Myc is a Notch1 transcriptional target and a requisite for Notch1-induced mammary tumorigenesis in mice

doi:10.1073/pnas.0603371103

.2006年6月13日；103（24）：9262-7。

doi:10.1073/pnas.0603371103。 Epub 2006年6月2日。

Myc是Notch1转录靶点，也是Notch1诱导小鼠乳腺肿瘤发生的必要条件

阿波斯托洛斯·克里纳基斯¹, 马蒂亚斯·萨博尔茨, 卡特琳娜·波利蒂, Kiaris河马, Spyros Artavanis-Tsakonas公司, Argiris Efstratiadis公司

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Myc是Notch1转录靶点，也是Notch1诱导小鼠乳腺肿瘤发生的必要条件

阿波斯托洛斯·克里纳基斯等。美国国家科学院程序. 2006.

.2006年6月13日；103（24）：9262-7。

doi:10.1073/pnas.0603371103。 Epub 2006年6月2日。

作者

阿波斯托洛斯·克里纳基斯¹, 马蒂亚斯·萨博尔茨, 卡特琳娜·波利蒂, Kiaris河马, Spyros Artavanis-Tsakonas公司, Argiris Efstratiadis公司

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¹哥伦比亚大学遗传与发展系，美国纽约州纽约市圣尼古拉斯大道1150号，邮编10032。

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摘要

为了探讨异常Notch1信号在乳腺癌发病机制中的潜在作用，我们使用了转基因小鼠模型。在这些动物中，小鼠乳腺肿瘤病毒LTR-驱动Notch1受体（N1（IC））组成活性胞内结构域的表达导致泌乳依赖性乳腺肿瘤的发展，该肿瘤随着腺体退化而退化，但在随后的妊娠中发展为非退化的侵袭性腺癌。Myc在这些肿瘤中的上调促使对乳腺癌发生中潜在Notch1/Myc功能关系的遗传学研究。乳腺上皮中Myc的有条件消融阻止了退化N1（IC）肿瘤的诱导，也降低了非退化癌的发生率，而非退化癌发生的潜伏期显著增加。分子分析表明，小鼠和人类Myc基因都是N1（IC）通过其下游Cbf1转录效应器作用的直接转录靶点。与这种机制联系相一致的是，在38%的受检人类乳腺癌中，Notch1和Myc的表达与免疫染色呈正相关。

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数字

**图1。**
N1的分子特性^集成电路-诱发乳腺肿瘤。(一个)处女（V）、怀孕（P）、哺乳（L）和退化后（PI）雌性小鼠WT乳腺以及退化（R）和非退化（NR）N1乳腺总细胞RNA的Northern blot分析^集成电路-诱导的乳腺肿瘤（每类两个标本）。同一膜被连续杂交（不剥离），用特定探针检测指示的RNA物种。亲属*Myc公司*对照组的水平约为V1.0、P2.0、L1.0和PI1.5。年增长约7倍*Myc公司*退化肿瘤中的表达与正常泌乳腺体中的数量相关。A类似*Myc公司*与相应的对照退行性后腺体相比，非退行性癌中检测到增加（≈7.5倍）。转基因N1的表达^集成电路导致内源性Notch1 mRNA上调（第mN1行，第5-8行）。在我们的条件下，对照标本中mN1转录物的水平低于Northern blot分析的检测限。使用荧光成像仪（分子动力学）对18S rRNA进行杂交（负载控制），以使定量数据标准化。(B类)Northern印迹分析显示*Myc公司*MMTV中的mRNA表达-*Myc公司*-诱发癌（约为正常值的45倍）大约是未复发N1的6倍^集成电路肿瘤。来自MMTV的抄本-*Myc公司*转基因结构（14）比内源性结构长*Myc公司*mRNA。车道1和2与Myc车道7和8相同一个（不同的曝光时间）。(C)使用MMTV的雌性小鼠哺乳期乳腺EcoRI消化DNA的Southern blot分析-*N1型*^集成电路/*Myc公司^{佛罗里达州}*/*^{佛罗里达州}*/*瓦普^cre公司*第二次妊娠后基因分型，以评估“floxed”（fl）中Cre介导的DNA切除水平（第2道）*Myc公司*基因座（Δ等位基因的产生）。对照DNA（floxed等位基因；lane 1）是从具有相同基因型的动物的非进展性肿瘤中制备的。(D类)比较Northern杂交分析*Myc公司*N1之间产后2周的mRNA表达水平^集成电路-携带MMTV的女性诱发退化性肿瘤-*N1型*^集成电路功能正常*Myc公司*背景（R；车道1和2；与Myc车道5和6相同一个)和MMTV的无瘤泌乳腺-*N1型*^集成电路/*Myc公司^{佛罗里达州}*/*^{佛罗里达州}*/*瓦普^cre公司*小鼠，其中Cre介导的重组（r）在*Myc公司*轨迹发生了。首次妊娠（第3和第4道）或第二次妊娠（第5道）后，从腺体中提取RNA。

**图2。**
乳腺肿瘤的组织病理学分析和免疫表型。(一个)哺乳期乳腺切片的比较（苏木精/伊红染色）。（放大倍率：×20。）标本来自携带*槽口1*^集成电路转基因，其中*Myc公司*基因要么被条件性切除(一和b条)或功能（控制）(*c（c）*). 在产后2周，在第一次(一)或一秒钟(b条和*c（c）*)怀孕。第一次怀孕后，在实验动物中只观察到占表面积<1%的微小且罕见的肺泡内固体病变(插入). （放大倍数：×400。）然而，在第二次怀孕后，检测到几个小乳头病变(b条，概述）。虽然它们在形态上与对照组相同(*c（c）*（概述），实验小鼠的病变较少，总体占肺泡表面积的4.2%，而对照组为14.5%（每个病变的面积分别为0.21±0.16和0.78±0.45 mm²分别为；*P（P）*< 10⁻⁶). (B类)Notch1的免疫组织化学染色（棕色反应产物）^集成电路和WT泌乳腺的Myc，以及MMTV小鼠的退化和非退化肿瘤-*N1型*^集成电路/*Myc公司^{佛罗里达州}*/*^{佛罗里达州}*/*瓦普^cre公司*基因型。（放大倍数：×400。）与Notch1阳性免疫反应相反，正常泌乳腺体缺乏Myc免疫染色。然而，在表达N1的转基因小鼠的非肿瘤上皮细胞中有高阳性的Myc免疫检测^集成电路(d日插入，基因型与*交流电*). 在退行性肿瘤中（与抗体)肿瘤中Notch1核染色强(b条，箭头），也存在于非肿瘤组织中(b条，箭头）。与退化肿瘤中Myc免疫反应的镶嵌模式相反(*e（电子）*，箭头），相邻的非肿瘤组织为Myc阴性(*e（电子）*，箭头）。缺口1^集成电路-诱导的非进展性癌对Notch1都有强标记(*c（c）*)和Myc(*（f）*). (C)携带MMTV LTR驱动的转基因动物中非进展性肿瘤的形态模式*槽口1*^集成电路(一)或*Myc公司*(b条)或在表达两种癌基因的双转基因小鼠中(*c（c）*). （放大倍率：×400。）Notch1的组织结构^集成电路-诱发的肿瘤大多是乳头状的(一，箭头），而Myc肿瘤由小的腺体成分和巢穴组成(b条，箭头）。双转基因动物的癌表现出由散布的小腺体组成的杂交结构(*c（c）*箭头）和大型实心乳头结构(*c（c）*，箭头）。在细胞水平(插图)，Myc肿瘤由带有不规则大细胞核的大细胞组成，并显示许多凋亡小体(b条插入，箭头），而Notch1肿瘤细胞较小，细胞核均匀，无凋亡小体(一插入). （放大倍数：×1000。）双转基因小鼠肿瘤的细胞特征与Myc肿瘤相似，包括存在凋亡小体(*c（c）* 插入，箭头）。(D类)人类乳腺癌的一个例子（连续切片）显示两种Notch都有强烈的核免疫反应^集成电路(一)和Myc(b条). （放大倍数：×400。）组织学上，这种癌的生长模式是小的、实心的、不规则的巢穴(*c（c）*苏木精/伊红染色）。（比例尺：一个1000微米；*澳大利亚* 插入,B类,C、和D类，50微米；*C嵌入*，20微米）

**图3。**
Kaplan–Meier无瘤小鼠生存曲线。小鼠的存活率（从出生日期到检测到可触及的N1^集成电路-通过标准秩检验对携带MMTV的对照组进行比较-*N1型*^集成电路并具有功能*Myc公司*（深绿色）和带有MMTV的女性-*N1型*^集成电路/*Myc公司^{英国国防部}*/*^{英国国防部}*/*瓦普^cre公司*基因型（红色），其中大多数乳腺上皮对*Myc公司*通过Cre介导的重组表达。为了进一步比较，还显示了MMTV的生存曲线-*Myc公司*转基因（蓝色）和MMTV-*N1型*^集成电路/MMTV（多媒体电视）-*Myc公司*双转基因（浅绿色）动物。

**图4。**
小鼠Cbf1结合位点分析*Myc公司*发起人。(一个)所示为鼠标示意图*Myc公司*通过激活最常用的启动子P2转录的第一外显子上游的基因5′侧翼区域。指出了推测的Cbf1结合位点（位点A–C）和用于ChIP实验的PCR引物的位置。(B类)ChIP测定。在所示示例中，来自非退化N1的染色质^集成电路-用抗Notch1（aN1）或Cbf1（aCbf1）抗体或对照兔IgG免疫沉淀诱导肿瘤，并使用指定启动子的特异性引物进行PCR分析。这个*Myc公司*启动子分析了位点A和B。*赫斯1*和*你好1*作为阳性对照；Cdc2a作为阴性对照。“输入”对应于PCR生成的产物（仍处于指数阶段；25个周期），使用从非免疫沉淀染色质（实验样品中使用量的10%）中提取的DNA作为模板，反应混合物中未添加抗体。(C)使用重组Cbf1蛋白片段和标记的寡核苷酸探针进行EMSA。Myc oligoB和oligoC分别跨越相应的Cbf1位点，如一个一种寡核苷酸，代表两个已知的Cbf1-结合位点*赫斯1*启动子作为阳性对照。（我们将这两个位点的存在归因于两条谱带的移动。）*Myc公司*寡核苷酸B（Bmut）和C（Cmut）以及一个不相关的loxP寡核苷酸作为阴性对照。在竞争分析中，未标记的Hes1、Bmut和Cmut寡核苷酸以50倍摩尔过量添加到结合混合物中。

**图5。**
荧光素酶报告分析。(一个)含有Cbf1结合识别位点（位点a）的人类和小鼠Myc启动子序列区域的比对。指示了启动子P1和P2的起始位点。图中显示了用作报告者的质粒结构片段（有关结合位点的定义，请参见图4一个). 在图中，假定的Cbf1结合位点（闭合卵形）是完整的，而在其他结构中，如图所示，一个或多个位点已被突变（开放卵形）。还显示了将小鼠和人类Myc启动子的较短片段与最小Junb基因启动子（阴影矩形）结合使用的结构。(B类)报告人分析结果。293T细胞与*雷尼利亚*荧光素酶质粒和表达Cbf1-VP16或对照质粒（空pcDNA3载体；模拟）的效应质粒，与显示在一个包含完整或突变的Cbf1结合位点。归一化后*雷尼利亚*计算每个报告者的荧光素酶活性、萤火虫荧光素素酶活性相对于对照质粒的活性。这些相对值（平均值±SEM）是在至少三个独立实验中测得的，用条形图中的条形表示。

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