结合域的外显子（外显子7、8、9、10和11）进行了测序FBW7型150份原发性急性髓细胞白血病（AML）样本、60份原发骨髓增生异常综合征（MDS）样本和81份原发T-ALL样本。尽管AML或MDS样本在FBW7型81份T-ALL样本中有7份（8.6%）在FBW7的底物结合域发生突变。患者样本中的所有突变都是杂合错义突变，改变了对底物结合至关重要的精氨酸残基(表二). 在T-ALL细胞系中，没有一个原始样本具有FBW7型该突变在槽口1这些结果表明FBW7型原发性T-ALL可能代表NOTCH放松调控的另一种机制，有助于病原体发生这种疾病。

NOTCH1 T2512区域包含FBW7磷酸化简并子

如上所述，FBW7介导的底物调控缺失可能是由于FBW7型自身或底物突变。已知NICD的PEST结构域可调节蛋白质稳定性，是原发性人类和小鼠T-ALL突变的热点(7,11). 此外，与NOTCH结合的FBW7依赖于完整的PEST域(27)强烈表明NOTCH CPD位于该区域内。人类NOTCH1 PEST结构域与其他FBW7底物的比对表明，人类NOTCH2中围绕苏氨酸2512（T2512）锚定的CPD共有基序。该残基在物种间以及NOTCH家族成员间高度保守(图2 A). 值得注意的是，T-ALL–相关槽口1在人类和小鼠肿瘤中发现的PEST突变发生在这个假定的CPD的上游或附近，表明这些突变可能会破坏其功能(7,11).

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图2。

NOTCH T2512A突变体显示出增加的稳定性和减少的与FBW7的结合。（A） 四种人类NOTCH蛋白以及不同物种的NOTCH蛋白质的比对表明，假定的NOTCH-CPD具有很强的保守性。已知CPD与NOTCH对齐以进行比较。（B） T2512A NOTCH突变体与WT FBW7结合不足，肿瘤衍生的FBW7精氨酸突变体（R465C）不再与WT NOTCH结合。按照指示转染细胞，并免疫沉淀FLAG-FBW7。样品经SDS-PAGE电泳和抗MYC标记（9E10）免疫印迹检测转染的Notch蛋白。按指示分析全细胞裂解物以验证转染的构建体的表达。（C） K562红白血病细胞系的共免疫沉淀试验表明，T2512A在造血细胞中与FBW7结合不足。对全细胞裂解物进行分析，以验证转染构建物的表达。（D） FBW7–Notch ICD相互作用不需要S2514的磷酸化。如上文B所示转染293a细胞并进行分析。（E） NICD优先与细胞核和核仁FBW7亚型结合。用所示质粒转染293a细胞，并按上文B所述进行分析。（F） 体内泛素化试验表明，NOTCH T2512A突变株对FBW7介导的泛素化具有抵抗力。如图所示转染293a细胞。制备细胞裂解物，并用抗HA抗体进行免疫沉淀，以去除泛素化蛋白。样品经SDS-PAGE电泳和9E10免疫印迹检测MYC-标记的NOTCH蛋白。对全细胞裂解物进行分析，以验证转染构建物的表达。（G） 与WT NOTCH相比，NOTCH T2512A突变体在293a细胞中的半衰期延长。用WT NICD或T2512A突变株转染293a细胞。48小时后，在体内用脉冲标记细胞³⁵S-蛋氨酸/半胱氨酸，在含有过量未标记蛋氨酸和半胱氨酸的培养基中追赶指定时间。用MN-1抗血清免疫沉淀转染的NOTCH蛋白，并对样品进行SDS-PAGE电泳。然后将凝胶暴露在x射线胶片上。

为了确定T2512区域是否包含功能性NOTCH CPD，我们检查了其在NICD和FBW7之间的结合作用中的作用。在这些研究中，我们使用了编码小鼠NICD的表达质粒，其中T2487对应于人类T2512（本文中使用人类编号来指代此CPD）。我们首先将T2512突变为丙氨酸（T2512A）并共同转染293细胞(图2 B)或K562红白血病细胞(图2 C)FBW7和NICD。由于FBW7与其底物的相互作用导致蛋白酶体的泛素化和降解，因此我们将底物结合与周转分离，以便我们可以观察到稳定的FBW7-底物相互作用。为了破坏这一途径，我们表达了两个先前描述的SCF突变体：（a）显性负性cullin-1（dnCul1），它与F-box蛋白相互作用，但不与泛素结合酶相互作用(42)和（b）FBW7的截断版本（称为Fb-WD），它编码WD40底物结合域，但缺少N末端域，包括F-box基序，因此无法与cullin-1和SCF关联(43). 在这两种情况下，我们发现与WT-NICD相比，T2512A NICD突变体与FBW7的结合显著降低(图2、B和C). 相反，锚定在苏氨酸2133周围的另一个可能的NOTCH1 CPD共识基序的突变(38)未影响FBW7绑定（未发布数据）。

由于T2512区域中的两个推定CDK8位点先前与FBW7的NOTCH降解有关（S2514和S2517），我们还测试了这些残基在FBW7结合中的作用(26). 我们发现FBW7结合被S2514A突变破坏，当S2514被磷酸化残基（S2514E）取代时，结合被恢复(图2 D). 尽管这些数据与S2514磷酸化在FBW7结合中的作用一致，但+2位置（相对于中央苏氨酸）的负电荷不是CPD的特征。因此，我们将S2514突变为脯氨酸，这符合CPD共识，并发现S2514P也恢复了FBW7结合。因此，尽管在+2位置允许负电荷，但FBW7结合不需要负电荷。我们还检测了NICD与三种FBW7亚型中的每一种的结合，这三种亚型位于不同的亚细胞区室中(44). 结果表明，NICD与FBW7α（核质）和FBW7γ（核仁）结合，但与FBW6β（细胞质）不结合，支持NICD与核内FBW7相互作用的观点(图2 E).

接下来，我们研究了T2512在引导FBW7介导的内源性NICD泛素化中的作用，并根据我们的结合研究，发现T2512A突变显著降低了NICD的泛素化(图2 F). 这种突变抑制泛素化的程度与C端PEST缺失（称为deltaCT）相似，后者在FBW7的泛素化中存在缺陷(27). 少量残留泛素化可能反映NICD与FBW7的基础的T2512A依赖性相互作用，也可能是由于其他NICD泛素化途径所致。最后，我们使用代谢标记和脉冲追踪来比较WT-NICD和T2512A突变体在293细胞中的半衰期。正如预测的那样，T2512A突变体的半衰期延长，反映了体内降解受损(图2 G). 总的来说，这些数据表明T2512区域包含一个功能性CPD，用于指导NOTCH和FBW7之间的结合作用。

GSI治疗导致T-ALL细胞亚群中MYC表达降低

最近的研究表明MYC公司是人类和小鼠T-ALL中NOTCH的直接靶点(20–22). 为了确定在我们的T-ALL细胞系小组中，MYC蛋白水平是否受到MRK-003治疗的影响，我们对一组19个T-ALL淋巴细胞的裂解物进行了Western blot分析，这些细胞分别用载体（DMSO）或1μM MRK-0033治疗3天(图3). 19个品系中的8个（Koptk1、HPB-ALL、DND41、RPMI8402、Molt13、PF382、Supt7和TALL1），包括所有测试的GSI敏感品系（Koptk 1、HPB-ALL、DND44和TALLI），经GSI处理后，MYC蛋白水平明显降低。其他10个品系中有4个（Loucy、Supt11、Supt13和Molt16）缺乏激活的NOTCH信号（即，通过Western blot分析无法检测到NICD；图1 E和表一)因此，我们预计GSI治疗不会影响这些系中NOTCH靶基因的表达。其余7个细胞系（Jurkat、Molt4、PEER、CEM、DU528、BE13和HSB2）激活了NOTCH信号，但在GSI处理后未显示MYC表达降低。值得注意的是，所有在GSI治疗后MYC表达没有降低的细胞系都对该药物具有耐药性，这进一步说明了该NOTCH靶基因对T-all细胞生长的重要性。因为MYC的过度表达被证明可以挽救GSI的生长抑制作用(20,21)在这些T-ALL细胞系中缺乏MYC下调可能导致其GSI抵抗。

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图3。

GSI治疗导致T-ALL细胞亚群中MYC蛋白水平降低。用1μM MRK-003或DMSO处理T-ALL细胞株3 d，并用RIPA裂解缓冲液制备全细胞裂解物。使用抗MYC和β-肌动蛋白抗体作为负荷对照进行Western blot分析。

由于MYC也是FBW7靶点，我们通过脉冲相分析检测了五种T-ALL细胞系（Molt4、DND41、KOPTK1、CEM和Jurkat）的子集中的MYC半衰期。虽然与B细胞淋巴母细胞系（JY）相比，每个细胞系的MYC半衰期都延长了(图4)，在含有突变的细胞系中没有增加FBW7型（CEM和Jurkat）与WT的比较FBW7型这一结果并不令人惊讶，因为几个淋巴细胞白血病细胞系和患者样本已被证明具有异常稳定的MYC(45). 因此，MYC可以在T-ALL细胞系中稳定，而无需FBW7型MYC降解途径其他成分突变导致的突变。此外，在某些情况下，FBW7的丢失可能导致亚细胞隔室（例如核仁）中的MYC稳定，而不会显著改变大量MYC的周转(44).

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图4。

T-ALL细胞系具有增加的MYC半衰期。（A） 带有WT的T-ALL细胞系FBW7型（Molt4、DND41和KOPTK1）在体内用脉冲标记³⁵S-蛋氨酸/半胱氨酸，在含有过量未标记蛋氨酸和半胱氨酸的培养基中追赶指定时间。在每个时间点从相同数量的细胞中免疫沉淀内源性MYC，并通过凝胶电泳进行分析。³⁵每个样品的S-标记MYC通过磷光成像仪进行定量。每个细胞系的MYC降解率在图中用最适合的指数线表示。根据指数线方程计算MYC的半衰期。（B） 在突变的T-ALL细胞系上进行了类似的脉冲期实验FBW7型（CEM和Jurkat）。与B细胞淋巴母细胞系JY细胞相比，所分析的所有T-All细胞系都增加了MYC半衰期。

我们还检查了MYC公司通过对18个经DMSO或MRK-003（1μM）处理3天的T-ALL细胞系进行表达阵列，对GSI处理的mRNA水平作出反应MYC公司表达NICD并发生突变的四个抗性系中的RNAFBW7型（CEM、BE13、DU528和HSB2）(图5). 因此，缺乏下调MYC公司通过GSI处理这些线路是由于作用于上游的机制MYC公司转录而非蛋白质水平。在微阵列表达分析中，其他NOTCH靶基因如DELTEX1公司和上海第一季度(22) (图5在CEM、DU528、BE13和HSB2细胞系中也不受GSI处理的影响。在PEER细胞系中FBW7型，我们用MRK-003治疗3d后检测NICD的残留表达，定量RT-PCR显示MYC公司和DELTEX1公司GSI处理后，该品系的RNA表达水平没有降低(图1 E且未描述）。这表明第7页在这五个品系中发现的突变（或纯合子缺失）通过NICD导致残留信号，即使在面临GSI治疗时，也是如此，从而维持MYC公司转录和促进细胞持续增殖。

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图5。

GSI处理突变体T-ALL细胞株后NOTCH靶基因没有减少FBW7型. MYC公司和德德士通过微阵列基因表达分析测定18个T-ALL细胞株在1μM MRK-003 GSI处理3d后的RNA水平（与DMSO处理的细胞相比）。值是日志₁₀表达水平比率MYC公司和DELTEX公司在MRK-003处理的细胞中，与DMSO处理的细胞相比。

细胞系。

T-ALL细胞系取自美国类型培养库或Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH。293a细胞由S.Reed（加州拉霍亚斯克里普斯研究所）提供。

MRK-003治疗T-ALL细胞系。

T-ALL细胞系以5×10的密度进行培养⁴–1.5 × 10⁵每毫升细胞数（取决于倍增时间），用二甲基亚砜或1μM MRK-003处理0小时、6小时、24小时、3天或7天。对于每个时间点，用台盼蓝排除法分析三个重复的烧瓶，以确定细胞活力。对于碘化丙啶染色以分析细胞周期谱，用PBS洗涤细胞，在含有50μg/ml碘化丙啶和200μg/ml RNase a的PBS缓冲液中染色，并在Becton Dickinson FACSCalibur仪器上分析。为了用膜联蛋白V染色法测定凋亡细胞的百分比，根据制造商的说明使用了膜联蛋白V-FITC（或膜联蛋白V-APC）凋亡检测试剂盒I（BD Biosciences）。

微阵列基因表达分析。

从培养细胞中分离的总RNA用于制备荧光标记的cRNA，并如前所述与DNA寡核苷酸微阵列杂交(55,56). 人类微阵列含有约21000个基因的寡核苷酸探针。微阵列上的所有寡核苷酸探针都是用喷墨技术（安捷伦技术公司）原位合成的(55). 杂交后，扫描阵列并记录每个探针的荧光强度。对阵列强度数据进行归一化和校正后，获得转录物丰度比率（实验值与对照值）。基因表达数据使用Rosetta Resolver基因表达分析软件（6.0版；Rosetta Biosoftware）进行分析。微阵列数据以登录号保存在GEO数据库中{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE8416”，“term_id”：“8416”、“extlink”：“1”}}GSE8416标准.

蛋白质印迹。

为了分析内源性蛋白表达，用MRK-003处理T-ALL细胞株3d，并在RIPA缓冲液中进行裂解。用9E10抗MYC抗体（1:500；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）和前面描述的裂解NOTCH1（Val1744）抗体（1:1000；细胞信号技术）对斑点进行探测(24)和抗β-肌动蛋白（1:7000；Abcam）用于负荷控制。使用SuperSignal West Femto ECL试剂（Pierce Chemical Co.）检测信号。对于转染，用9E10杂交瘤上清液（1:4）检测MYC标记蛋白，用HA-11（1:1000）检测HA标记蛋白，并用M2抗FLAG（1:4000；Sigma-Aldrich）检测FLAG标记蛋白。如前所述，这些抗体与G蛋白琼脂糖结合并用于免疫沉淀(57).

突变检测。

的整个编码区域FBW7型在从20个T-ALL细胞系中分离的基因组DNA中测序。的外显子7、8、9、10和11FBW7型对主要患者样本进行测序。所有测序均在Agencourt生物科学公司进行。残留物根据其在FBW7α亚型中的位置进行编号（GenBank RefSeq{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_033632”，“term_id”：“379991107”，“term_text”：“NM_033631”}}NM_033632号).

质粒和瞬时转染。

描述了以下表达质粒(43,44)：pFLAG-FBW7-α、-β和-γ；pFLAG-FbWD；pFLAG-FBW7-γ-R465H（也称为R298H）；以及HA-MYC、HA-dncul1和HA-ubiquitin。所有诱变均采用QuickChange方法（Stratagene）进行，并通过测序确认。FBW7公共区域R465H、R479Q和R505C中的点突变是通过以pFLAG-FBW7载体为模板的定点突变产生的。尽管同种型之间的编号不同，但为了简单起见，使用了α编号。CS2-mNICD-MT由R.Kopan（密苏里州圣路易斯华盛顿大学）提供。它编码从Val1744到WT蛋白末端的小鼠Notch1细胞内结构域，并在C末端包含六个框内MYC表位标签。该结构体的突变用于产生T2512A、S2514A、S2512E和S2514P突变体。PCR产生的deltaCT突变删除PEST结构域，但保留C末端MYC标记。如上所述，通过磷酸钙沉淀法转染293A细胞(57). 使用TENT缓冲液（50 MM Tris-Cl，pH 8.0，2 MM EDTA，150 MM NaCl，1%Triton X-100）在转染后36–48小时收集细胞(30)如前所述，使用蛋白酶和磷酸酶抑制剂，并通过免疫沉淀和Western blotting进行分析(57).

代谢标记和脉搏追踪。

如前所述进行NICD脉冲期分析(43). 总之，用编码MYC标记NICD或NICD T2512A的质粒转染293a细胞。转染后36小时，用缺乏半胱氨酸和蛋氨酸的培养基预培养细胞，用含有反式35S标记的培养基脉冲，用冷蛋氨酸培养基追踪细胞。在指定的时间点采集样本，并用抗Notch血清MN1免疫沉淀，这是一种识别NICD的小鼠单克隆抗体（由华盛顿州西雅图的I.Bernstein、Fred Hutchinson癌症研究中心提供）。MYC脉冲相位实验如前所述进行(45).

作者感谢Theresa Zhang、Leslie Carlini和Xudong Dai就mRNA分析进行的有益讨论；Hellen Kim讨论西方印迹法；Keith McKenna和Chitra Raghunathan提供技术援助；约翰·吉尔伯特（John Gilbert）负责编辑评论。

这项工作得到了默克研究实验室（给a.T.Look）、美国血液学会研究员学者奖（American Society of Hematology Fellow Scholar Award）、国立卫生研究院（1K08CA109124-01A2；给J.Grim）、国家卫生研究院拨款（R01CA84069和R01CA102742）和伯罗斯欢迎基金会（给B.E。以及哈佛医学院血液学培训拨款（给J.O'Neil）。

作者没有相互冲突的经济利益。