Fbw7/hCDC4二聚化调节其底物相互作用

摘要

背景

Fbw7是芽殖酵母CDC4的哺乳动物同源物，可调节参与细胞生长和分裂的几种蛋白质的降解，包括cyclin E、c-Myc、c-Jun、Notch、Presenilin和SREBP[1-10]。Fbw7识别一个称为CPD（用于C类dc4（dc4）P（P）磷-D类egron），包含在这些基质中。Fbw7通过其F-box招募SCF泛素连接酶复合物的剩余部分，从而促进底物泛素化和蛋白酶体的快速降解[11]。哺乳动物细胞含有三种Fbw7亚型（Fbw7-α、Fbw7-1β和Fbw7-2γ），它们通过选择性剪接产生，分别定位于核质、细胞质和核仁[12-14].

在Fbw7底物的CPD中发现了许多与癌症相关的突变，使其对Fbw8调节不敏感。因此，Fbw7基因在大量肿瘤中被删除。此外，已经发现许多体细胞点突变通过过早终止蛋白质或禁用其底物识别域C末端WD40重复序列来消除Fbw7的功能[15].

8个WD40重复序列形成一个β-推进器结构，形成一个磷酸化磷脂结合囊，可以识别磷酸化的CPD[16]。目前已知的所有哺乳动物CPD都由中心磷酸化苏氨酸和脯氨酸（pT-P）组成。对于c-Myc、c-Jun、SREBP和可能的cyclin E等底物，+4位置的磷酸化丝氨酸作为GSK3的启动磷酸盐，以磷酸化中心苏氨酸。然而，除了GSK3的简单启动外，对于Fbw7的底物周转，在+4位置的负电荷似乎还有其他要求。

+4负电荷的这种作用的第一个证据来自对细胞周期蛋白E降解的研究。Fbw7对细胞周期蛋白E的转换依赖于T380的磷酸化，T380是中心磷酸三氢嘌呤[2，三，17，18]。我们之前确定S384是第二个磷酸化位点，在CPD的形成中起关键作用[19，20]。然而，我们注意到，Fbw7β或Fbw7-γ降解细胞周期蛋白E严格要求S384磷酸化，而Fbw7-1α对这种磷酸化的要求取决于Fbw7-2α和细胞周期蛋白E.的化学计量比。也就是说，相对于细胞周期素E而言，高Fbw-7α丰度可以克服S384磷酸化合的需要。此外，S384谷氨酸盐突变体（S384E）像野生型细胞周期蛋白E一样被降解，强调了负电荷而不是（引发）磷酸盐在该位置的重要性。Fbw7和SV40 Large T癌蛋白之间的相互作用进一步证明了+4负电荷的作用，该癌蛋白也通过CPD与Fbw6结合并干扰Fbw8的功能[21]。大T在+4位置含有谷氨酸，该残基对其与Fbw7的相互作用至关重要。事实上，Fbw7及其同系物的几乎每个底物都可能在+4位置以磷酸丝氨酸/苏氨酸或带负电荷的谷氨酸的形式提供负电荷（表​（表1）1) [三-5，10，17，18，21-27]。因此，+4负电荷高度保守，可能在底物调节中发挥中心作用。具有讽刺意味的是，这一规则的一个例外是研究得最好的CDC4底物Sic1，它包含许多不完美的CPD，这些CPD与CDC4相互作用[16]。然而，对于CDC4与CPD的结合，-1和-2位置也被证明是重要的，而不是+4，产生了稍微不同的共识：I/L-I/L/P-pTP<K/R>4，其中<K/R>是位置+2到+5的不受欢迎的残基[11]。虽然细胞周期蛋白E的T380脱基完全符合这一共识，但我们观察到Fbw7对S384磷酸化的额外需求。

因为裂变酵母Fbw7同源物pop1和pop2之前已经被证明会二聚体[28]，我们测试了Fbw7是否也能形成二聚体以及二聚体如何影响其功能。我们在F-box上游的所有Fbw7亚型共同区域发现了一个二聚结构域。不能二聚化的Fbw7突变体在细胞内的周转分析中对细胞周期蛋白E和c-Myc具有完全活性，这表明二聚化并不是Fbw8功能的严格要求。然而，我们发现二聚体缺陷的Fbw7和细胞周期蛋白E之间的稳定相互作用在很大程度上受损，单体Fbw6的细胞周期蛋白E转换完全依赖于磷酸化的S384，甚至Fbw8α亚型。我们的结果将Fbw7二聚化与CPD+4位置的负电荷联系起来，并指出Fbw7.底物转换的复杂性增加。

结果

Fbw7二聚结构域的鉴定

为了确定Fbw7是否可以形成二聚体，我们生成了Fbw7-α的标记或Myc-标记版本。这两个版本在293A细胞中瞬时表达，并分析细胞裂解物中的免疫沉淀物的相互作用。结果表明，Myc-tagged Fbw7α与Flag-taged Fbw7α有效地共沉淀（图。​（图1A），1安培)而仅由WD40重复序列组成的Fbw7的截断版本没有与全长Fbw7a相互作用。在来自相同裂解物（未显示）的相互免疫沉淀（抗Myc标签）中获得相同的结果。因此，与pop1和pop2一样，Fbw7α可以二聚。事实上，二聚化可能是F-box蛋白更常见的特征，因为β-TrCP也被证明可以形成二聚体[29].

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图1

Fbw7二聚结构域的定位（1）.一个：Fbw7α可以形成二聚体。将Fbw7α的Flag和Myc标记版本以及Flag标记的WD40结构域转染293A细胞，并通过免疫沉淀法与Flag抗体进行相互作用分析。用9E10抗体检测共沉淀Myc-tagged Fbw7α（上面板）。随后用Flag抗体对膜进行再防护（下面板）。Flag-Fbw7α对应于下带，Myc-Fbw7α则对应于上带。星号表示用于免疫沉淀的Flag抗体的重链。B类：N末端截断突变体的分析。Myc-tagged Fbw7α与Flag-taged Fbw7α或各种N末端截断突变体以及不再与CPD相互作用的Fbw6α点突变体共同表达。用Flag抗体免疫沉淀裂解液，并按指示进行探测。ΔN是指对应于Fbw7公共区域的无N端Fbw8构造。所有氨基酸数字反映了共同区域内的位置。截短突变体如下图所示。C类：二聚结构域开始微调。该分析与A中类似。星号表示用于免疫沉淀的Flag抗体的重链。

然后我们试图定义Fbw7α上二聚化所必需的区域。构建了一组N末端截断突变体，并对其与全长Fbw7α的相互作用进行了测试。该分析表明，所有三种Fbw7亚型都需要一个共同的区域（但缺乏亚型特异的N末端）才能与全长Fbw8结合（图。​（图1B）。1B年). 然而，M73截断突变体（从公共区域的蛋氨酸73开始）无法与Fbw7α结合，这表明M73上游的残基对二聚体至关重要。Fbw7二聚化不需要底物相互作用，因为不再识别CPD的癌相关Fbw7point突变体仍然与野生型Fbw7-α结合（图。​（图1B，1B年，最后一条车道）。

为了更精确地定义二聚体结构域，我们从M73上游开始产生了几个额外的截短突变体，并在上述联合免疫沉淀分析中对其进行了测试。这表明M67突变体（从共同区域的氨基酸67开始）仍然能够与Fbw7α结合，表明二聚体通过氨基酸67下游的一个结构域发生（图。​（图1C）。1摄氏度). 接下来，我们生成了一组C末端截断突变体，以确定二聚结构域的范围。如上述数据所示，在共同区域的氨基酸70处截短Fbw7α，消除了与全长Fbw7-α的二聚化（图。​（图2A）。2年). 终止于氨基酸80也不能实现二聚。然而，在氨基酸90终止Fbw7α后，与全长Fbw7-α的稳定结合恢复了约50%，并且在共同区域的氨基酸100处完全恢复。根据对截断突变体的分析，我们在氨基酸67（Δ69-72和Δ74-78）下游的全长Fbw7α中生成了两个相邻的缺失突变体，并对其进行了二聚缺陷测试。图​图2B2B型清楚地表明这两个突变体在二聚化方面严重受损。缺少氨基酸82至87的额外缺失突变体的二聚化也在很大程度上受到损害（未显示）。我们得出结论，Fbw7通过氨基酸67和至少90的共同区域之间的延伸结构域二聚化（参见模型，图。​图2C2摄氏度).

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图2

Fbw7二聚结构域的定位（2）.一个：C末端截断突变体分析。Fbw7α在共同区域（如下示意图）的70、80、90和100个氨基酸后终止，并按照A中的方法进行分析。随后用Flag抗体检测9E10印迹（用于检测Myc-tagged Fbw7-α）。B类：短缺失突变体消除二聚体。相同的试验，除了测试了两个短缺失突变体与全长Myc-tagged Fbw7α的结合。全长Flag-Fbw7α中缺失的氨基酸编号再次对应于它们在共同区域中的位置。C类：Fbw7剪接形式示意图，包括其WD40重复序列、F-box和二聚结构域。

因为我们将二聚结构域映射到Fbw7的共同区域，所以我们询问Fbw7-β和Fbw7-2γ是否也同二聚，以及不同亚型是否异二聚。通过联合免疫沉淀分析所有三种Fbw7亚型的Myc和Flag标记版本的相互作用。正如预期的那样，Fbw7β和Fbw7-γ亚型都可以同二聚体化（图。​（图3A）。3A级). 有趣的是，人们明显偏好同型而非异二聚体，这很可能反映了每种亚型的不同亚细胞定位。此外，一些亚型能够形成异二聚体，至少在293A细胞中过度表达时是如此。由于大量过度表达可导致Fbw7亚型泄漏到不同的亚细胞隔室中，因此我们使用5倍数量的质粒DNA重复此实验。这表明了一种更为明显的同质异二聚倾向，尤其是细胞质Fbw7β（图。​（图3B）。3B公司). 然而，在这些条件下，核仁Fbw7α和核仁Fbw7γ仍然能够有效地相互作用。

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图3

Fbw7亚型在细胞内相互作用（1）.一个：Fbw7的同源和异源二聚。按指示转染差异标记的Fbw7同种型，并用Flag抗体对裂解物进行免疫沉淀。B类：Fbw7α和Fbw7-γ异二聚体。与A中的分析相同，但每个亚型表达量低5倍。C类：Fbw7α和Fbw6γ在细胞中发生异二聚化。将生长在盖玻片上的U2OS细胞与Flag-Fbw7γ和Myc-tagged版本的Fbw7α、Fbw7-α二聚体突变体或Fbw7-β联合转染。盖玻片被固定，并与Flag和Myc抗体共同染色。

细胞内Fbw7二聚体

为了确定异二聚体可能是裂解后的伪影，还是实际发生在细胞中，我们通过固定细胞的免疫荧光分析了这些相互作用。U2OS细胞生长在盖玻片上，并在每个异二聚体组合中单独或与Myc-tagged Fbw7亚型一起转染每个单独的Flag-taged Fbw7亚型。然后通过免疫荧光分析标记的Fbw7的定位。如图所示​图3C，3C公司，核质Fbw7α蛋白的共同表达导致正常核仁Fbw7-γ蛋白在核质中定位错误，表明它们在细胞内相互作用，这取决于Fbw7-2α的完整二聚化结构域。相反，细胞质Fbw7β的共同表达并没有重新定位Fbw7-γ。与图中观察到的对同源二聚的偏好一致​图3A3A级和​和3B，3B公司，Fbw7α和Fbw6β在很大程度上不受任何其他亚型的共同表达的影响（未显示）。

我们还试图用这种方法检测同二聚体。为此，我们利用了我们之前描述的定位突变体，由于其核定位信号（NLS）的缺失，它们将Fbw7α和Fbw6γ同时放入细胞质中[13]。值得注意的是，Fbw7α的共同表达以二聚依赖的方式将两个NLS突变体重新定位到核质中，清楚地显示了它们相互作用的能力就地（图。​（图4）。4). 这些实验也在293A细胞中进行，结果类似（未显示）。总之，至少在体外表达时，所有三种Fbw7亚型都能在完整细胞中同源或部分异源二聚体化。这一观察结果可能对内源性Fbw7亚型的一般划分有所启示（见讨论）。

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图4

Fbw7亚型在细胞内相互作用（2）.Fbw7α的细胞质版本(一个)和Fbw7γ(B类)缺乏相应的核定位信号（NLS）与Myc-tagged Fbw7α或二聚化突变体以及与Flag和Myc抗体共同染色的盖玻片共同表达。中的所有图像都是至少三个独立实验的代表，也是在293A细胞中进行的（未显示）。

Fbw7功能不严格要求二元化

我们接下来测试了Fbw7二聚体突变体是否能够促进细胞周期蛋白E和c-Myc的转换。细胞周期蛋白E和CDK2在293A细胞中与野生型Fbw7α或二聚体突变体共表达，并通过western blotting分析细胞周期蛋白E的稳态水平。如图所示​图5A，5A级非二聚体缺失突变体（Δ74-78）和M73截断突变体都能降解与野生型Fbw7相似的cyclin E。与野生型Fbw7α相比，即使在滴定细胞周期蛋白E或Fbw8后，我们也没有观察到二聚突变体有任何明显的损伤（图。​（图5B5亿和​和5C）。5摄氏度). 二聚化缺陷型Fbw7也促进了c-Myc的周转（图。​（图5D）5天)并且很好地结合到SV40大T（未示出[21]). 因此，至少在这些类型的分析中，底物降解并不严格要求Fbw7二聚。

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图5

单体Fbw7激活.一个：Fbw7二聚化突变体对细胞周期蛋白E的转化。293A细胞转染活性细胞周期蛋白E（野生型CDK2）或非活性细胞周期素E（显性-阴性CDK2。通过免疫印迹法监测细胞周期蛋白E的稳定蛋白丰度（上面板）。随后对Fbw7和CDK2（中间面板）的相同膜进行了印迹。星号标记用于检测HA标记的CDK2的12CA-5抗体的交叉反应。选择了较短的CDK2曝光时间，如下部面板所示。B类：Fbw7化学计量比改变时的细胞周期蛋白E周转率。0.5μg cyclin E质粒与滴定量的野生型或二聚体缺陷型Fbw7α（分别为3、1、0.3和0.1μg）共同表达，并按照指示进行稳定蛋白丰度的印迹。C类：改变化学计量比时Fbw7的细胞周期蛋白E周转率。2μg Fbw7质粒或非二聚化突变体与细胞周期蛋白E（0.5、1、2和4μg）的增加量和如上分析的蛋白质水平共同表达。在这两个实验中，共表达了2μg CDK2（未显示）。D类：c-Myc降解不需要Fbw7二聚。如图所示，将c-Myc和Fbw7截短突变体联合转染，并通过western blotting分析其蛋白水平。ΔN是指无N端Fbw7，对应于Fbw7.的公共区域。所有截短突变体都从公共区域内指定的蛋氨酸开始。M158突变株不再含有F-box，因此处于非活性状态。

Fbw7二聚体的条件要求

Fbw7α在细胞周期蛋白E转换中对S384磷酸化的需求是有条件的，并且取决于Fbw7-化学计量比[20]。因此，我们测试了S384操作是否会通过Fbw7二聚化突变体影响细胞周期蛋白E的结合和周转。在293A细胞中，野生型细胞周期蛋白E或S384突变体与Fbw7α或二聚化突变体一起表达为丙氨酸或谷氨酸。然后通过western blotting分析细胞周期蛋白E的稳态丰度。图​图6A6A级证明野生型细胞周期蛋白E和S384E突变体均能被Fbw7α和二聚体突变体有效降解。正如预期的那样，Fbw7α也能够在这个化学计量比下消除S384A突变。然而，S384A突变株对非二聚体Fbw7α完全耐药（图。​（图6A），6A级)这与S384A和Fbw7突变体之间的化学计量比无关（未显示）。

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图6

Fbw7二聚作用.一个：二聚体缺陷Fbw7严格要求S384磷酸化以促进细胞周期蛋白E的周转。如图所示，将细胞周期蛋白E/CDK2或两个细胞周期蛋白E的S384突变体（S384A和S384E）与野生型或非二聚体Fbw7α共同转染至293A细胞。用抗体鸡尾酒检测裂解液中这些蛋白的稳态表达。星号表示交叉反应。B类：细胞周期蛋白E和Fbw7α之间稳定相互作用的分析。如图所示，将293A细胞与显性阴性Cul1一起转染。通过免疫共沉淀法检测Fbw7α与细胞周期蛋白E的结合。dnCul1与Flag抗体重链共迁移。星号表示重链交叉反应。将上板裂解物膜与抗体混合物孵育，以检测所有相关蛋白。

除了对GSK3的潜在启动作用外，S384磷酸化还参与T380 CPD的形成，并可能介导与Fbw7的直接接触[19]。因此，我们通过联合免疫沉淀法直接测试了Fbw7二聚体在与细胞周期蛋白E和S384突变体结合中的作用。为了捕捉这种短暂的相互作用，我们在另一个与图中相同的实验中共同表达了Cul1的显性负性版本，Cul1是SCF复合物的重要核心成分​图6A。6A级这可以防止细胞周期蛋白E的泛素化和降解，并使细胞周期蛋白E与Fbw7稳定结合[20]。对Fbw7α或二聚体突变体的裂解产物进行免疫沉淀，并对共免疫沉淀的细胞周期蛋白E进行免疫印迹（图。​（图6B）。6亿). 结果证实，与野生型细胞周期蛋白E相比，S384A突变体和Fbw7α之间的稳定相互作用受到很大损害。这不仅仅是因为该突变体的T380磷酸化降低（参见裂解物）。事实上，T380磷酸化的程度在S384A和S384E突变体之间是相当的，但只有S384E与Fbw7有效结合。这支持了+4中的负电荷直接促成Fbw7结合的观点。

另一方面，二聚化缺陷的Fbw7α在与野生型细胞周期蛋白E的结合中部分受损，并完全失去了与S384A突变体相互作用的能力（图。​（图6B），6亿)，即使是长时间曝光（未显示）。令人惊讶的是，尽管发现S384E突变体被单体Fbw7降解，但S384E未能恢复与Fbw7-α二聚体突变体的有效结合（比较图。​图6A6A级和​和6B）。6亿). 这种差异的原因尚不清楚，但可能反映了Fbw7的WD40重复序列中磷酸-胺与谷氨酸接触形成的差异。我们的研究结果的含义如图所示​图77.

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图7

Fbw7α二聚作用模型.一个：Cdk2（S384）和GSK3（T380）启动细胞周期蛋白E的破坏。超磷酸化的T380/S384降解子对单体Fbw7α具有高亲和力，Fbw7α与SCF的剩余部分结合，通过E2酶启动细胞周期蛋白E的泛素化(B类).C类：T380磷酸化egron内缺乏S384磷酸化的次磷酸化细胞周期蛋白E仍然可以被Fbw7α降解。然而，这种破坏途径需要Fbw7二聚体。二聚体招募第二个E2泛素结合酶（E2），这可能有助于延长相同的泛素链或启动另一条链。或者，二聚体的第二个Fbw7α组分实际上可能会接触细胞周期蛋白E内的另一个脱基，可能是T62脱基，并且可能有助于稳定底物相互作用。

讨论

我们已经证明人类Fbw7可以形成二聚体，并将二聚体结构域映射到F盒上游的一个区域。由于该结构域在所有Fbw7剪接变异体中都被保留，因此原则上Fbw6可能能够形成同源和异源二聚体。然而，我们和其他人之前已经证明Fbw7亚型定位于不同的亚细胞隔室[12，13，20]。由于缺乏合适的抗体，所有Fbw7定位研究都依赖于过度表达的标记Fbw6，所有结论都是从一次表达单个Fbw8亚型得出的。这里我们表明，至少在共表达时，一些亚型可以在细胞内相互作用，并通过异源二聚体改变其定位。这表明，除了通常将其定向到其位置的顺作用信号外，内源性Fbw7亚型的化学计量比和异二聚体的程度可能会影响其分区。目前尚不清楚内源性Fbw7亚型之间的二聚化（异源）程度。由于其丰度较低，我们目前无法检测内源性Fbw7蛋白，并且仅限于研究外源性表达的Fbw7。异源二聚体的一个有趣的结果是，一种Fbw7亚型可以通过将其导向另一个细胞地址来调节另一种亚型的活性。例如，Fbw7α和Fbw7-γ之间的异二聚程度可能调节核仁Fbw7-2γ的数量，从而调节核仁底物的活性。

除了可能影响异构体定位外，二聚化可能直接调节Fbw7的其他功能方面。例如，由于二聚体结构域与F盒相邻，我们最初测试了二聚体可能阻止与Skp1的相互作用，从而使Fbw7失活的想法。然而，我们没有发现这方面的证据，因为Skp1与单体和二聚体Fbw7结合不明显（未显示）。相反，我们发现了Fbw7二聚体调节某些底物的要求。我们的结果建立了Fbw7二聚化与细胞周期蛋白E的T380-CPD的+4位负电荷的存在之间的联系。我们的研究结果表明Fbw7的不同作用模式，并将Fbw8靶点分为三组。首先是通过谷氨酸盐、天冬氨酸盐或构成（启动）磷酸化始终提供+4负电荷的底物。该亚组可能不依赖Fbw7二聚体进行周转。第二种是底物，有时可能有条件地提供这种电荷，并可能根据环境提示改变其CPD亲和力。细胞周期蛋白E就是这个组的一个例子，当S384被磷酸化时，它可以独立于Fbw7二聚体降解，但依赖于S384对单体Fbw7的磷酸化（参见图中的模型​图7）。7). c-Myc也可能属于这一亚组，因为有人认为S62在作为T58磷酸化引物后发生去磷酸化[30]。然而，在我们的分析中，Fbw7对c-Myc的调节并不依赖于Fbw7-二聚体（图。​（图5D）。5天). 最后，一些底物可能永远不会提供这种电荷，因此它们的降解完全依赖于Fbw7二聚体。此类CPD可能会调节与Fbw7的弱相互作用，并可能完全依赖于与其他（弱）CPD的合作效应。这些底物的活性可能部分受Fbw7二聚化状态的控制，如果二聚化本身得到控制，则可能受到额外水平的调节。

Sic1需要至少六个磷酸化CPD才能被CDC4最佳破坏，每个CPD都有缺陷，因为没有+4负电荷，存在非有利的碱性氨基酸，或者两者兼而有之[11，16]。因此，Sic1的低亲和力CPD，如在S384上未磷酸化的细胞周期蛋白E，可能完全依赖CDC4二聚化实现有效转换。事实上，最近的研究表明，Sic1降解需要CDC4二聚体（Mike Tyers个人通信）。为什么低亲和力的CPD需要F-box蛋白二聚化尚不清楚，但也许它们的亲和力太低，以至于需要招募几个SCF复合物才能有效降解底物。二聚体Fbw7（或CDC4）在底物泛素化中的效率可能是两倍，因为两个SCF复合物可以招募两个E2泛素连接酶，这可能是低亲和力底物周转所必需的。

从我们的观察中产生了几个机械论观点。一种可能性是二聚化的Fbw7同时与两种不同的CPD结合，以增加底物亲和力并促进其底物的更有效的泛素化。该模型是解释Fbw7/CDC4与低亲和力CPD之间更短暂相互作用的合理解释，如图所示​图7D。第7天或者，二聚体可以通过二聚体的一个部分与单个CPD结合，而另一个部分仅仅招募第二个E2酶，这可能是为了更有效的泛素化（图​（图7C）。7摄氏度). 此外，二聚SCF可能会拉长相同的泛素链，作用于两条不同的链，或者当与不同的CPD结合时，可能有几个二聚体拉长单个泛素链。所有这些模型都可以以特定于基板的方式应用，甚至可以应用于同一基板内的不同CPD。

结论

我们的结果表明，Fbw7对某些底物的亲和力是另一种调节水平的基础，这种调节水平将CPD的负电荷+4位置与Fbw6形成二聚体的能力联系在一起。我们建议，不含+4电荷的弱CPD必须与另一个（弱？）CPD合作，或将第二个SCF引入同一低亲和力CPD，以便通过Fbw7二聚化有效破坏底物。

方法

竞争性利益

提交人声明他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

MW完成了所有实验并撰写了这份手稿。BEC编辑了这份手稿。两位作者都批准了这份手稿的最终版本。

证据中添加的注释

在修订这份手稿的同时，张和科普发表了一项类似的研究（Mol Cancer Res December 2006）。

致谢

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