c-Myc公司是T细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤中Notch1的重要直接靶点

c-Myc是Notch1的直接目标

细胞外结构域中携带Notch1激活突变的形式易受S2位点金属蛋白酶的配体诱导依赖性裂解作用的影响(Sanchez-Irizarry等人，2004年). 这种解理的产物，N^TM（TM）*，通常被迅速招募到γ-分泌酶复合体并进一步加工成ICN1(Shah等人，2005年). 然而，我们之前注意到N^TM（TM）*在T-ALL中，细胞在GSI存在下稳定并积累(翁等人，2003年)，创建一个N的池^TM（TM）*GSI冲刷后可迅速转换为ICN1。

我们使用这个策略来确定c-myc基因Notch1需要蛋白质合成。这些实验使用了人类T-ALL细胞系KOPT-K1，该细胞系在Notch1的细胞外异二聚体结构域发生突变，导致配体诱导的S2分裂(Weng等人，2004年;Malecki等人，2006年). KOPT-K1细胞中GSI的洗脱导致c-myc基因甚至在环己酰亚胺（蛋白质合成抑制剂）存在下的转录物（图。​（图2A）。2年). 上调c-myc公司在大范围的环己酰亚胺剂量（5–40μg/mL）下观察到GSI洗脱后，所有这些都足以抑制KOPT-K1细胞的生长（数据未显示）。

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图2。

c-Myc公司是Notch1的直接目标。(一个)c-Myc公司Notch的上调不需要从头合成蛋白质。用GSI（1μM化合物E）处理KOPT-K1细胞48小时，以允许γ-分泌酶底物N的积累^TM（TM）*. 然后对细胞进行清洗，并对含有GSI（模拟洗脱）或缺乏GSI（洗脱）的培养基进行改良，以添加或不添加20μM环己酰亚胺（CHX）。c-Myc公司额外培养4小时后，通过qPCR测定RNA水平。每个样品化验三份；误差条对应于标准偏差。在四个独立的实验中也得到了类似的结果。(B类)缺口1刺激c-myc公司转录。用溶媒（0.01%DMSO）处理KOPT-K1细胞48小时，制备细胞核；GSI（1μM化合物E）处理48 h；GSI处理48h，然后洗涤三次，在不含GSI的新鲜培养基中培养2h；或用GSI处理48小时，然后洗涤三次，并用GSI（模拟洗涤液）在新鲜培养基中培养2小时。从径流反应中分离的RNA与含有特异性探针的slot-blot杂交c-myc公司和GAPDH。用荧光成像仪定量结合放射性。(顶部面板）磷光图像。(底部面板）计算c-myc公司/GAPDH转录比率。显示了一个具有代表性的实验的结果。(C)槽口1绑定到c-myc基因启动子通过包含保守CSL一致序列的区域。对用二甲基亚砜或1μM化合物E（GSI）处理24小时的T6E细胞制备的交联片段DNA进行染色质免疫沉淀物分析。然后用位于推测CSL结合位点A和B两侧的引物进行qPCR，分析洗脱的DNA。将从免疫沉淀的DNA扩增的DNA量标准化为从输入DNA扩增的DNA量。(D类)CSL绑定到c-myc公司发起人。用羧基荧光素（FAM）标记的寡核苷酸单独与缓冲液或含有纯化CSL和Notch1多肽的缓冲液混合。在10%天然凝胶电泳后，使用860 Storm FluorImager（Amersham Pharmacia Biotech）检测荧光标记探针。

确定Notch是否刺激合成c-myc公司用从DMSO或GSI处理的细胞中获得的KOPT-K1细胞核进行转录物、核径流实验（图。​（图2B）。2B型). GSI治疗减少c-myc公司转录，而GSI的洗脱仅持续2小时，在c-myc公司与环己酰亚胺实验中观察到的转录相似。重要的是c-myc公司当细胞被参考含有GSI（模拟洗脱）的新鲜培养基时，转录大部分被取消。因此，Notch1增加c-myc公司通过刺激转录在T-ALL细胞中的RNA。

正在扫描第个，共个c-myc公司基因组序列揭示了两个潜在的CSL结合位点，它们在人和小鼠之间是保守的：（1）位点A（TTCCCAA），位于由Satoh等人（2004）; 和（2）位点B（TTGGGAAA），位于c-myc公司（图。​（图2C）。2摄氏度). 从T6E细胞制备的染色质免疫沉淀物显示，ICN1与含有位点A的DNA片段相关，GSI治疗耗尽了该位点的ICN1（图。​（图2C）。2摄氏度). 相反，ICN1与B位点无关。正如预期的那样，GSI治疗也会从CSL结合位点中耗尽ICN1hes1型启动子，一个特征鲜明的Notch1靶点(Jarriault等人，1995年). 电泳迁移率变化分析（EMSA）表明CSL和CSL/ICN1复合物与含有位点A的寡核苷酸结合（图。​（图2D），二维)，尽管其对共有结合位点的亲和力比CSL低约五倍（补充图S1）。综上所述，这些数据表明激活的Notch1上调c-myc基因直接。

c-Myc对于从Notch1退出中拯救T6E细胞是必要且充分的

GSI治疗T6E细胞导致G₀/克₁ICN1转导阻止细胞周期阻滞(翁等人，2003年). 鉴于c-myc对生长发育的潜在影响（有关最新综述，请参阅奥斯卡森和特朗普2005)，我们调查了c-myc公司模拟了ICN1的影响。T6E细胞用空的MigRI或c-myc、，ICN1，其他Notch1目标(赫斯1和hes5)，抗凋亡基因bcl-x公司_L（左）,或周期D3，与正常T细胞祖细胞生长和增殖有关的基因(Sicinska等人，2003年). 只有ICN1和c-myc完全挽救了T6E细胞，使其免于GSI诱导的生长停滞（图。​（图3A）；3A级); bcl-x具有微小但显著的生存优势_L（左）（数据未显示），而hes1、hes5和cyclinD3的作用与空病毒没有显著差异。与ICN1一样，c-myc也在GSI存在下维持T6E细胞的细胞周期进展（图。​（图3B第3页).

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图3。

c-Myc对于从Notch1信号中解救T6E细胞是必要的和足够的。(一个)c-Myc拯救增长。表达Notch1膜栓形式的T6E细胞需要通过γ-分泌酶裂解激活，用表达GFP的MigRI逆转录病毒或GFP和所示多肽进行转导，然后用GSI（1μM化合物E）处理长达6天⁺显示每个时间点的单元格。(B类)c-Myc可恢复细胞周期动力学。在基线检查时和用GSI治疗6d后，用流式细胞仪测定用所示MigRI逆转录病毒转导的T6E细胞的DNA含量。(C)c-myc功能抑制剂阻止ICN1拯救GSI治疗的T6E细胞。T6E细胞与表达ICN1和A-max或mad1的逆转录病毒共转染。然后在1μM化合物E存在下培养细胞6天。单独用ICN1转导的细胞(左上角象限）在实验过程中得到富集，而仅表达A-Max或Mad1的细胞(右下角象限）或这两种c-myc抑制剂之一和ICN1(右上角象限）。

为了进一步探讨c-myc基因作为靶点，T6E细胞与ICN1和mad1型或主导负（DN）最大值（A-max）(Krylov等人，1997年)对抗c-myc的作用（图。​（图3C）。3C公司). 经GSI处理后，ICN1转导细胞（与非转导细胞相比）的实质性生长优势被mad1和DN max所抵消，表明c-myc功能对于ICN1拯救T6E细胞是必要的（图。​（图3C3C公司).

c-Myc从Notch1停药中拯救了人类T-ALL细胞亚群

调查是否c-myc公司通常足以从Notch退出中拯救T-ALL细胞系，我们用c-myc公司。像ICN1(Weng等人，2004年),c-myc公司根据增殖情况判断，对其中三种细胞株（KOPT-K1、DND-41、TALL-1）进行了部分或完全的GSI治疗（图。​（图4A）4A级)和细胞周期参数（图。​（图4B），4B类)而两种细胞系（HPB-ALL和ALL-SIL）未被c-myc公司。所有经GSI处理的Notch1依赖性细胞系的细胞大小也显著减小，但被c-myc公司（图。​（图4C）。4摄氏度). 因此，尽管c-myc公司似乎是激活的Notch1的一个一致目标，即Notch-dependentT-ALL细胞系被激活的程度c-myc公司单独是可变的。

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图4。

转导c-myc公司导致人类Notch-sensitive T-ALL细胞株从Notch信号的撤回中得到不同程度的挽救。拯救增长(一个)，细胞周期进展(B类)、和单元格大小(C)在对照T-ALL细胞系或用c-myc公司以及GFP标记（c-myc）或仅GFP（GFP）。用二甲基亚砜载体（模拟）或1μM化合物E（GSI）处理细胞指定的时间段。(一个)活GFP的比例⁺个单元格流式细胞仪监测。GFP增加⁺分数表明逆转录病毒相对于未转导的GFP具有生长/存活优势⁻细胞。(B类)将对照细胞系的DNA含量与用c-myc公司通过Hoechst 33342染色，然后进行流式细胞术。所示的DNA直方图来自>20000门事件。(C)单元格大小（单位：c-myc公司用GSI（化合物E，1μM）或DMSO载体（V）处理指定时间的转导细胞和未转导对照细胞，通过活细胞的前向散射测定。描述了每个人群的相对细胞大小（对于经车辆处理、未转导的控制细胞，标准化为值100±1 SD）。在未转导的细胞中加入GSI后，细胞尺寸减小（*），在转导c-myc公司在经GSI处理的培养物中（**，与未经转化的GSI处理细胞相比），两者都显著(P（P）经双向ANOVA（未加权平均数）分析后，通过Bonferroni后验测得的所有受试细胞系中的<0.01）。

激活的Notch1可以拯救依赖转基因c-myc的T-ALL细胞

如果Notch1是主要的上游调节器c-myc公司在T-ALL细胞中，激活的Notch1应取代转基因提供的功能c-myc公司。这一想法是用8946细胞系进行测试的，该细胞系来源于用强力霉素再抑制人类诱导的小鼠T-ALLc-myc公司转基因(Felsher and Bishop 1999年). 当用多西环素治疗时，8946细胞发生生长停滞和凋亡，但不受GSI治疗的影响（图。​（图5A）。5A级). 用ICN1或ΔE（一种类似N的活化Notch1的膜栓形式）转导8946细胞^TM（TM）*)将这些细胞从c-myc公司而空病毒没有（图。5B、C). 值得注意的是，Notch1的拯救与内源性小鼠的上调相关c-myc公司（图。​（图5E）。第五版). 此外，当用ΔE挽救时，8946个细胞对GSI敏感（图。​（图5D）5天)上调Notch1的表达(dtx1，c-myc)和c-myc(计算机辅助设计)靶基因（图。​（图5E）。第五版). 综上所述，这些数据与模型一致，其中c-myc公司作用于Notch下游，促进T-ALL细胞的生长。

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图5。

激活的Notch1将T-ALL细胞系8946从转基因c-myc中解救出来，并传递对Notch途径抑制剂的敏感性。(一个)GSI（1μM化合物E）处理不会影响基底8946细胞的生长。(B、 C类)用编码两种不同形式激活的Notch1、ICN1或ΔE逆转录病毒的逆转录病毒转染8946细胞，可使细胞免受强力霉素（20 ng/mL）的影响，而空的MigRI则不会。通过正向和侧向散射对8946个细胞的救援进行不同的判断(B、，这表明ICN1）或治疗后第6天GFP阳性细胞数量的拯救(C、，它显示了ΔE）的救援情况。(D类)当用ΔE从多西环素治疗中解救出来时，8946个细胞对GSI新致敏。用ΔE转导的8946个细胞用多西环素（Dox，20 ng/mL）±1μM化合物E（GSI）处理6 d。流式细胞术检测GSI治疗效果。(E类)ΔE上调内源性c-myc公司以及其他Notch和c-myc靶基因。用多西环素（20 ng/mL）±GSI（1μM化合物E）处理经MigRI或MigRI-ΔE转导的8946个细胞24小时，表达deltex1（deltex1）（Notch1上调的基因），转基因人类c-myc、，内源性小鼠c-myc、，和c-myc靶计算机辅助设计通过RT-PCR监测。

Notch和c-myc之前研究的意义

逆转录病毒突变研究c-myc公司（毫米电视^D类/myc）转基因小鼠表明，T-ALL的高频率发生，潜伏期缩短，前病毒整合入槽口1(Girard等人，1996年;Hoemann等人，2000年). 对这一观察的最简单解释（c-myc和Notch1通过独立互补的途径促进前T细胞转化）与我们的功能数据不一致c-myc公司槽口1下游。

如何将这些看似冲突的数据纳入注册？一种解释在于实验的不同背景。体内模型允许在肿瘤发展和进展的不同阶段检测致癌互补，而我们的实验仅专注于体外生长维持。在小鼠中，逆转录病毒插入多能干骨髓祖细胞的Notch1中，预计会扩大前T细胞库，从而增加该库中某些细胞获得其他速率抑制癌基因畸变的可能性。这种扩大“高危”细胞库的能力可能是Notch1补充许多（如果不是全部的话）与人类相关的其他遗传损伤的显著能力的基础(Weng等人，2004年)和小鼠T-ALL(Girard等人，1996年;Feldman等人，2000年;Dumortier等人，2006年;Lin等人，2006年;O'Neil等人，2006年). 逆转录病毒插入c-myc公司发生在lck-activated-Notch1中产生的T-ALL中(lck公司-N个^集成电路)转基因小鼠(贝弗利和卡波宾科2003). 尽管c-myc公司应该已经上调了lck公司-N个^集成电路小鼠，超生理表达c-myc公司由于前位插入可能会带来额外的选择性优势。这一观点与纯合转基因缩短肿瘤潜伏期的研究一致c-myc公司小鼠相对于杂合动物(Sidman等人，1993年). 最后c-myc公司拯救所有Notch-dependent细胞系清楚地表明存在其他Notch1靶基因，这些靶基因有助于生长和存活，也可能对MMTV中的肿瘤提供选择性优势^D类/携带Notch1-proviral插入物的myc转基因小鼠。重要的是要确定c-myc公司细胞系之间的依赖性，并确定Notch1下游其他有助于T-ALL细胞生长和存活的基因。

Notch/myc相互作用在正常和肿瘤前T细胞中的重要性

T-ALL似乎与前T细胞发育的不同阶段相似(费兰多等人，2002年;Asnafi等人，2003年)在这期间，Notch信号转导结果可能会有显著差异。Notch1是来自多能祖细胞的两种T谱系规范所必需的(Pui等人，1999年;Radtke等人，1999年;Sambandam等人，2005年)以及随后的前T细胞发育，直至并包括β选择检查点(Wolfer等人，2002年;Tanigaki等人，2004年;Ciofai和Zuniga-Pflucker，2005年)发生在“Notch-high”DN3a向“Notch-low”DN3b细胞成熟过程中(Taghon等人，2006年). 值得注意的是，正常的β选择伴随着需要Notch1和c-myc的T细胞祖细胞的扩增(Douglas等人2001;Iritani等人，2002年). 我们的体外研究表明，Notch信号有助于c-myc公司在DN3a细胞中表达，并且在c-myc公司β-选择后DN3b胸腺细胞的表达，也下调前Tα的表达。有趣的是，Notch相关的T-ALL通常与前Tα的持续表达有关（见图。​图1A；1安培;Bellavia等人，2000年)这被认为是这些细胞被阻滞在类似正常β选择的阶段的证据。总之，这些发现表明Notch/c-myc公司在Notch-dependent T-ALL细胞中发现的信号轴反映了一种与正常T细胞发育相关的阶段特异性关系的持续存在。

Notch1目标如何限制在特定上下文中？

Notch信号的结果因上下文而异。这些不同结果的一个可能基础是存在特定环境的靶基因，例如前Tα(Deftos等人，2000年;Reizis和Leder 2002). 由于生理学的Notch信号通常不会导致生长增加，因此似乎有可能c-myc公司也将被证明是一个特定环境的目标。

如何实现这一点？我们的数据表明c-myc公司通过位于5′内的保守位点（TTGGGAA）被T-ALL细胞中的Notch1靶向c-myc基因位于TATA盒上游的启动子区域，该区域先前被证明含有CSL应答元件(Satoh等人，2004年). 该序列不同于标准CSL识别序列YGTGRGAA(Tun等人，1994年;Nellesen等人，1999年)，并相对较弱地绑定CSL，这可能会限制CSL在特定上下文中的占用。其他因素可能会进一步对入住率进行积极和消极的调节。在这方面，推测的CSL结合位点c-myc公司启动子与Ikaros的共识结合位点高度相似(Molnar和Georgopoulos 1994)，一种调节前T细胞发育的转录抑制物(Georgopoulos等人，1994年;Winandy等人，1999年). Ikaros功能丧失与T-ALL发育相关(Winandy等人，1995年)据推测，Ikaros和CSL竞争小鼠模型中决定T-ALL发育的基因启动子序列(贝弗利和卡波宾科2003);c-myc基因可能就是这样一种基因。相反，未知顺式-作用因子可以通过CSL和/或CSL/ICN1/MAML三元复合物的转录激活提高位点定位。最近的工作已确定顺式-有助于激活许多Notch响应元件的作用元件(Cave等人，2005年;Ong等人，2006年)，为该模型提供支持。

质粒和探针

将编码鼠和人c-myc、鼠Mad1、HA-tagged A-Max（Charles Vinson博士，NCI，Bethesda，MD）和Flag-tagged-cyclin D3（Alan Diehl博士，宾夕法尼亚大学，费城）的cDNA亚克隆到MigR1中，这是一种含有内部核糖体进入位点（IRES）和GFP标记的逆转录病毒载体(Pui等人，1999年). 已描述了逆转录病毒结构MigRI–ICN1和MigRI-MAML1（13–74）-GFP(翁等人，2003年). 对所有结构进行测序和表达测试，然后用免疫印迹法检测抗Mad1（#4682，Cell Signaling）、抗HA（克隆6E2，Cell Signaling。在ICN与Mig A-Max或Mig Mad1共转导的实验中，ICN1是从基于MSCV的逆转录病毒载体中表达的，该载体与截短的神经生长因子受体（tNGFR）共存作为替代标记物(Tu等人，2005年). 这种方法允许使用NGFR抗体（Pharmingen）检测FL1通道中的GFP和FL2通道中的tNGFR。用于Northern杂交的c-myc和18S rRNA探针是通过随机六聚体启动一个～2.2-kb的人类c-myc cDNA（MGC-5183）和一个644-bp的PCR产物，跨越GenBank登录的548-1191个残基生成的{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“M10098”，“term_id”：“337376”，“term_text”：“110098”}}M10098型分别是。

逆转录病毒转导与GSI拯救

高滴度生态剂的生产(Pear等人，1996年)和伪类型(翁等人，2003年)对逆转录病毒和靶细胞转导进行了描述。对于GSI救援实验，5×10⁵至7.5×10⁵用适量的病毒上清液和4μg/mL溴化六甲二胺（Sigma）以2500 rpm的转速离心细胞50分钟（第2天）。通过FACScan流式细胞仪（Becton Dickinson）上的GFP荧光测定感染后48小时（第0天）的转导效率。评估GFP百分比后，立即对细胞进行计数，并用GSI（1μM化合物E，在M.S.Wolfe实验室合成）进行处理。GFP百分比的变化⁺细胞和其他细胞参数用FACScan流式细胞仪评估，总细胞数用血细胞仪获得。GFP数量⁺细胞被归一化为GFP的数量⁺细胞在第0天纠正最初逆转录病毒转导的差异。计算每个实验的平均细胞计数和标准偏差（一式三份），每个实验至少进行两次。在适当的情况下，学生的t吨-检验用于评估统计学显著性。

表达式分析/分析

使用Trizol（Invitrogen）制备的总RNA用于生成所述的标记cRNA(Shipp等人，2002年). cRNA在AffyMetrix U74Av2和/或Expression Set 430 A/B上杂交/扫描，芯片和原始荧光数据使用dChip软件进行分析。GSI处理的细胞在1.0μM化合物E存在下培养3、6、24或72小时。将模拟处理的细胞置于二甲基亚砜载体（最终0.01%）存在下培养120小时。DN-MAML1转基因细胞在逆转录病毒暴露至87%GFP纯度后72小时进行分选⁺（DN-MamA）和98%GFP⁺（DN-MamB）；仅GFP的对照组被分类为95%的GFP纯度⁺（GFPposA）和98%GFP⁺（GFPposB）；GFP阴性对照组是从接触但未被DN-Mam逆转录病毒转导的细胞中筛选出来的，纯度大于98%的GFP⁻（GFPnegA）和>99%GFP⁻（GFPnegB）。已排序的单元格（2×10⁶至4×10⁶)分选后立即采集RNA。在RNA收获前，用ICN转导的细胞在0.5μM化合物E的存在下连续培养数周（>99%GFP⁺).

北方斑点

在1.2%琼脂糖/2.2 M甲醛凝胶上运行总RNA（每个样品10μg），并通过紫外线交联（Stratalinker，Stratagene）转移到Hybond-XL尼龙膜（Amersham Biosciences）。斑点与放射性标记杂交³²P-random-primed探针在65°C下清洗，然后暴露于带有增感屏的柯达BioMax MS放射自显影胶片中。

定量RT-PCR（qRT-PCR）

用SuperScript II（Invitrogen）反转录寡核苷酸（T）引物总RNA（每个细胞系样品2μg，胸腺细胞0.5μg）。对于细胞系样品，将适当稀释的cDNA和基因特异性引物与iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）结合，并在iCycler-iQ实时PCR机器（Bio-Rad）中扩增。所有qPCR反应均一式三份。使用Excel的基因表达宏（Bio-Read）计算Ct（阈值循环数）和具有标准偏差的表达值。实时PCR的引物序列如下：c-myc公司正向，5′-CTTCTCTCC GTCCTCGGATTCT-3′；c-myc公司背面，5′-GAAGGTGATCC AGACTCTGACCTT-3′；β-肌动蛋白正向，5′-CGCGAGAAGA TGACCCAGAT-3′；β-肌动蛋白背面为5′-GATAGCACT GGATAGCAC-3′。c-Myc公司和β-肌动蛋白引物在0.25μM最终使用时，PCR效率分别为95.7%和92.9%。进行实时扩增，在95°C下初始变性3分钟，然后进行40次两步扩增循环（95°C 15秒，65°C 1分钟）。对于胸腺细胞样本，使用TaqMan通用PCR Master Mix（Applied Biosystems）进行实时RT–PCR，并在ABI Prism 7900（Applied Biosystems）上进行分析。缺口1，c-myc，和三角洲1Taqman引物来自Applied Biosystems。

DNA含量/流式细胞仪分析

分别用Hoechst 33342（4μM，Sigma B2261）或碘化丙啶（40μg/mL）对活细胞或固定细胞进行DNA含量染色。流式细胞术使用配备488 nm和紫外激光的流入分析仪（Cytopeia）进行，以测量活细胞中的GFP和Hoechst 33342，而FACSCalibur细胞仪（BD Biosciences）用于测量固定细胞中的碘化丙啶或活细胞中GFP。使用FlowJo软件（Treestar）进行数据分析。

染色质免疫沉淀（ChIP）分析

使用ChIP检测试剂盒（Upstate Biotechnology）进行ChIP检测。T6E细胞在固定前用DMSO或GSI（1μM化合物E）处理24小时。在室温下用1%多聚甲醛固定细胞10分钟，清洗并用SDS裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，1%SDS，10 mM EDTA，蛋白酶抑制剂混合物，Sigma）裂解。对裂解产物进行超声波处理，以将DNA长度减少至200至600 bp。稀释可溶部分，用鲑鱼精子DNA/蛋白A-琼脂糖预处理，然后分成两个试管，并用5μL Notch1 TAD结构域特异性抗血清孵育(Aster等人，2000年)或正常兔IgG。然后用蛋白A-琼脂糖沉淀免疫复合物，并用洗脱缓冲液（0.1 M NaHCO）洗脱_三含1%十二烷基硫酸钠）。将洗脱物反向交联并用蛋白酶K（20μg/mL）处理。使用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化DNA并用水（5×10）洗脱⁶电池当量/50μL）。在ABI 7900HT序列检测系统（Applied Biosystems）上使用SYBR Green系统，使用以下引物进行定量PCR（qPCR）：（1）c-myc公司启动子正向，5′-TGAGGCTCCTCCTCCTTTC-3′；(2)c-myc公司启动子逆转，5′-GCAGACCCCCGGAATAA-3′；(3)c-myc公司内含子2正向，5′-CACGGGACCTGAAAG GTTCT-3′；(4)c-myc公司内含子2反转，5′-GGGTTAGGGCAC AGGTGAGA-3′；(5)hes1型启动子正向，5′-CGTGTCTCTCCCATTG-3′；(6)hes1型启动子逆转，5′-CACAG GACCAAGGAGAGGT-3′。底漆hes1型启动子序列位于位于TATA盒5′的两个CSL结合位点两侧(Jarriault等人，1995年). 每个样品至少独立制备两次，并重复运行。使用ABI 7900HT序列检测系统手册中描述的标准曲线方法计算相对DNA量。输入的DNA被定义为免疫沉淀前剪切的染色质的一小份，并用于将样品标准化为添加到每个ChIP中的染色质数量。

电磁感应加速器

用羧基荧光素（FAM）荧光标记的5′-寡核苷酸和未标记的互补寡核苷酸从Integrated DNA Technologies获得。FAM标记的寡核苷酸序列如下：c-myc公司启动子，5′-FAM-CCCCTCCGGGTTCCCAAA公司GCAGAGGG CGT-3′；变异的c-myc公司启动子，5′-FAM-CCCCCTCCCGGGTTCAAAA公司GCAGAGGCGT-3′；CSL共有结合位点，5′-FAM-TCCAAATTTTTTCCCACG公司GCGTGT-3′。如前所述制备Notch1的CSL和RAM-ANK结构域(Nam等人，2003年). 通过将2 pmol探针在30°C的结合缓冲液（10%甘油，20 mM HEPES，pH 7.9，60 mM KCl，10mM DTT，5 mM MgCl）中培养30分钟来进行非放射性同位素EMSA₂（250 ng dGdC，0.2 mg/mL牛血清白蛋白）。在4°C和180 V条件下，在10%天然凝胶中进行凝胶电泳。电泳后，立即使用Storm 860荧光成像仪（Amersham Pharmacia Biotech）通过蓝色激发荧光扫描对凝胶进行分析。为了比较CSL结合到感兴趣序列的亲和力，将带有5′末端的寡核苷酸与³²P-α-dCTP（Perkin-Elmer）和Klenow片段大肠杆菌DNA聚合酶I（新英格兰生物实验室）。³²如上所述，P标记探针与0-4000 ng重组CSL孵育。电泳后，将凝胶暴露在磷成像仪屏幕上，并使用Storm 860磷成像仪（Amersham Pharmacia Biotech）进行分析。

核径流分析

通过低渗洗涤剂裂解和离心（300×g）从50×10制备细胞核⁶所述的电池/样品(格林伯格和本德1997). 使用α进行径流反应-³²P UTP（Perkin-Elmer），然后是DNase I（500 U/样品，Invitrogen）和蛋白酶K消化。使用RNeasy迷你柱（Qiagen）分离RNA。使用Minifold II装置（Schleicher&Schuell BioScience）将每个插槽5μg线性化NaOH修饰质粒DNA转移到带正电的尼龙膜上（Hybond-XL，Amersham Biosciences）。紫外线交联后（70000μJ/cm²; UV Stratalinker 2400，Stratagene），5×10⁶将每种径流RNA样本的cpm在65°C下杂交至槽印迹过夜。清洗至高浓度（0.1×SSC/0.1%十二烷基硫酸钠，65°C）后，使用PhosphorImager（Molecular Dynamics Storm 860）和ImageQuant 5.0软件，使用“对象平均值”背景校正，对结合放射性进行量化。

DN3胸腺细胞的分离、OP9/OP9-DL1培养和GSI治疗

CD4细胞⁻CD8（CD8）⁻根据制造商的建议（Miltenyi Biotec），用抗CD4和抗CD8 MAC珠阴性选择DN胸腺细胞。用血统标记物（TCRβ、TCRγ、CD3ε、CD4、NK1.1、CD19、Gr-1、CD11b）、CD44和CD25抗原（Pharmingen）、DN3胸腺细胞（CD44^−/loCD25细胞^你好林⁻)通过在FACS Moflo（细胞化）上的细胞分选来纯化。DN3a（CD44^−/loCD25细胞^你好林⁻CD27型^洛)和DN3b（CD44^−/loCD25细胞^你好林⁻CD27型^洛)细胞在用抗CD27抗体（eBioscience）染色后通过分选纯化，如所述(Taghon等人，2006年). 细胞要么直接用于RNA提取，要么与OP9或OP9-DLL1基质细胞在存在或不存在1μM化合物E的情况下共培养16 h，如所述(Schmitt等人，2004年). 根据制造商的建议，使用RNEasy试剂盒从胸腺细胞中分离RNA（Qiagen）。

我们感谢Alan Diehl和Charles Vinson提供试剂，感谢Gerd Blobel、Tom Kadesch、David Levens、Steve McMahon、Gary Koretzky、Craig Thompson以及Pear和Aster实验室的成员提供的有用建议。J.M.得到了NIH培训拨款（T32 CA 09140-31-35）的支持。C.D.B.由人类前沿科学计划组织的长期奖学金资助，M.L.a.由康复医学基金会（FRM）资助。A.P.W.、D.W.F.、S.C.B.、W.S.P.和J.C.A.由国家卫生研究院的拨款支持。