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.2006年9月；20(9):1572-81.
doi:10.1038/sj.leu.2404317。 Epub 2006年7月20日。

某些淋巴细胞白血病中c-Myc蛋白的异常稳定

S Malempati公司 1, D胫骨, M坎宁安, Y阿克卡里, S奥尔森, G风扇, R C西尔斯
附属公司

某些淋巴细胞白血病中c-Myc蛋白的异常稳定

S Malempati公司等。 白血病. 2006年9月.

摘要

c-Myc癌蛋白在大量造血恶性肿瘤中过度表达，转基因动物模型揭示了c-Myc在白血病和淋巴瘤的发生中的潜在作用。然而，大多数情况下c-Myc蛋白水平高的原因尚不清楚。我们研究了异常蛋白稳定是否是白血病细胞系和儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）患者原始骨髓样本中c-Myc过度表达的机制。我们发现，在大多数白血病细胞系和骨髓样本中，c-Myc蛋白的半衰期延长。在任何白血病细胞系中，c-myc基因都没有突变，这可能是c-myc稳定性增加的原因。然而，在含有稳定c-Myc的白血病细胞系中观察到两个保守位点苏氨酸58和丝氨酸62的异常磷酸化。此外，来自ALL细胞系的稳定的c-Myc对糖原合成酶激酶3beta的亲和力降低，该激酶在苏氨酸58磷酸化c-Myc并促进其降解。这些发现表明，丝氨酸62和苏氨酸58磷酸化控制的c-Myc降解途径的放松调控是一种新的机制，可增加已知参与造血恶性肿瘤的强效癌蛋白的表达。

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数字

图1
图1
c-Myc过度表达发生在缺乏c-myc公司基因扩增或编码序列突变。(一)c-myc公司基因扩增见于HL-60细胞，但不见于REH、SupB15或K562细胞。每个细胞系的100个细胞（20个中期和80个间期）通过FISH分析，使用c-myc公司探针（蓝色）和CEP8着丝粒探针作为8号染色体的标识符（绿色）。两个c-myc公司在第8染色体上的SupB15细胞中可见信号。四个c-myc公司在REH细胞中可以看到信号，其中两个位于第8染色体上，另外两个位于其他染色体上。c的三个信号-myc公司在K562细胞中发现三个CEP8，表明为8三体。除了两个正常c-myc公司8号染色体上的信号-myc公司基因扩增，以c块的形式-myc公司-在HL-60细胞系中检测到另一条中期染色体上的阳性信号和间期细胞中的多个信号（红色箭头）。(b条)白血病细胞系中c-Myc蛋白水平升高。从HL-60（AML）、K562（CML）、REH（ALL）和Sup-B15（ALL。Western blot分析采用25μ每个样本中的g蛋白。用C33抗c-Myc（1-5道）和N262抗c-Myc（6道和7道）以及抗肌动蛋白抗体探测印迹。(c（c）)HL-60、K562、REH和SupB15细胞中不存在c-Myc编码序列突变。每个细胞系的总RNA用于PCR逆转录，以扩增整个c-Myc编码区，并对其进行测序。四种白血病细胞系中的每一种细胞的c-Myc的Box I区域（布鲁基特淋巴瘤突变热点）的氨基酸与已知突变的CA46伯基特淋巴瘤细胞系进行了比较。
图2
图2
无c的白血病细胞系-myc公司突变或基因扩增已经稳定了c-Myc蛋白。(一)在REH、SupB15和K562白血病细胞系中，c-Myc的半衰期延长。白血病细胞、JY细胞和PBMC被脉冲标记体内具有35S-蛋氨酸/半胱氨酸，并在含有过量未标记蛋氨酸和半胱氨酸的培养基中追赶，时间如材料和方法所述。在每个时间点从等量细胞中免疫沉淀内源性c-Myc，并通过凝胶电泳进行分析。35每个样品的S-标记c-Myc通过磷光成像仪进行定量。每个白血病细胞系以及JY和正常PBMC的内源性c-Myc降解率在图中用最适合的指数线表示。c-Myc的半衰期根据指数线方程计算，并显示了每种细胞类型。这里显示的脉冲相位结果代表了每个细胞系的2-3个独立实验。(b条)表中显示了c-Myc在四种白血病细胞系、EBV转化的JY细胞和PBMC中的平均半衰期±标准偏差，这些细胞是根据每种细胞类型的2-3个独立实验计算得出的。(c（c）)蛋白酶体抑制使HL-60细胞中c-Myc水平的增加程度高于REH、SupB15和K562细胞。用10个μ米乳糖胱氨酸4小时以抑制蛋白酶体介导的降解。然后收集细胞，使用每个样品中的相同蛋白质进行凝胶电泳和Western blot分析。用c-Myc（N262）抗体和抗微管蛋白抗体对斑点进行检测。
图3
图3
与不稳定c-Myc细胞系相比，c-Myc更稳定的白血病细胞系显示丝氨酸62磷酸化水平增加。从REH、SupB15、K562和HL-60白血病细胞系以及CA46 Burkitt淋巴瘤细胞系制备全细胞裂解物。根据之前的分析测量，对提取物的总c-Myc进行标准化。进行凝胶电泳，并使用不同的IRDye二级抗体检测C33 pan-c-Myc抗体（小鼠）和磷酸化S62-c-Myc抗体（兔子）（1-4道）或C33抗体和磷酸化T58-c-Myc-抗体（兔子，6-9道），同时进行Western blot检测（见材料和方法）。所示的蛋白质印迹是三个独立实验的代表。使用奥德赛红外成像仪和LI-COR生物科学公司的软件检测并量化每个抗体的信号量（见材料和方法）。条形图（带s.e.）以黑色显示了Theonine 58磷酸特异性信号与总c-Myc信号的三个实验的平均比率，以灰色显示了四个白血病细胞系的丝氨酸62磷酸特异性信息与总c-Myc信号的平均比率。图中还显示了CA46 Burkitt淋巴瘤中的磷蛋白-丝氨酸62和磷蛋白-苏氨酸58信号，其57位存在已知的脯氨酸-丝氨酸突变（第5和10栏，以及图表）。
图4
图4
PI（3）K活性和抑制GSK3β对c-Myc的功能与ALL细胞系中c-Myc稳定性的增加有关。(一)PI（3）K抑制降低c-Myc稳定的ALL细胞株c-Myc蛋白水平；通过同时抑制蛋白酶体部分恢复。白血病细胞系用20μ米LY 294002带和不带10μ米如图所示。然后收集细胞，并使用抗c-Myc（N262）和抗tubin抗体通过凝胶电泳和Western blot分析蛋白质。(b条)Co-IP显示GSK3之间的相关性降低β以及c-Myc在具有稳定c-Myc的白血病细胞系中的表达。内源性c-Myc和GSK3β显示了每个所示细胞系的全细胞裂解物中的水平（输入）。使用C33（c-Myc）抗体偶联珠或对照（ctrl）A+G琼脂糖珠从这些裂解物中进行免疫沉淀（IP）。用C33和GSK3探测输入和IP斑点β抗体，如图所示。
图5
图5
儿童ALL患者骨髓样本中c-Myc蛋白半衰期延长。俄勒冈州健康与科学大学机构审查委员会同意后，从儿童急性淋巴细胞白血病患者中获取了储存的诊断性骨髓样本。在分析之前，将采集的样品解冻并保存在含有20%FBS的培养基中16–20小时。按照图2和材料与方法中的描述进行脉冲相分析。该图显示了检测到足够c-Myc用于定量和评估半衰期的六个样品的结果。作为对照，还对正常骨髓样本进行了脉冲追踪分析。显示的“正常骨髓”样本的结果代表了三个测试样本。每个样品的c-Myc蛋白半衰期显示。图中描述了四个c-Myc半衰期延长的样品和代表性正常骨髓样品的c-Myc降解速率。
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