跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

政府意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府网站。

Https公司

网站是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2007年8月6日；204(8):1813-24.
doi:10.1084/jem.20070876。 Epub 2007年7月23日。

白血病细胞FBW7突变介导NOTCH通路激活和对γ-分泌酶抑制剂的耐药性

詹妮弗·奥尼尔 1, 乔纳森·格里姆, 彼得·斯特拉克, 苏迪尔·拉奥, 迪安·蒂比茨, 克里斯托弗·温特, 詹姆斯·哈德威克, 马库斯·韦尔克, 朱尔斯·梅杰林克, 罗布·皮特斯, 朱利奥·德雷塔, 罗莎莉·西尔斯, 布鲁斯·克鲁曼, 托马斯造型
附属公司

白血病细胞FBW7突变介导NOTCH通路激活和对γ-分泌酶抑制剂的耐药性

詹妮弗·奥尼尔等。 实验医学杂志. .

摘要

γ分泌酶抑制剂（GSIs）可以在体外阻断NOTCH受体信号传导，因此为依赖于失调的NOTCH活性的肿瘤提供了一种有吸引力的靶向治疗。为了阐明T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）中GSI耐药的基础，我们研究了具有NOTCH细胞内结构域（NICD）组成性表达但在NOTCH1中缺乏C末端截断突变的T-ALL细胞系。所检测的七个细胞系中的每一个和81个（8.6%）初级T-ALL样本中的7个都存在FBW7基因的突变或纯合缺失，FBW7是一种与NICD周转有关的泛素连接酶。事实上，我们证明FBW7突变体不能与NICD结合，并定义了FBW7结合所需的NICD的磷酸化简区。尽管FBW7的突变形式仍然能够与MYC结合，但它们没有将其作为降解的靶点，这表明NICD及其主要下游靶点MYC的稳定可能有助于FBW7突变白血病的转化。此外，我们发现所有7个FBW7突变的白血病细胞株都对MRK-003 GSI耐药。用MRK-003治疗后，大多数耐药株也未能下调NOTCH靶向MYC和DELTEX1的mRNA水平，这意味着FBW7突变的T-ALL中残留的NOTCH信号有助于GSI耐药。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
MRK-003治疗导致人类T-ALL细胞系的细胞周期阻滞、凋亡和NICD生成抑制。（A） GSI-敏感HPB-ALL细胞系的细胞周期分析。用DMSO（载体）或1μM MRK-003处理细胞7 d，用碘化丙啶染色，并用流式细胞仪进行分析。（B） 在DMSO或1μM MRK-003中培养7天后，对DND41细胞系进行Annexin V–FITC/碘化丙啶染色。数字表示每个象限中单元格的百分比。在其他GSI敏感细胞系中也观察到类似结果。（C） GSI-resistant Molt13细胞株在DMSO（载体）或MRK-003中7天后的细胞周期分析。表I中列出的所有其他GSI抗性细胞系也观察到了类似的结果。（D）Molt4细胞系在DMSO或1μM MRK-003中7天后的膜联蛋白V–APC/碘化丙啶染色。在所有其他GSI抗性细胞系中都观察到类似的结果。（E） 激活NOTCH1蛋白印迹分析。用1μM MRK-003处理T-ALL细胞株3 d。对全细胞裂解物进行SDS-PAGE电泳，并用NOTCH1（V1744）抗体进行免疫印迹。
图2。
图2。
NOTCH T2512A突变体的稳定性增加，与FBW7的结合减少。（A） 四种人类NOTCH蛋白以及不同物种的NOTCH蛋白质的比对表明，假定的NOTCH-CPD具有很强的保守性。已知的CPD与NOTCH进行比对。（B） T2512A NOTCH突变体与WT FBW7结合不足，肿瘤衍生的FBW7精氨酸突变体（R465C）不再与WT NOTCH结合。按照指示转染细胞，并免疫沉淀FLAG-FBW7。样品经SDS-PAGE电泳和抗MYC标记（9E10）免疫印迹检测转染的Notch蛋白。对全细胞裂解物进行分析，以验证转染构建物的表达。（C） K562红白血病细胞系的共免疫沉淀试验表明，T2512A在造血细胞中与FBW7结合不足。对全细胞裂解物进行分析，以验证转染构建物的表达。（D） FBW7–Notch ICD相互作用不需要S2514的磷酸化。如上文B所示转染293a细胞并进行分析。（E） NICD优先与核和核仁FBW7亚型相关。用所示质粒转染293a细胞，并按上文B所述进行分析。（F） 体内泛素化试验表明，NOTCH T2512A突变株对FBW7介导的泛素化具有抵抗力。如图所示转染293a细胞。制备细胞裂解物，并用抗HA抗体进行免疫沉淀，以去除泛素化蛋白。样品经SDS-PAGE电泳和9E10免疫印迹检测MYC-标记的NOTCH蛋白。对全细胞裂解物进行分析，以验证转染构建物的表达。（G） 与WT NOTCH相比，NOTCH T2512A突变体在293a细胞中的半衰期延长。用WT NICD或T2512A突变株转染293a细胞。48小时后，在体内用脉冲标记细胞35S-蛋氨酸/半胱氨酸，在含有过量未标记蛋氨酸和半胱氨酸的培养基中追赶指定时间。用MN-1抗血清免疫沉淀转染的NOTCH蛋白，并对样品进行SDS-PAGE电泳。然后将凝胶暴露在x射线胶片上。
图3。
图3。
GSI治疗导致T-ALL细胞亚群中MYC蛋白水平降低。用1μM MRK-003或DMSO处理T-ALL细胞株3 d，并用RIPA裂解缓冲液制备全细胞裂解物。使用抗MYC和β-肌动蛋白抗体作为负荷对照进行Western blot分析。
图4。
图4。
T-ALL细胞系增加了MYC半衰期。（A） 带有WT的T-ALL细胞系FBW7型（Molt4、DND41和KOPTK1）在体内用脉冲标记35S-蛋氨酸/半胱氨酸，在含有过量未标记蛋氨酸和半胱氨酸的培养基中追赶指定时间。在每个时间点从等量细胞中免疫沉淀内源性MYC，并通过凝胶电泳进行分析。35每个样品的S-标记MYC通过磷光成像仪进行定量。每个细胞系的MYC降解率在图中用最适合的指数线表示。根据指数线方程计算MYC的半衰期。（B） 对具有突变的T-ALL细胞系进行类似的脉冲追逐实验FBW7型（CEM和Jurkat）。与B细胞淋巴母细胞系JY细胞相比，所分析的所有T-All细胞系都增加了MYC半衰期。
图5。
图5。
GSI处理突变体T-ALL细胞株后NOTCH靶基因没有减少FBW7型. MYC公司和DELTEX公司通过微阵列基因表达分析测定18个T-ALL细胞株在1μM MRK-003 GSI处理3d后的RNA水平（与DMSO处理的细胞相比）。值是日志10表达水平比率MYC公司和DELTEX公司MRK-003处理细胞与DMSO处理细胞的比较。
图6。
图6。
突变体FBW7型不能与NICD结合，并以主导-消极的方式防止MYC降解。（A） FBW7精氨酸点突变体可与MYC有效共沉淀，但不与NOTCH共沉淀。将所示质粒转染293a细胞。用抗FLAG对全细胞裂解物进行免疫沉淀，并通过MT-NOTCH或HA-MYC的免疫印迹分析结果样品。还通过SDS-PAGE和免疫印迹法直接分析全细胞裂解物中的FLAG-FBW7、HA-MYC或MT-NOTCH，以验证转染构建物的表达。所有转染中都包含dnCul1，以阻止FBW7介导的蛋白酶体降解。（B） T-ALL相关FBW7突变体无法介导MYC降解。如图所示转染293a细胞。如图所示，对整个细胞裂解物进行SDS-PAGE和HA-MYC或FLAG-FBW7免疫印迹。（C） 肿瘤衍生FBW7突变体主要通过WT-FBW7抑制MYC周转。用恒定量的HA-MYC转染293a细胞，增加FLAG-FBW7-γ或恒定量（500 ng）的FLAG-FBW-γ和增加量的FLAG-FBW7--γ-R465H（1–5μg）的组合。突变体与WT FBW7表达的比率显示在7–9号通道上方。HA-cdk2不影响FBW7对MYC的转换，被纳入转染对照。如图所示，对全细胞裂解物进行SDS-PAGE和HA-MYC、HA-cdk2或FLAG-FBW7免疫印迹。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“引用者”文章

工具书类

    1. Wilson，A.和F.Radtke。2006年。Notch信号在自我更新器官和癌症中的多重功能。FEBS信函。580:2860–2868.-公共医学
    1. D.Gallahan和R.Callahan。1987。野生小鼠的乳腺肿瘤发生：鉴定小鼠乳腺肿瘤病毒（捷克II）诱导的乳腺肿瘤中的一个新的int位点。J.维罗尔。61:66–74.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Dievart，A.、N.Beaulieu和P.Jolicoeur。1999.Notch1参与小鼠乳腺肿瘤的发展。致癌物。18:5973–5981.-公共医学
    1. Hallahan，A.R.、J.I.Pritchard、S.Hansen、M.Benson、J.Stoeck、B.A.Hatton、T.L.Russell、R.G.Ellenbogen、I.D.Bernstein、P.A.Beachy和J.M.Olson。SmoA1小鼠模型显示，notch信号对声波刺猬诱导的髓母细胞瘤的生长和存活至关重要。癌症研究64:7794–7800。-公共医学
    1. Klinakis，A.、M.Szabolcs、K.Politi、H.Kiaris、S.Artavanis-Tsakonas和A.Efstratiadis。2006年。Myc是Notch1转录靶点，也是Notch1诱导小鼠乳腺肿瘤发生的必要条件。程序。国家。阿卡德。科学。美国103:9262–9267。-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

MeSH术语