白血病。作者手稿；可在PMC 2008年4月17日获得。
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尼姆斯：美国国立卫生研究院42996
某些淋巴细胞白血病中c-Myc蛋白的异常稳定
,1 ,2 ,2 ,2 ,2 ,三和2
S Malempati公司
1美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学儿科
D提比特斯
2美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学分子与医学遗传学系
M坎宁安
2美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学分子与医学遗传学系
Y阿克卡里
2美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学分子与医学遗传学系
S奥尔森
2美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学分子与医学遗传学系
G风扇
三美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学病理学系
RC西尔斯
2美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学分子与医学遗传学系
1美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学儿科
2美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学分子与医学遗传学系
三美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学病理学系
通信：俄勒冈州健康与科学大学分子与医学遗传学系RC Sears博士，地址：3181 SW Sam Jackson Park Rd.，Mac Hall 2141，L103A，Portland，OR 97239 USA。电子邮件：ude.usho@rsraes 摘要
c-Myc癌蛋白在大量造血恶性肿瘤中过度表达，转基因动物模型揭示了c-Myc在白血病和淋巴瘤的发生中的潜在作用。然而，大多数情况下c-Myc蛋白水平高的原因尚不清楚。我们研究了异常蛋白稳定是否是白血病细胞系和儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）患者原始骨髓样本中c-Myc过度表达的机制。我们发现，在大多数白血病细胞系和骨髓样本中，c-Myc蛋白的半衰期延长。c基因没有突变-myc公司任何白血病细胞系中可能导致c-Myc稳定性增加的基因。然而，在含有稳定c-Myc的白血病细胞系中观察到两个保守位点苏氨酸58和丝氨酸62的异常磷酸化。此外，ALL细胞系中稳定的c-Myc对糖原合成酶激酶3的亲和力降低β，在苏氨酸58处磷酸化c-Myc并促进其降解的激酶。这些发现表明，丝氨酸62和苏氨酸58磷酸化控制的c-Myc降解途径的放松调控是一种新的机制，可增加已知参与造血恶性肿瘤的强效癌蛋白的表达。
关键词：癌基因，泛素化，磷酸化，GSK3β，PI（3）K
介绍
c-myc公司原癌基因编码一种转录因子，与细胞的增殖、分化和凋亡等决定密切相关。1-5Myc蛋白在胚胎发生过程中广泛表达，c-myc公司导致胚胎死亡。6总的来说，c-Myc促进细胞生长和增殖，而c-Myc表达降低似乎是终末分化所必需的。1-5因此，控制c-Myc的表达对维持正常细胞中受调控的细胞增殖至关重要。
放松调控的c-Myc表达已被证明在癌症中发挥重要作用。c-Myc在大多数人类癌症中过度表达，转基因动物模型显示c-Myc诱导多组织肿瘤发生，包括白血病和淋巴瘤。7-10此外，c-Myc在许多人类造血系统恶性肿瘤中的高表达与预后不良有关。11在伯基特淋巴瘤中，c-myc公司转录由t（8；14）易位驱动，该易位将免疫球蛋白重链增强子与c并列-myc公司基因。12此外，c-myc公司在一些白血病细胞系中已经报道了基因扩增。13然而，在大多数白血病中，c-Myc过度表达的原因尚未阐明。
c-Myc在正常细胞中的表达受到生长刺激信号的严格调节。c-Myc表达的控制发生在转录、转录后、翻译和翻译后水平。14-16当静止的细胞被刺激进入细胞周期时，c-Myc蛋白迅速积累。c-Myc蛋白水平的短暂增加增强了S期的进入，并通过蛋白质的翻译后稳定而增强。17随着细胞周期的进展和持续增殖，c-Myc水平随后降低至低基础水平。持续循环细胞中c-Myc的清除和静止细胞中保持低水平的主要原因是泛素介导的快速蛋白水解。18,19
c-Myc蛋白的稳定和降解受蛋白质N末端附近两个特定位点的有序磷酸化控制：丝氨酸62和苏氨酸58。20这两个位置的磷酸化依次发生。21在生长刺激信号后，丝氨酸62磷酸化稳定c-Myc。随后苏氨酸58磷酸化促进26S蛋白酶体的泛素化和降解。22,23此外，蛋白磷酸酶2A（PP2A）去除稳定的丝氨酸62磷酸盐有助于c-Myc的多泛素化和降解。24
丝氨酸62和苏氨酸58的磷酸化受两条Ras依赖性途径调节。17,20激活第一条通路，即Raf/MEK/ERK（细胞外信号调节蛋白激酶）激酶级联，可以通过ERK介导的丝氨酸62磷酸化增强c-Myc蛋白的稳定性。第二条途径涉及磷脂酰肌醇3-激酶（PI（3）K）信号传导，也可以通过抑制糖原合成酶激酶（GSK）3促进c-Myc的稳定性β，其在苏氨酸58处磷酸化。随着增长刺激信号的减弱，GSK3β苏氨酸58激活c-Myc并磷酸化。25苏氨酸58磷酸化增强PP2A介导的丝氨酸62磷酸的去除，并允许E3泛素连接酶SCF识别，飞行重量7多泛素化c-Myc并以蛋白酶体介导的降解为目标。22-24这种翻译后控制的复杂机制对于正常细胞的增殖调节是重要的。
一些证据表明，由丝氨酸62和苏氨酸58磷酸化控制的c-Myc降解途径可能在癌症中发生破坏。例如，在58位从苏氨酸突变为丙氨酸的c-Myc表现出降解受损，并可促进原始人类细胞的转化。20,24此外，这种稳定的c-MycT58A突变可以加速动物模型中的淋巴腺病。26有趣的是，c-Myc苏氨酸58磷酸化位点或其附近的点突变在人类Burkitt淋巴瘤中常见。27,28这些突变阻止了苏氨酸58的磷酸化，并导致某些Burkitt淋巴瘤细胞中稳定的c-Myc蛋白。19,29,30c-Myc在其他人类造血系统恶性肿瘤中是否稳定还没有报道。
在本研究中，我们描述了人类白血病细胞中c-Myc蛋白的异常稳定。我们提供证据表明，某些白血病细胞系和主要患者样本中c-Myc的过度表达与c-Myc半衰期延长相关。c-Myc半衰期的增加发生在没有基因突变的情况下，如基因扩增或c-Myc基因突变-myc公司编码序列。此外，我们证明，在一些急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞系中，磷酸化/去磷酸化途径中存在调节c-Myc稳定和降解的特定异常。这些研究具有治疗意义，因为了解导致c-Myc异常表达的机制有助于直接识别新的靶向药物。
材料和方法
细胞系
REH、SupB15、K562、HL-60和CA46细胞购自美国型培养物收藏中心（美国马里兰州罗克维尔）。JY细胞是Grover Bagby（OHSU）慷慨赠送的礼物。所有白血病细胞系和JY细胞均保存在罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基中，该培养基补充了10%胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素和2米百万升-37°C下5%CO中的谷氨酰胺2将细胞保持在5×10的浓度之间5/ml和2×106/每周至少通过三次。
初级电池
俄勒冈州健康与科学大学的机构审查委员会同意获取冷冻保存的薄膜细胞，这些细胞最初是在诊断为小儿ALL患者时通过骨髓抽吸获得的。解冻后，细胞保存在RPMI 1640中，加入20%FBS和2m百万升-谷氨酰胺16–20小时后再进行分析。
从人血中制备外周血单个核细胞（PBMC）。对于每种制剂，从健康志愿者供体中抽取30 ml全血，放入无菌的乙二胺四乙酸（EDTA）试管中，用汉克平衡盐溶液（BSS）1:1稀释，并用Histopaque ficoll试剂分离。在1400转/分离心30分钟后，提取白细胞层。细胞用Hank的BSS清洗两次。细胞保存在含有20%FBS和2m的RPMI 1640培养基中百万升-谷氨酰胺。
荧光就地杂交
白血病细胞系按照标准方案生长。除培养基中含有植物血凝素外，原代患者样品按上述方法培养。收获时，添加最终浓度为150 ng/ml的Colcemid（Sigma，St Louis，MO，USA）。4-6小时后，将细胞胰蛋白酶化，置于含有5%FBS和75m的低渗培养基中米KCl，固定在滑梯上。将载玻片在90°C的PBS中烘焙6 min，在37°C下用2×SSC洗涤30 min，通过分级醇脱水，然后风干。c探头-myc公司（异硫氰酸荧光素）和8号染色体的着丝粒区（CEP8）（Aqua）（Abbott Laboratories，Abbott Park，IL，USA）混合，在75°C下变性10分钟，并在37°C下预退火30分钟。然后将探针添加到载玻片上，并使用HYBrite（Vysis，Downers Grove，IL，USA）进行杂交；72°C变性温度，2 min变性时间，37°C退火过夜）。第二天，用0.4×SSC/0.1%NP-40在73°C下清洗载玻片2分钟，用2×SSC/0.1%NP-40（Sigma，St Louis，MO，USA）在室温下清洗1分钟，然后用125进行复染μ克/μl 4'，6'-二氨基-2-苯基吲哚II（Vysi）。使用尼康E800荧光显微镜观察细胞，并使用Applied Imaging（美国加利福尼亚州圣何塞）的CytoVision软件捕获细胞。
抗体和试剂
c-Myc抗体N262和C33来自圣克鲁斯生物技术公司（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）。肌动蛋白和微管蛋白抗体来自Sigma（美国密苏里州圣路易斯）。如前所述制备c-Myc丝氨酸62磷酸特异性抗体。20苏氨酸58磷酸特异性和GSK3β抗体购自Cell Signaling Technology（美国马萨诸塞州贝弗利）。Lactacystin从哈佛大学EJ Corey实验室获得，LY294002从EMD Biosciences（美国加利福尼亚州圣地亚哥）购买。
蛋白质印迹和数据定量
使用溶菌酶缓冲液（20m）收集细胞米Tris（pH 7.5），50m米氯化钠、0.5%诺奈特P40、0.5%脱氧胆酸钠、0.5%十二烷基硫酸钠、1m米EDTA，10米米氟化钠，100米米钒酸钠，1μg/ml抑肽酶，1μg/ml胃蛋白酶抑制素，0.5μg/ml亮肽、0.2 mg/ml 4-（2-氨基乙基）-苯磺酰氟（AEBSF）和1.6 mg/ml碘乙酰胺）。使用BCA溶液试剂盒（美国密苏里州圣路易斯Sigma）测定用抗体缓冲液制备的每个样品的蛋白质浓度。或者，在SDS样品缓冲液中溶解相同数量的细胞，并调整相同的肌动蛋白水平。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离每个样品的等蛋白，并转移到Immobilon-P或Immobilon-FL膜（Millipore，Billerica，MA，USA）。使用Odyssey封闭缓冲液（LI-COR Biosciences，Lincoln，NE，USA）或含0.05%吐温-20的PBS中5%的非脂肪乳封闭膜。主要抗体位于Odyssey阻断缓冲液中，但抗磷酸-三氢嘌呤58除外，后者存在于2.5%的非脂肪乳中。使用标记有近红外荧光染料IRDye800（美国宾夕法尼亚州罗克兰市）和Alexa Fluor 680（美国俄勒冈州尤金市分子探针公司）的二级抗体检测一级抗体，以便进行双色成像和波段重叠。二级抗体在奥德赛封闭缓冲液中以1:10000稀释，用LI-COR奥德赛红外成像仪（Lincoln，NE，USA）扫描印迹，使蛋白质可视化，并允许同时进行抗兔和抗鼠双波长检测。使用1.2版LI-COR Odyssey红外成像仪软件进行背景减除后，对蛋白质印迹的条带强度进行量化，该软件允许进行四个数量级以上的线性蛋白质浓度分析。使用Excel计算误差线（Microsoft、Redmond、WA、USA）。
对c进行排序-myc公司编码区
从每个细胞系中分离出总RNA，并进行逆转录以生成cDNA，然后进行PCR扩增整个c-myc公司编码区，然后对其进行测序。
脉冲相位实验
细胞被放置在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中我-蛋氨酸和我-半胱氨酸与10%的FBS透析15分钟。然后标记细胞体内具有35DMEM培养基中的S-蛋氨酸/半胱氨酸（Perkin-Elmer，Boston，MA，USA）(-我-满足/我-对于白血病细胞系和JY细胞，使用10%的FBS透析20–30分钟；对于原发性白血病骨髓细胞、正常骨髓细胞和PBMC，由于其代谢速度较慢，使用2–4小时。然后用含有10%FBS的RPMI和5m的“chase”培养基清洗细胞一次百万升-蛋氨酸和3m百万升-半胱氨酸。将相同数量的细胞在追踪培养基中培养至指定的追踪时间，然后在抗体缓冲液中采集，如前所述。17使用c-Myc C33单克隆抗体结合珠（Santa Cruz Biotechnology），在每个时间点从相同数量的细胞中免疫沉淀标记的c-Myc。免疫沉淀的c-Myc通过SDS-PAGE分离，并使用前面描述的磷光成像仪对标记的c-Myc进行定量。17背景减除后，使用Microsoft Excel绘图功能在对数刻度上绘制每个时间点的谱带强度，并根据指数线方程确定c-Myc半衰期。
协同免疫沉淀
在10×细胞体积的免疫共沉淀（Co-IP）缓冲液（20m米Tris，pH 7.5，12.5%甘油，0.2%NP-40，200米米氯化钠，1米米EDTA，1米米四乙酸乙二醇酯，1m米10m二硫苏糖醇米氟化钠，100米米钒酸钠，1μg/ml抑肽酶，1μg/ml胃蛋白酶抑制素，0.5μg/ml亮氨酸肽、0.2 mg/ml AEBSF和1.6 mg/ml碘乙酰胺），并用蛋白A+g琼脂糖预先清除（Calbiochem，加州圣地亚哥，美国）。然后用1:50稀释的抗c-Myc（C33）结合珠（Santa Cruz Biotechnology）或对照蛋白A+G琼脂糖培养样品。沉淀蛋白在10×细胞体积的Co-IP缓冲液中洗涤三次，在SDS样品缓冲液中煮沸释放，并用SDS-PAGE分离。转移凝胶并进行Western blot分析。
结果
c-Myc在没有c-myc公司基因扩增或编码序列突变
据报道，c-Myc在大多数癌症中过度表达，包括各种类型的白血病。2,11,31,32在某些情况下，c-myc公司基因扩增已被描述。我们评估了c-myc公司两种前体B-ALL细胞系（REH和SupB15）、一种急性髓性白血病（AML）细胞系（HL-60）和一种慢性髓性白血病细胞系（K562）的基因状态和c-Myc蛋白表达。评估c的存在-myc公司OHSU细胞遗传学实验室对四种白血病细胞系的基因扩增进行荧光检测就地使用c进行杂交（FISH）-myc公司探针(). 与之前的报告一致，我们发现c的扩增-myc公司基因，以一大块c的形式-myc公司信号阳性物质，位于HL-60细胞系第8号染色体以外的染色体上（红色箭头）。13相反，剩下的三个细胞系中，没有一个具有大的扩增序列块，也没有一个能够被FISH用c-myc公司探查。两个正常c-myc公司信号出现在SupB15细胞系的第8染色体上。一个额外的c-myc公司K562细胞系因8三体而出现信号。两份额外的c副本-myc公司位于REH细胞系中除第8染色体外的其他染色体上，没有基因扩增。因此，只有在HL-60细胞系中，我们才发现c-myc公司基因扩增。
c-Myc过度表达发生在缺乏c-myc公司基因扩增或编码序列突变。(一)c-myc公司基因扩增见于HL-60细胞，但不见于REH、SupB15或K562细胞。每个细胞系的100个细胞（20个中期和80个间期）通过FISH分析，使用c-myc公司探针（蓝色）和CEP8着丝粒探针作为8号染色体的标识符（绿色）。两个c-myc公司在第8染色体上的SupB15细胞中可见信号。四个c-myc公司在REH细胞中可以看到信号，其中两个位于第8染色体上，另外两个位于其他染色体上。c的三个信号-myc公司在K562细胞中发现三个CEP8，表明为8三体。除了两个正常c-myc公司8号染色体上的信号-myc公司基因扩增，以c块的形式-myc公司-在HL-60细胞系中检测到另一条中期染色体上的阳性信号和间期细胞中的多个信号（红色箭头）。(b条)白血病细胞系中c-Myc蛋白水平升高。从HL-60（AML）、K562（CML）、REH（ALL）和Sup-B15（ALL。Western blot分析采用25μ每个样本中的g蛋白。用C33抗c-Myc（1-5道）和N262抗c-Myc（6道和7道）以及抗肌动蛋白抗体探测印迹。(c（c）)HL-60、K562、REH和SupB15细胞中不存在c-Myc编码序列突变。每个细胞系的总RNA用于PCR逆转录，以扩增整个c-Myc编码区，并对其进行测序。四种白血病细胞系中的每一种细胞的c-Myc的Box I区域（布鲁基特淋巴瘤突变热点）的氨基酸与已知突变的CA46伯基特淋巴瘤细胞系进行了比较。
接下来，我们通过Western blotting评估了四种白血病细胞系中的c-Myc蛋白水平。我们发现所有四种白血病细胞系中c-Myc蛋白水平都升高，HL-60细胞中的水平最高(). 相反，来自健康供体的正常PBMC和经EB病毒（EBV）转化的人类B淋巴细胞系JY的c-Myc蛋白水平都很低。我们在所有四种白血病细胞系中观察到的高c-Myc水平证实了先前关于c-Myc在白血病细胞中过表达的报道。11,31然而，除了HL-60细胞外，它能扩增c-myc公司，这些白血病细胞系中c-Myc水平升高的原因尚不清楚。
探讨无c-Myc的白血病细胞株中c-Myc表达增加的机制-myc公司基因扩增，我们最初寻找可能影响c-Myc蛋白周转的突变。c编码区的突变-myc公司苏氨酸58或其邻近物会导致蛋白酶体介导的降解受损，常见于Burkitt淋巴瘤和AIDS相关淋巴瘤。27,33-35为了发现研究中的白血病细胞系中是否存在突变，我们对整个c-myc公司四个白血病细胞系中每个细胞的编码区。未发现编码序列突变(). 综上所述，这些结果表明，在一些白血病细胞系中观察到的c-Myc过度表达可能发生在缺乏c-Myc的情况下-myc公司基因改变。
c-Myc蛋白在没有c-myc公司突变或基因扩增
翻译后控制c-Myc蛋白的稳定性对于防止癌蛋白在正常细胞中过度表达非常重要。36为了评估c-Myc蛋白的异常稳定是否可以解释正在研究的白血病细胞系中c-Myc的高表达，我们进行了35S-甲硫氨酸/半胱氨酸脉冲追踪分析，直接测量c-Myc在REH、SupB15、K562和HL-60细胞系中的半衰期。对于对照组，对来自健康供体的PBMC和EBV转化的B淋巴细胞系JY进行c-Myc的脉冲相分析。如所示三种白血病细胞系（REH、SupB15和K562）的c-Myc转换速度慢于PBMC或JY细胞。有趣的是，HL60细胞的半衰期与JY细胞相似。根据多项独立实验，c-Myc在REH细胞中的平均半衰期（±s.e.）为62.0±7.4 min，在SupB15细胞中为69.7±7.8 min，而在K562细胞系中为41.5±4.1 min(). 相比之下，c-Myc在HL-60细胞中的半衰期为20.5±0.3分钟，而在JY细胞中为20.9±3.3分钟，在PBMC中为12.1±1.9分钟。在没有特异性细胞因子刺激的情况下，PBMC在培养中不会增殖，其c-Myc的短半衰期与报道的c-Myc在静止细胞中的半衰期一致。17,20然而，EBV转化的人类B淋巴细胞系JY具有高度增殖性，其c-Myc的平均半衰期为20分钟，这与之前关于c-Myc在增殖细胞中半衰期的报道一致。37,38与其他白血病细胞系相比，HL-60细胞系中的c-Myc周转相对较快。因此，我们得出结论，c-Myc在HL-60细胞中没有显著稳定。总之，高c-Myc水平可能与基因扩增（HL-60细胞株）或蛋白质稳定（REH、SupB15和K562细胞株）有关。
无c的白血病细胞系-myc公司突变或基因扩增已经稳定了c-Myc蛋白。(一)在REH、SupB15和K562白血病细胞系中，c-Myc的半衰期延长。白血病细胞、JY细胞和PBMC被脉冲标记体内具有35S-蛋氨酸/半胱氨酸，并在含有过量未标记蛋氨酸和半胱氨酸的培养基中追赶，时间如材料和方法所述。在每个时间点从等量细胞中免疫沉淀内源性c-Myc，并通过凝胶电泳进行分析。35每个样品的S-标记c-Myc通过磷光成像仪进行定量。每个白血病细胞系以及JY和正常PBMC的内源性c-Myc降解率在图中用最适合的指数线表示。c-Myc的半衰期根据指数线方程计算，并显示了每种细胞类型。这里显示的脉冲相位结果代表了每个细胞系的2-3个独立实验。(b条)表中显示了c-Myc在四种白血病细胞系、EBV转化的JY细胞和PBMC中的平均半衰期±标准偏差，这些细胞是根据每种细胞类型的2-3个独立实验计算得出的。(c（c）)蛋白酶体抑制使HL-60细胞中c-Myc水平的增加程度高于REH、SupB15和K562细胞。用10个μ米乳糖胱氨酸4小时以抑制蛋白酶体介导的降解。然后收集细胞，使用每个样品中的相同蛋白质进行凝胶电泳和Western blot分析。用c-Myc（N262）抗体和抗微管蛋白抗体对斑点进行检测。
具有稳定c-Myc的白血病细胞系损害了26S蛋白酶体介导的降解
c-Myc蛋白水平的正常控制需要泛素化和26S蛋白酶体介导的降解。18,19在c-Myc正常周转的细胞中阻断26S蛋白酶体会导致蛋白质的积累。相比之下，蛋白酶体抑制对已经受损c-Myc降解的细胞中c-Myc水平的影响要小得多。因此，我们评估了化学抑制26S蛋白酶体是否会对具有不同c-Myc蛋白稳定性水平的细胞产生不同的影响。
REH、SupB15、K562和HL-60细胞用26S蛋白酶体的特异性抑制剂乳酰蛋白酶蛋白处理4小时。如所示蛋白酶体抑制对三种白血病细胞系（REH、SupB15和K562）中c-Myc水平的影响不大，其中c-Myc更稳定（1-6通道）。相反，乳糜蛋白酶处理HL-60细胞后，c-Myc蛋白显著增加(，第7和第8车道）。因此，虽然HL-60细胞由于c-myc公司基因扩增，蛋白酶体抑制后c-Myc显著增加，反映了这些细胞中c-Myc的不稳定性和正常快速转换。这些发现表明，在三种对乳酸菌素影响较小的细胞系中，26S蛋白酶体介导的降解上游存在扰动，导致c-Myc半衰期延长。
在具有稳定c-Myc蛋白的白血病细胞系中，丝氨酸62和苏氨酸58磷酸化c-Myc的水平发生改变
先前的实验表明，在正常c-Myc降解途径中，丝氨酸62磷酸化先于苏氨酸58磷酸化。20,21然而，多泛素化c-Myc主要在苏氨酸58处磷酸化，丝氨酸62磷酸化很少。20,24因此，苏氨酸58的磷酸化和随后在丝氨酸62的去磷酸化对c-Myc的多泛素化和及时降解都很重要。24我们使用磷酸特异性抗体评估了正在研究的白血病细胞系中丝氨酸62和苏氨酸58处c-Myc的磷酸化状态。对总c-Myc和磷酸化c-Myc进行双重标记，使我们能够定量磷酸化系列62 c-Myc与总c-Myc的比率，以及磷酸化三烯58 c-Myc对总c-Myc的比率(，图）。如所示在HL-60细胞中，我们检测到很少的丝氨酸62磷酸化c-Myc，而苏氨酸58磷酸化c-Myc很明显（第2和第9道，以及图表）。这一发现与之前检测其他细胞类型中不稳定c-Myc磷酸化状态的实验一致，并表明HL-60细胞中的c-Myc通过丝氨酸62磷酸化/苏氨酸58磷酸化/丝氨酸62去磷酸化降解途径快速处理。20相比之下，在我们观察到更稳定的c-Myc蛋白的白血病细胞系中，我们一致发现丝氨酸62磷酸化c-Myc的水平明显较高，而苏氨酸58磷酸化c-Myc的平均水平略低于HL-60细胞中观察到的水平(、车道1、3、4、6–8和图表）。与HL-60细胞的不稳定c-Myc相比，丝氨酸62磷酸化c-Myc水平的增加和苏氨酸58磷酸化c-Myc水平的降低在具有最长c-Myc半衰期的REH和SupB15 ALL细胞系中最为明显(). 这些结果表明，在c-Myc半衰期延长的白血病细胞系中，由丝氨酸62和苏氨酸58磷酸化控制的c-Myc降解途径受到干扰。
与不稳定c-Myc细胞系相比，c-Myc更稳定的白血病细胞系显示丝氨酸62磷酸化水平增加。从REH、SupB15、K562和HL-60白血病细胞系以及CA46 Burkitt淋巴瘤细胞系制备全细胞裂解物。根据之前的分析测量，对提取物的总c-Myc进行标准化。进行凝胶电泳，并使用不同的IRDye二级抗体检测C33 pan-c-Myc抗体（小鼠）和磷酸化S62-c-Myc抗体（兔子）（1-4道）或C33抗体和磷酸化T58-c-Myc-抗体（兔子，6-9道），同时进行Western blot检测（见材料和方法）。所示的蛋白质印迹是三个独立实验的代表。使用奥德赛红外成像仪和LI-COR生物科学公司的软件检测并量化每个抗体的信号量（见材料和方法）。条形图（带s.e.）以黑色显示了Theonine 58磷酸特异性信号与总c-Myc信号的三个实验的平均比率，以灰色显示了四个白血病细胞系的丝氨酸62磷酸特异性信息与总c-Myc信号的平均比率。图中还显示了CA46 Burkitt淋巴瘤中的磷蛋白-丝氨酸62和磷蛋白-苏氨酸58信号，其57位存在已知的脯氨酸-丝氨酸突变（第5和10栏，以及图表）。
我们还观察到，在CA46伯基特淋巴瘤细胞系中，在没有苏氨酸58磷酸化的情况下，丝氨酸62磷酸化的c-Myc水平很高(，车道5和10，以及图），其具有已知的c-myc公司脯氨酸57密码子突变(). 这种脯氨酸57到丝氨酸的突变先前已被证明可以阻止苏氨酸58的磷酸化，并与CA46细胞系中受损的c-Myc降解有关。29此外，我们和其他人之前已经证明，丝氨酸62磷酸化在苏氨酸58到丙氨酸c-Myc突变体中增强，并且丝氨酸62高度磷酸化与稳定的c-Myc蛋白相关。17,20,21,24同样，在本研究中的白血病细胞系中，相对于HL-60细胞，丝氨酸62高磷酸化和苏氨酸58低磷酸化的检测与c-Myc稳定性增加相关。然而，正如我们已经证明的那样，这些白血病细胞系没有c-myc公司苏氨酸58磷酸化位点或附近的突变()丝氨酸62磷酸化增加的原因尚不清楚。
PI（3）K的激活对两种ALL细胞中c-Myc的异常稳定至关重要
为了研究我们在一些白血病细胞系中观察到的磷酸化改变和c-Myc稳定性增加的可能机制，我们重点研究了丝氨酸62和苏氨酸58磷酸化变化最显著的两个ALL细胞系：REH和SupB15。我们评估了已报道的调节丝氨酸62和苏氨酸58磷酸化的激酶途径。在正常细胞的血清刺激下，激活Ras/Raf/MEK/ERK级联可以磷酸化丝氨酸62，激活Ras/PI（3）K/AKT通路可以抑制GSK-3β，这将减少苏氨酸58的磷酸化。Ras激活的两条途径都促进小鼠成纤维细胞中c-Myc的瞬时积累。17对REH和SupB15细胞系中磷酸化ERK和AKT的检测表明，ERK或AKT活性没有增加，这可以解释丝氨酸62和苏氨酸58的磷酸化改变（数据未显示）。然而，据报道，REH和SupB15细胞系都有半合子缺失PTEN公司该基因编码对抗PI（3）K活性的磷酸酶。39研究表明，REH和SupB15细胞中PTEN蛋白水平严重降低，这将导致PI（3）K的过度活性，尽管这与AKT活性增加无关，39与我们的结果一致。
我们检测了PI（3）K的活性是否有助于增加REH和SupB15细胞系中c-Myc的稳定性。我们用LY294002化合物抑制PI（3）K，并评估对REH和SupB15细胞中c-Myc积累的影响，与HL-60细胞相比，HL-60没有PTEN公司基因缺失。用LY294002处理细胞系后，我们发现REH和SupB15细胞系中的c-Myc水平显著下降，但HL-60细胞系中没有下降(，车道1和2，所有面板）。这一发现表明，PI（3）K的活性对于维持REH和SupB15细胞中c-Myc的高表达是必要的，但在HL-60细胞中并非如此。为了确定抑制PI（3）K后c-Myc水平的降低是否是由于c-Myc转换增加所致，我们同时用LY294002和蛋白酶体抑制剂Lactacystin处理REH、SupB15和HL-60细胞。抑制PI（3）K的c-Myc蛋白的下降至少在一定程度上被REH和SupB15细胞中伴随的蛋白酶体抑制所抵消(，车道3）。这一发现表明，抑制PI（3）K对c-Myc水平的全面影响需要蛋白酶体介导的c-Myc降解，这表明REH和SupB15细胞系中PI（3。
PI（3）K活性和抑制GSK3β对c-Myc的功能与ALL细胞系中c-Myc稳定性的增加有关。(一)PI（3）K抑制降低c-Myc稳定的ALL细胞株c-Myc蛋白水平；通过同时抑制蛋白酶体部分恢复。白血病细胞系用20μ米LY 294002带和不带10μ米如图所示。然后收集细胞，并使用抗c-Myc（N262）和抗tubin抗体通过凝胶电泳和Western blot分析蛋白质。(b条)Co-IP显示GSK3之间的相关性降低β以及c-Myc在具有稳定c-Myc的白血病细胞系中的表达。内源性c-Myc和GSK3β显示了每个所示细胞系的全细胞裂解物中的水平（输入）。使用C33（c-Myc）抗体偶联珠或对照（ctrl）A+G琼脂糖珠从这些裂解物中进行免疫沉淀（IP）。用C33和GSK3探测输入和IP斑点β抗体，如图所示。
c-Myc降解受损与GSK3降低相关β与c-Myc的相互作用
我们接下来评估了GSK3βREH和SupB15 ALL细胞对c-Myc的活性发生改变。最近的报道质疑了丝氨酸9磷酸化在GSK3上的作用β作为其对与胰岛素信号无关的靶点的活性标记，40,41我们选择不对GSK3进行评估β对丝氨酸9磷酸化状态的作用。相反，我们直接评估了GSK3β检测GSK3对白血病细胞株c-Myc活性的影响β与c-Myc相关。我们从等量HL-60、REH和SupB15细胞的总细胞裂解液中进行c-Myc Co-IP分析。如所示，我们观察到GSK3之间存在稳定的相互作用β和c-Myc，可通过Co-IP和HL-60细胞系中的c-Myc抗体检测到，其中c-Myc相对不稳定（下面板，通道2）。相比之下，GSK3很少β在c-Myc稳定的REH和SupB15细胞中，c-Myc被c-Myc抑制（下面板，第4和第6道），尽管这些ALL细胞系含有更多的GSK3β在他们的输入细胞中裂解物（右上面板）。尽管GSK3β可以清楚地在REH和SupB15细胞中的苏氨酸58处磷酸化c-Myc，GSK3的相互作用减少或不稳定β我们观察到，这些细胞中含有c-Myc可能导致苏氨酸58磷酸化的减少(). 此外，由于苏氨酸58磷酸化促进了PP2A介导的丝氨酸62去磷酸化，24GSK3中的这个缺陷β功能允许观察到丝氨酸62磷酸化c-Myc在REH和SupB15 ALL细胞系中的积累。综上所述，这些结果表明PI（3）K的激活和与GSK3的相互作用减少β有助于ALL细胞中c-Myc稳定性的增加，尽管PI（3）K信号传导和GSK3之间的确切联系β对c-Myc的活性尚不清楚。
c-Myc在儿科患者原代ALL细胞中稳定
为了确定患者原发性白血病细胞中c-Myc是否稳定，我们采集了10份前体B细胞或T细胞ALL患儿的骨髓样本和3份正常骨髓样本作为对照。6份ALL样本和3份正常骨髓样本中有足够的细胞进行脉冲相位分析。此外，六个ALL样本中有四个样本有足够的细胞进行FISH，以寻找c-myc公司遗传变化。先前冷冻的骨髓样本在培养中均未增殖，在Colcemid存在下也未观察到中期细胞。在我们的培养期间，细胞也没有发生凋亡或死亡（数据未显示）。我们测量了6份材料充足的儿童ALL骨髓样本和3份正常骨髓样本的c-Myc蛋白半衰期，以进行比较。35对浓缩骨髓样本进行S-蛋氨酸/半胱氨酸脉冲相位实验，结果如所示我们发现，在6个ALL样本中的4个样本（1个T细胞和3个前B细胞；患者编号1-4）中，c-Myc蛋白显著稳定。这些样本中c-Myc的半衰期在45到91分钟之间，明显长于对照正常骨髓样本，在多个独立实验中显示c-Myc半衰期为17到21分钟(和数据未显示）。6号患者的白血病细胞具有与正常骨髓相似的c-Myc半衰期。5号患者细胞中31分钟的半衰期仅比我们在正常骨髓中发现的稍长。c-Myc在正常骨髓中的半衰期与PBMC和JY对照细胞中的半胱氨酸半衰期相似。
儿童ALL患者骨髓样本中c-Myc蛋白半衰期延长。俄勒冈州健康与科学大学机构审查委员会同意后，从儿童急性淋巴细胞白血病患者中获取了储存的诊断性骨髓样本。在分析之前，将采集的样品解冻并保存在含有20%FBS的培养基中16–20小时。脉冲相位分析如下所述以及材料和方法。该图显示了检测到足够c-Myc用于定量和评估半衰期的六个样品的结果。作为对照，还对正常骨髓样本进行了脉冲追踪分析。显示的“正常骨髓”样本的结果代表了三个测试样本。每个样品的c-Myc蛋白半衰期显示。图中描述了四个c-Myc半衰期延长的样品和代表性正常骨髓样品的c-Myc降解速率。
c的FISH分析-myc公司由OHSU细胞遗传学实验室对来自具有足够材料的ALL样品中的四个样品的间期细胞进行。如中所述，c的正常两个信号-myc公司在2号、4号和5号患者的白血病细胞中观察到。3号患者显示57%的细胞具有正常的c两个信号-myc公司39%的细胞有三个或四个c信号-myc公司表明第8号染色体为三体和四体。因此，c-myc公司在所有这些ALL骨髓样本中，基因扩增都不明显。FISH结果以及患者特征，包括年龄、性别、白血病母细胞的免疫表型和治疗结果如所示这些结果表明，c-Myc蛋白的异常稳定可能发生在儿童急性淋巴细胞白血病的某些病例中，并且蛋白的稳定与任何明显的c-myc公司遗传变化。
表1
评估儿童急性淋巴细胞白血病患者c-Myc蛋白稳定性的临床特征
| 病人 | 年龄（岁） | 性别 | 诊断 | 结果 | c-Myc半衰期（min） | c的鱼-myc公司 |
|---|
| 1 | 6 | M（M） | B级前所有 | 中央控制室 | 91.2 | 是 |
| 2 | 三 | F类 | B级前所有 | BM复发→死亡 | 57.8 | 2，c-myc公司; 2 CEP8 |
| 三 | 2 | F类 | B级前所有 | 中央控制室 | 56.4 | 2-4，c-myc公司; 2-4 CEP8一 |
| 4 | 16 | M（M） | T细胞ALL | 不适用 | 44.6 | 2，c-myc公司; 2 CEP8 |
| 5 | 2 | M（M） | B级前所有 | 中央控制室 | 31.4 | 2，c-myc公司; 2 CEP8 |
| 6 | 4 | M（M） | T细胞ALL | 中央控制室 | 17.6 | 是 |
| 控制 | 不适用 | 不适用 | — | — | 19.6b条 | 是 |
讨论
正常细胞中c-Myc表达的控制发生在多个水平。众所周知，转录调控、mRNA转录后稳定和蛋白质稳定的翻译后控制在决定c-Myc水平中都起着作用。36我们以前的工作揭示了一种复杂的途径，它控制c-Myc蛋白的稳定和降解，以响应细胞增殖信号和细胞周期进入。20,24本报告中的数据表明，由于这种复杂降解途径的干扰，c-Myc的异常稳定在一些人类白血病细胞中发生。
我们的实验表明，c-Myc蛋白在一个CML和几个前B细胞ALL细胞系以及初级儿科前B细胞和T细胞ALL骨髓样本中是稳定的。相反，HL-60 AML细胞系因基因扩增而非蛋白质稳定而过度表达c-Myc。令人感兴趣的是，c-Myc在含有c-myc公司基因扩增，很高的c-Myc蛋白水平可能会压倒降解机制。对高c-Myc表达的适应可能是一种解释。虽然HL-60 AML细胞株没有稳定c-Myc，但c-Myc很可能在其他AML细胞系或原代AML细胞中稳定。事实上，对AML细胞系CTV-1的初步分析显示c-Myc的半衰期为147分钟（数据未显示）。此外，另外三种细胞系MOLT-3、CCRF-CEM（T细胞ALL）和HEL（红白血病）显示c-Myc的半衰期为53至58分钟（数据未显示）。虽然本报告的重点是四种白血病细胞系和六种小儿ALL骨髓样本，但我们的研究结果提供了一个重要的框架，为将来在更大范围的原发性人类白血病和其他人类癌症研究中分析c-Myc蛋白的稳定奠定了基础。
先前的报告显示，某些Burkitt淋巴瘤细胞中c-Myc半衰期延长是由于苏氨酸58磷酸化位点或其附近发生突变所致。28-30我们在本研究评估的所有白血病细胞系中均未发现此类突变。我们在REH、SupB15和K562白血病细胞系中的研究结果代表了我们首次发现在人类癌症中c-Myc蛋白稳定异常，而在细胞中没有编码序列突变-myc公司基因。
与c-Myc正常降解的细胞相比，评估稳定c-Myc的白血病细胞中丝氨酸62和苏氨酸58的磷酸化，有助于揭示c-Myc稳定的潜在机制。我们从以前的实验和其他报告中得知，苏氨酸58磷酸化和随后的丝氨酸62去磷酸化对c-Myc的泛素化和蛋白酶体介导的降解很重要。20,22-25然而，具有稳定c-Myc的白血病细胞系显示出相反的磷酸化模式，丝氨酸62磷酸化c-Myc水平显著升高，苏氨酸58磷酸化水平有所降低。
在我们对c-Myc稳定机制的分析中，我们证明了PI（3）K通路在REH和SupB15 ALL细胞中的激活作用。这些细胞系具有PTEN公司基因，编码逆转PI（3）K功能的磷酸酶，这将导致PI（3”K活性增加。39另一项最近的研究也表明，由于PTEN表达减少，PI（3）K活性增加，与胰腺癌细胞中c-Myc过度表达相关。42此外，我们的实验表明GSK3的相关性显著降低β在REH和SupB15细胞中具有c-Myc。基于有关胰岛素信号的研究，由PI（3）K信号激活的AKT抑制GSK3β在丝氨酸9上磷酸化。43然而，在我们的研究中，REH和SupB15细胞没有显示AKT活性增加（数据未显示），这与描述半合子缺失的报告一致PTEN公司在这些细胞中。39一种高度同源的激酶SGK可能也被PI（3）K激活，并能使GSK3失活β，负责受损的GSK3βALL细胞系中对c-Myc的活性。44另一方面，最近的报告表明，GSK3β特定目标上的活动，例如β-catenin不受丝氨酸9磷酸化的影响。40,41因此，虽然我们的数据明确表明PI（3）K活性和GSK3β抑制是ALL细胞株c-Myc稳定的机制，PI（3）K和GSK3之间的确切联系β在这些白血病细胞中尚待阐明。
从机械角度来看，GSK3之间的关联性降低βc-Myc可以解释ALL细胞系中观察到的丝氨酸62高磷酸化和苏氨酸58磷酸化的部分减少。以前的数据表明，如果没有苏氨酸58磷酸化，PP2A就不能使丝氨酸62去磷酸化。24因此，减少苏氨酸58磷酸化既可以提高丝氨酸62磷酸化水平，也可以降低SCF飞行重量7-介导c-Myc的多泛素化，导致ALL细胞系中稳定的c-Myc在丝氨酸62处磷酸化的积累。
除了发现白血病细胞系中c-Myc降解受损的证据，并深入了解这种降解受损的机制外，我们还发现，儿童ALL患者的原发性白血病细胞中存在c-Myc稳定。未来有兴趣扩大这项研究，以寻找受损c-Myc降解的频率，并确定是否与临床结果存在任何相关性。然而，这需要更多的白血病患者。据我们所知，这是首次报道原代人类白血病细胞中c-Myc蛋白稳定异常。
总之，我们的发现揭示了一些人类白血病中c-Myc过度表达的一种以前未被认识的机制，这种机制依赖于细胞因子而非c-Myc本身的改变。此外，我们对某些白血病细胞株中c-Myc稳定机制的分析表明，控制c-Myc降解的苏氨酸58/丝氨酸62磷酸化/去磷酸化途径在人类白血病中可以被解除调控，并且该途径可能构成稳定c-Myc的造血恶性肿瘤的新治疗靶点。
致谢
我们感谢玛丽亚·西里（Maria Siri）的技术援助，感谢彼得·库尔（Peter Kurre）和瑞切尔·德雷斯贝克（Rachel Dresbeck）在编辑手稿方面的慷慨帮助。我们感谢Grover Bagby提供JY控制细胞系。这项工作得到了国家癌症研究所R01 CA100855和K01 CA086957对RCS的资助。
工具书类
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