Ccr4-Not复合物对组蛋白H3K4三甲基化和PAF复合物募集的调节

表型分析

在这里，在SC-U−/+6-氮杂尿嘧啶（6-AU）（100 μg/ml）或SC−/+5FOA（0.1%）。对于6-AU敏感性分析，用pRS316转化细胞。3-4天后评估30°C下的生长情况。

体内伸长率测定

用镀锌1-LacZ质粒在含有2%棉子糖的SC-U培养基中培养过夜，收集后转移到含有2%半乳糖的培养基中。在指定的时间点采集样本。如前所述进行RNA提取和northern blot分析(27). 使用Redi-prime II试剂盒（Invitrogen）对跨越ORF的PCR产物探针进行放射性标记。

蛋白质印迹和抗体

从YPD中生长的细胞中提取样品，并按照前面所述制备提取物(31). 蛋白质用SDS-PAGE分离，western blot分析。从Abcam中获得了抗H3K4me1（Ab8895）、H3K4me2（Ab7766）、H3 K4me3（Ab8580）、H3C79me3（Ab2621）和H3的C末端（Ab1791）的抗体。H3K36me2（#07–369）和H3K79me2（#107–366）抗体来自Upstate Biotechnology。TBP抗血清是P.a.Weil赠送的一份礼物。使用H5和H14抗体检测RNA pol II CTD的丝氨酸2、丝氨酸5磷酸化形式。使用CTD特异性抗体8WG16检测RNA pol II。用IgG-过氧化物酶结合物检测TAP标记蛋白。使用抗HA标签（12CA5和3F10）或FLAG标签（M2，西格玛）的抗体分别检测Ctr9 HA、Bur1 HA、Bur2 HA和FLAG-H2B。免疫印迹图2使用ImageQuant软件对B进行量化，并将其表示为总H3水平归一化后的WT分数。

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图2。

具体要求不是用于全局H3K4三甲基化的基因。(A类)组蛋白H3K4的单、二和三甲基化水平在基于对数增长的BY4741的裂解液中测定CCR4-非基因缺失菌株。通过SDS-PAGE（15%）分离指示菌株的蛋白提取物，并使用H3K4me1-、H3K4me2-和H3K4-me3-特异性抗体进行免疫印迹。TBP水平被确定为负荷控制。(B类)基于MY1不是使用突变菌株测定H3K4me2、H3K4me3和总H3水平，如（A）所示。使用ImageQuant软件量化H3K4me3和H3K4me2水平，并在归一化到总H3水平后表示为相对于WT。(C类)BY4741中H3K4me2和H3K4me3水平的直接比较，不是4Δ,不是5Δ和spp1型Δ应变。按照（A）进行分析。(D类)所示BY4741缺失菌株中的H3K79me2和H3K79 me3水平。按照（A）进行分析。(E类)使用菌株进行沉默分析，包含URA3公司在7号染色体左臂的端粒区域，缺乏编号4或DOT1公司。在SC板或含有5FOA的SC板上以5倍连续稀释液发现细胞。

染色质免疫沉淀（ChIP）

细胞培养和提取物制备基本上按照前面所述进行，只需稍作修改(27). 简言之，蛋白A偶联琼脂糖珠与上述抗体孵育30 在4°C下至少培养2分钟，清洗，然后用交联细胞提取物培养2–3分钟 4°C时为h。清洗珠子，洗脱DNA，并在65°C下翻转交联剂过夜。使用PCR纯化试剂盒（Qiagen）分离DNA，并通过SYBR-绿色定量PCR分析。使用涂有链霉亲和素的Dyna-bads（Dynal）纯化Not4-mycAVI，并在反向交联之前经受严格的洗涤条件（TE中的3%十二烷基硫酸钠）。如上所述进行了进一步分析。数据表示为输入的百分比，HMR位点的一个区域作为控制。

Northern印迹分析和逆转录酶qPCR

如前所述进行RNA提取和Northern印迹(27). 根据制造商的方案，使用等量的总RNA，使用随机六聚体和SuperScript II试剂盒（InVitrogen）制备cDNA。使用基因组DNA稀释序列通过SYBR-绿色定量PCR分析确定cDNA水平。

串联亲和纯化

TAP-抗原介导的蛋白质纯化基本上如所述进行(32). 简单地说，20 l YPD培养物生长至OD600～2-3，在E缓冲液中洗涤和裂解（20 mM HEPES-KOH pH值8350 mM氯化钠、10%甘油、0.1%吐温-20）。在Beckman 50.2Ti转子（45 000 下午，45 最小值，4°C）。一等分的裂解液被用于200多个样品的纯化 μl IgG琼脂糖柱（IgG-sepharose快速流动，Pharmacia）。蛋白质通过在4°C下旋转2次而结合 h，然后用35清洗 ml E缓冲液和10 ml TEV蛋白酶裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl pH值8150 mM氯化钠，0.1%吐温-20，0.5 mM EDTA和1 mM DTT）。TEV蛋白酶（100 U） 卵裂在1 18°C下2 ml h.TEV洗脱液结合到100 结合缓冲液（10）中的μl钙调蛋白亲和树脂（Stratagene） mM Tris pH值8150 mM氯化钠，1 mM氧化镁，1 mM咪唑，2 mM氯化钙₂，0.1%吐温-20，10%甘油和10 mMβ-巯基乙醇）在4°C下旋转1次 h.用25-ml结合缓冲液清洗柱，并在洗脱缓冲液（10）中回收结合蛋白 mM Tris-HCl pH值8150 mM氯化钠，1 mM氧化镁，1 mM咪唑，2 mM EGTA、0.1%吐温-20、10%甘油和10 mMβ-巯基乙醇）。如前所述，沉淀一部分纯化蛋白(33)在4–12%SDS-PAGE梯度凝胶（NuPage，Invitrogen）上分离，用Biosafe（BioRad）染色，并进行质谱分析。

串联质谱法

考马斯染色条带的凝胶内蛋白水解消化基本上如所述进行(34)，使用胰蛋白酶（罗氏）。样品经过纳米流液相色谱（安捷伦1100系列），并在C18预柱（100 μm内径，2 厘米）。在分析柱上分离肽（75 μM内径，20 cm）流速为200 nl/min，60 最小线性乙腈梯度为0至80%。LC系统直接连接到QTOF微型串联质谱仪（英国Micromass Waters）。从400到1200进行了调查扫描 a.m.u./s和前体离子在MS/MS模式下以150计数的阈值进行测序。使用Proteinx Global Server 2.1版（英国Micromass）或MASCOT软件（Matrixscience）针对SWISPROT和NCBI非冗余数据库处理数据并进行数据库搜索，前体离子和碎片离子的质量容限均为0.25-Da。通过手动解释光谱，确认了识别的肽。

高效的H3K4三甲基化依赖于Ccr4-不复杂

Bur1/2复合物与H3K4的三甲基化调控有关(15,16). 两者之间的遗传相互作用NOT4、BUR2和BUR1（燃烧室1）促使我们通过使用特定抗体分析H3K4me1、H3K4me2和H3K4-me3的全球水平，来研究Ccr4-Not复合物在这一过程中的参与。删除的菌株编号4或编号5H3K4三甲基化显著减少，但单甲基或双甲基化没有减少(图2A） ●●●●。然而，删除编号3，CCR4或任何Ccr4相关因素(CAF公司s） 没有产生这种效果(图2A） ●●●●。值得注意的是CCR4-非基因缺失表型在否3Δ电池(26,27;图1A和数据未显示）。

为了扩展这些观察结果编号1基因和其他基因的缺失不是分析了不同遗传背景下的基因。在允许的条件下不是1等位基因显示H3K4me3总体水平明显下降（定量结果显示降低了50-70%），而这些细胞的生长没有受到影响。此外，删除编号2、编号4或编号5H3K4me3水平降低（86-94%降低；图2B） ●●●●。相反，在这些菌株中只观察到H3K4me2水平略有下降(图2B） ●●●●。据报道，缺乏Spp1p的Set1p复合物不能三甲基化H3K4(36,37). 我们发现删除了编号4或编号5导致H3K4me3水平相当于删除SPP1系列(图2C） ●●●●。此外CCR4-非缺失菌株基本上没有受到影响(图2D） 尽管缺乏H3K79me2的细胞中H3K79 me2略有下降编号5观察到。如预期，删除RAD6型导致H3K79me2和H3K79 me3水平严重下降(10).

这些结果表明不是高效H3K4三甲基化的基因。同样，BUR1（燃烧室1）和BUR2（燃烧室2）三甲基化需要，但H3K4的单甲基化或双甲基化不需要(15). H3K79甲基化特异性HMT Dot1p在端粒附近基因沉默中起重要作用(38). 删除设置1导致此过程中出现类似的缺陷(4,39). 值得注意的是，端粒沉默的完整性不受编号4(图2E） ●●●●。这与端粒沉默不需要H3K4me3的概念一致(37)以及我们的观察编号4H3K4的三甲基化特别需要。

综上所述，这些结果表明不是-Ccr4-Not复合物的模块对于有效的H3K4三甲基化至关重要，但对于H3K79甲基化或端粒沉默则不重要。

H3K4三甲基化PYK1型基因座受以下基因缺失的影响编号4

调查编号4在组蛋白H3甲基化对活性基因的调控中，ChIP实验对组成活性和高表达的PYK1型使用WT和不是4Δ单元。使用特异性抗体H3K4me3、H3K4me2、H3K36me2和H3K79me2在5′和中间区域的水平PYK1型检查ORF(图3A–E）。否4Δ细胞H3K4me3水平明显下降 位于PYK1型ORF与WT的比较(图3B） ，而H3K4me2水平受编号4(图3C） ●●●●。进一步分析表明，H3K36me2和H3K79me2水平在不是4Δ电池(图3D和E）。此外，使用针对Rpb1p的CTD的抗体来测定pol II占用率，作为转录活性的测量。同时，PYK1型和管1通过定量RT-PCR测定WT和不是4Δ单元。pol II协会与PYK1型ORF和PYK1型转录水平在缺乏编号4(图3F和G）。在这些结果的基础上，我们测定了因编号2的确，检查不是2Δ单元格确认了以下要求编号2特别是在H3K4me3的调节中(图3H和I）。值得注意的是，在分析PGK1系列轨迹（未显示数据），符合更广泛的作用编号4调节H3K4me3水平。

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图3。

编号4是H3K4三甲基化所必需的，但不是PYK1型ORF。(A类)的示意图PYK1型（B–H）中使用的位点和扩增子。(B类)ChIP分析PYK1型BY4741中的ORF和不是4Δ应变。使用H3K4me3抗体对指数生长的细胞进行ChIP分析。(C类)如（A）所示，使用H3K4me2抗体。(D类)如（A）所示，使用H3K36me2抗体。(E类)如（A）所示，使用H3K79me2抗体。(F类)如（A）所示，使用CTD抗体（8WG16）。(G公司)定量反转录酶PCR分析PYK1型和管1BY4741 WT和不是4Δ应变。(H（H）)MY1 WT中H3K4me3水平的ChIP分析不是2Δ单元。(我)MY1 WT中H3K4me2水平的ChIP分析不是2Δ单元。(J型)Not4p被招募到PYK1型ORF公司。用BirA表达质粒转化表达mycAVI-tagged Not4p的菌株，并进行ChIP分析。信号被标准化为空质粒对照。

评估Not4p直接参与监管PYK1型表达，使用染色体表达的标记形式的ChIP分析编号4已执行。编码蛋白（Not4p-mycAVI）被生物素化体内通过共同表达大肠杆菌-衍生BirA生物素连接酶(40). 表型分析表明Not4p-mycAVI融合蛋白具有完全功能（数据未显示）。用链亲和素包衣珠从含有表达BirA质粒或空载体的细胞染色质提取物中捕获生物素化Not4蛋白。有趣的是，Not4p在PYK1型ORF和跨越TATA框的区域(图3J） ，与Set1p复合物的三甲基化靶向区域一致（参见图3B和H）。综上所述，这些ChIP实验证实了H3K4me3缺陷的特异性，并表明Not4p实际存在于PYK1型ORF公司。此外，删除编号4导致pol II占用率和转录水平下降，表明对PYK1型通过H3K4的三甲基化通过Not4p表达。

删除的细胞中H3K4me3水平降低编号4与RNA聚合酶II相关性的降低没有严格相关性

Set1复合物补充转录聚合酶的确切机制尚不完全清楚。然而，有人认为，RNA pol II的CTD的七肽重复序列的丝氨酸2和5的磷酸化对此很重要(2,7). 因此，H3K4me3在缺乏编号4可能是RNA pol II CTD磷酸化全局丢失的结果。使用针对磷酸化丝氨酸2、丝氨酸5或总RNA pol II（分别为H5、H14和8WG16）的抗体进行的免疫印迹分析没有显示WT和不是4Δ单元格（数据未显示）。这表明编号4调节H3K4me3水平独立于RNA pol II磷酸化。可以说，H3K4三甲基化的缺失可能是RNA pol II募集减少的结果，而不是原因。为了解决这个问题，我们调查了热休克蛋白104基因，该基因允许测定在转录中未降低的基因上的H3K4me3水平不是4Δ单元格（数据未显示）。我们观察到热休克蛋白104，尽管没有观察到的那么明显PYK1型(图4A） ●●●●。此外，我们发现RNA pol II占用率略有增加，这与转录率略有增加一致(图4A和数据未显示）。事实上，以前的观察表明H3K4甲基化不是热休克蛋白基因表达(41). 总之，该结果表明H3K4me3在不是4Δ细胞不是RNA pol II结合减少的结果就其本身而言.

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图4。

H3K4me3减少不是4Δ细胞不一定是由于RNA聚合酶II负载量减少(A类)H3K4me3和RNA pol II水平的ChIP分析热休克蛋白104轨迹。数据表示为与WT相关。H3K4me3和8WG16抗体的ChIP效率分别为2–3%和0.15–0.2%。(B类)删除编号4或SPP1系列导致H3K4me3和转录水平的类似下降PYK1型基因。BY4741的染色质提取物，不是4Δ和spp1型使用H3K4me3特异性抗体对Δ菌株进行ChIP分析。PYK1型mRNA转录水平受缺失编号4或SPP1.PYK1BY4147总RNA中的mRNA，不是4Δ和spp1型采用定量反转录酶PCR对Δ菌株进行分析。

为了进一步研究H3K4me3在转录中的作用，我们比较了H3K4me3在PYK1型WT基因座，不是4Δ和spp1型Δ单元。如所示图4B、 通过删除编号4或SPP1系列达到可比水平。此外，删除SPP1系列导致mRNA水平下降，使人联想到编号4(图4B） ●●●●。mRNA水平也有类似的降低PGK1系列基因（数据未显示）。这表明PYK1型和PGK1系列mRNA水平是H3K4三甲基化降低的结果。综上所述，这些实验表明，H3K4me3水平的降低不是4Δ细胞不是RNA pol II结合减少的直接结果。

编号4不需要Set1p复合体的HMT活性

观察到的对H3K4me3水平的影响不是4Δ细胞可能是编号4需要转录对Set1p复合物完整性或活性至关重要的编码因子的基因。例如，删除SPP1系列导致形成不能三甲基化H3K4的Set1p复合物(16). 我们通过从WT和不是4Δ菌株通过Bre2p亚单位的TAP标记版本。此外，我们通过northern blot分析测试了含有或缺乏Set1p复合亚基的菌株的mRNA表达水平编号4这表明其亚单位的转录水平和Set1p复合物的组成均不受编号4(图5A和B）。值得注意的是，从不是4Δ细胞被发现是非特异性溶酶体蛋白（数据未显示），这可能与WT或否4Δ单元。将可溶性组蛋白用作在体外HMT分析，从不是4可以检测到Δ细胞(图5C） ●●●●。此外，（预甲基化）合成肽用于确定是否从不是4Δ细胞活跃于二甲基化底物的三甲基化。值得注意的是，WT和不是4Δ细胞在修饰这种合成肽方面同样有效(图5D） ●●●●。

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图5。

中的H3K4me3缺陷不是4Δ细胞独立于Set1p复合物的直接调节。(A类)Set1p复合物成分的mRNA水平。从指数增长的BY4741和不是4Δ，并使用指示的探针进行northern印迹分析。(B类)纯化的Set1p复合物的亚单位组成。含有或缺乏菌株编号4并表达TAP标记的Bre2p用于纯化Set1p复合物（上面板）。western blot分析检查Bre2-TAP蛋白的相等表达（下表）。使用LC-MS/MS对所示蛋白质进行鉴定不是4与WT相比，Δ纯化。质谱显示，这些条带包含非相关溶酶体蛋白。我们认为这是一种提纯的人工制品，可能是由于WT和不是4Δ单元。(C类)使用纯化的Set1p复合物进行组蛋白甲基转移酶分析。使用越来越多的Set1p复合物或模拟纯化对照物甲基化可溶性组蛋白（来自小牛胸腺）在体外样品在15%SDS-PAA凝胶上分离，用考马斯染色，干燥并暴露于X射线胶片。(D类)体外合成的预甲基化组蛋白H3-尾肽的甲基化。前甲基肽被用作在体外使用从WT或否4Δ单元。样品在20%SDS-PAA凝胶上分离，干燥并暴露在X射线胶片上。使用ImageQuant软件量化信号，并在背景校正后表示为任意单位。

综上所述，这些实验表明H3K4me3缺陷的机制否4Δ细胞在转录、组成或内在活性和特异性水平上与Set1p复合物的放松调节不同。

删除编号4减少组蛋白H2B的泛素化和PAF复合物的募集

高效H3K4甲基化需要H2B泛素化(16). 为了研究Not4p在H2B泛素化中的作用，以质粒为基础的FLAG标记的H2B在不是4Δ单元。在对数生长的WT细胞中可以检测到泛素化H2B，但在缺乏H2B的细胞中，泛素水平显著降低编号4如预期，在表达FLAG标记的H2B-K123R的细胞中未检测到泛素化H2B(图6A、，39). 有趣的是，Not4p含有环填充基序并显示泛素化活性在体外（K.W.M.、A.I.和H.T.M.T.提交出版）。因此，在表达Not4p非活性（L35A）突变体的细胞中测定H3K4me3状态，作为H2B泛素化的测量。H3K4me3缺陷否4Δ细胞被Not4p的L35A突变体完全补充，这表明H2B泛素化不需要它的RING-finger(图6B） ●●●●。此外，在体外泛素化分析表明H2B不作为Not4p的底物（数据未显示）。

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图6。

删除编号4减少H2B泛素化和PAF复合物招募。(A类)编号4是高效H2B泛素化所必需的。携带FLAG的指示菌株的提取物-HTB1型质粒在12.5%SDS-PAGE凝胶上分离，并使用FLAG抗体进行western blot分析。下部面板显示相同污点的暴露时间较短，表明荷载相等。(B类)Not4p的泛素连接酶活性不参与H3K4me3水平的调节。表达H3K4的细胞提取物的甲基化状态编号4或非4L35A内源性等位基因编号4基因座和细胞缺乏编号4进行western blot分析。(C类)Ctr9-HA的表达单位为编号4和否4Δ单元。含或不含HA-tagged Ctr9p的表达菌株编号4western blotting法测定Ctr9-HA水平。H3K4me3和TBP水平用作对照。(D类和E类)编号4PAF综合体招募到PYK1型和PGK1系列ORF。对来自（C）的菌株进行ChIP分析PYK1型轨迹（放大子在上面板中有示意图）。指数生长的细胞交联，并使用抗HA（12CA5）抗体进行ChIP。

体内，H2B泛素化依赖于PAF复合物向染色质的募集(18). 为了评估Not4p在PAF复合体招募中的作用，表达HA-taged Ctr9p并含有或缺乏的菌株编号4建造完成。Ctr9-HA在两个菌株中的表达水平相同，而H3K4me3在不是4Δ电池符合预期(图6C） ●●●●。从指数增长的细胞中制备提取物，并进行ChIP分析。而Ctr9-HA在PYK1型和PGK1系列在WT细胞中，缺乏的细胞结合严重减少编号4(图6D和E）。综上所述，这些结果表明需要编号4在H2B泛素化中以及在调节PAF复合物向PYK1型和PGK1系列促进H3K4三甲基化的基因。

Bur1/2和Ccr4-Not配合物在建立H3K4三甲基化中的协同作用

H3K4三甲基化需要Bur1/2复合物(15)这涉及到Rad6p的磷酸化(16). 编码Ccr4-Not复杂亚基的基因之间的遗传相互作用(编号2、编号4和CCR4型)和BUR1（燃烧室1）和BUR2（燃烧室2），表明该复合物在转录延长中的作用(图1). 有趣的是，一些Ccr4-Not组分的缺失显示出6-AU敏感性，表明这种作用(25). 值得注意的是，公布的Ccr4-Not成分的6-AU敏感性与合成致死率之间存在严格的相关性BUR2（燃烧室2）观察到。由于Bur1/2复合物被证明参与H3K4me3水平的调节(15)，我们测定了缺乏编码Ccr4-Not成分基因的细胞中各种组蛋白H3赖氨酸甲基化标记的水平。相比之下不是-基因缺失菌株中未观察到H3K4me3水平下降ccr4号机组Δ电池(图2)表明Ccr4p和Not模块通过不同的机制促进转录延长。另一种解释可能是删除了Ccr4-Not组件BUR2（燃烧室2）导致同一途径中随后的活性部分丧失，最终导致观察到的合成致死性。

通过观察发现，PAF复合物的募集和随后H2B的有效泛素化，而非Bur1/2复合物的招募依赖于编号4然而，其他修饰如H3K4单甲基化和二甲基化或H3K79二甲基化和三甲基化不受编号4这些结果表明，导致H3K4和H3K79甲基化的途径在Ccr4上游分叉的模型并不复杂，并且与最近的报告一致，该报告显示打嗝2仅H3K4三甲基化需要(15,16). 或者，在缺乏泛素化H2B的细胞中观察到的残留程度编号4可能足以维持H3K79me2/3和H3K4me2，但不足以维持H3 K4me3水平。对这一假设的支持来自于对PAF1型显示H3K4二甲基化但非三甲基化的显著水平(43，数据未显示）。

Ccr4-Not复合物对H3K4三甲基化的调节及PAF复合物的参与

Set1p复合物（或COMPASS）代表酵母中H3K4的唯一HMT(4–6). 观察到Set1p复合物的转录、亚单位组成、活性和特异性不受Not4p的影响，这表明Ccr4-not复合物在调节H3K4三甲基化的途径中进一步上游发挥作用。发现Not4p实际存在于PYK1型ORF与H3K4三甲基标记和PAF复合物一致，表明Ccr4-Not复合物在这种修饰的调节中起着直接作用。很可能，Ccr4-Not复合物在该区域的招募有助于H3K4me3标记的定位。对Ccr4-Not复合物控制H3K4me3水平的机制的另一个重要见解来自于观察到PAF复合物招募在缺乏编号4而Bur1p和Bur2p的招募和激活不受影响(图6和​和7）。7). 已知Bur1/2激酶在PAF复合物募集的上游起作用(15). 因此，Ccr4-Not复合物既可以作用于Bur1/2激酶的下游，也可以通过平行途径调节PAF复合物的募集(图8). 值得注意的是，Not3p和Not5p都是磷蛋白(44)，但与Bur1/2复合物的联系仍未探索。在平行通路中，Bur1/2和Ccr4-Not复合物在PAF复合物向染色质的补充中相互独立。引人注目的是，删除了BUR2（燃烧室2）或编号4只导致H2B泛素化、PAF复合物募集和随后的H3K4三甲基化的部分损失(15,图2和​和66).

先前的实验将PAF复合物与Ccr4p物理联系起来(45). 然而，我们和其他人未能检测到PAF复合物成员或Ccr4-Not纯化中的Bur1p/2p(46，数据未显示）。此外，删除PAF1型导致HU敏感表型和对注册护士基因转录(47). 有趣的是，这也可以用于删除CCR4-非基因(27)和删除BUR2（燃烧室2）（数据未显示），表明这些复合物之间存在功能相互作用。另外，组蛋白密码的其他成分的改变也可能有助于Ccr4-Not complex对H3K4me3水平的调节。尽管如此，显然需要进一步的实验来阐明Ccr4-Not和PAF复合物之间的联系。

我们感谢M.Collart博士、F.van Leeuwen博士、J.Jaehning博士、W.W.Pijnappel博士、S.Buratowski博士、P.A.Weil博士、G.P.Prelich博士、A.Aguilera博士和B.Strahl博士慷慨分享试剂，感谢G.S.Winkler博士和F.C.Holstege博士批判性阅读手稿，感谢Timmers实验室成员的有益讨论、技术建议和帮助。感谢N.J.Krogan博士和B.Strahl博士在发表之前分享结果。这项工作得到了荷兰科学研究组织（NWO-MW Pionier#900-98-142和NWO-CW#700-50-034）、欧盟（改善人类潜能RTN2-2001-00026和STREP LSHG-CT-2004-502950）和欧洲工商管理局（ASTF 184.00-02）的资助。支付开放获取出版费用的资金由乌得勒支大学医学中心提供。

利益冲突声明。未声明。