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.2005年7月；25(14):6123-39.

doi:10.1128/MCB.25.14.6123-6139.2005。

Ubp10/Dot4p调节泛素化组蛋白H2B的持久性：在端粒沉默和一般染色质中的不同作用

理查德·加德纳¹, 扎拉·纳尔逊, 丹尼尔·戈特施林（Daniel E Gottschling）

附属公司

PMID： 15988024
预防性维修识别码：项目经理1168808
内政部： 10.1128/MCB.25.14.6123-6139.2005年

Ubp10/Dot4p调节泛素化组蛋白H2B的持久性：在端粒沉默和一般染色质中的不同作用

理查德·加德纳等。分子细胞生物学. 2005年7月.

.2005年7月；25(14):6123-39.

doi:10.1128/MCB.25.14.6123-6139.2005。

作者

理查德·加德纳¹, 扎拉·W·纳尔逊, 丹尼尔·戈特施林（Daniel E Gottschling）

附属

¹美国华盛顿州西雅图市19024号邮政信箱A3-025，弗雷德·哈钦森癌症研究中心，邮编：98109-1024。

PMID： 15988024
预防性维修识别码：项目经理1168808
内政部： 10.1128/MCB.25.14.6123-6139.2005年

摘要

我们之前发现泛素蛋白酶Ubp10/Dot4p通过与Sir4p的相互作用对端粒沉默很重要。然而，Ubp10p的作用机制尚不清楚。我们现在提供证据证明Ubp10p从组蛋白H2B中去除泛素；UBP10缺失的细胞增加了H2B泛素化的稳态水平。因此，ubp10delta细胞也增加了组蛋白H3 Lys4和Lys79甲基化的稳态水平。与沉默作用一致，Ubp10p优先定位于沉默染色质，其泛素蛋白酶活性保持H3 Lys4和Lys79甲基化水平较低，以实现Sir蛋白与端粒的最佳结合和整体端粒沉默。泛素蛋白酶Ubp8p也被证明可以从H2B中去除泛素，ubp8delta细胞增加了H2B泛素化的稳态水平，类似于ubp10delta细胞中的泛素化水平。然而，与ubp10delta细胞不同，ubp8delta细胞没有增加H3 Lys4和Lys79甲基化的稳态水平，也没有影响端粒沉默。尽管UBP10和UBP8分别在沉默和SAGA介导的转录中起着不同的作用，但两者的缺失导致H2B泛素化的稳态水平和表达改变的基因数量协同增加，表明Ubp10p和Ubp8p可能在其靶染色质区域重叠。我们认为，Ubp10p和Ubp8p是唯一的泛素蛋白酶，通常从组蛋白H2B中去除单泛素，并且，虽然基因组中有各自特定靶向的区域，但两者结合起来调节H2B泛素化的全球平衡。

PubMed免责声明

数字

图1。 — 图1。
Ubp10p负调控组蛋白H2B泛素化和H3 Lys4和Lys79甲基化水平。使用识别位于H2B N末端的FLAG表位的抗FLAG抗体分析全细胞裂解液中的全局稳态H2B泛素化水平（76）。还使用针对H3的单甲基、二甲基和三甲基Lys4形式的抗体以及针对H3（92）的二甲基Lys79形式产生的抗体来检测全球稳态H3 Lys4和Lys79甲基化水平。全细胞裂解物来源于菌株UCC6369（野生型）、UCC6390(ubp10Δ），UCC6392(ubp8Δ），UCC6393(ubp10Δubp8Δ）和UCC6163(放射性6Δ）。放射性6Δ细胞作为缺乏泛素的H2B的阴性对照。标高的变化(n个-相对于野生型菌株，每个突变菌株的H2B泛素化和H3 Lys4和Lys79甲基化的倍数显示在每个相应的车道下方，是三个独立实验的平均值。使用美国国立卫生研究院ImageJ软件进行定量。

图2。 — 图2。
Ubp10p优先定位于沉默染色质。使用菌株UCC6389（未标记）进行体内交联分析UBP10（UBP10）)，UCC6390(ubp10Δ），UCC6408(UBP10-6Myc公司)，UCC6406(ubp10^C371S型-6百万年)，UCC6407(ubp10^Δ^94-250-6个月)，UCC6475(UBP10-6Myc公司，沉默信息调控因子2Δ），UCC6477(UBP10-6Myc公司，sir3Δ）和UCC6479(UBP10-6Myc公司，sir4Δ). 使用与野生型Ubp10、突变体Ubp10的C末端融合的6个Myc标签特异的抗Myc抗体对Ubp10蛋白进行ChIP分析^C371S型，和突变型Ubp10^Δ94-255蛋白质。ChIP也使用未标记的野生型Ubp10p作为对照。进行多重PCR扩增以评估端粒VIR和HMR公司一，活动SAN1公司基因和被抑制的镀锌1基因。作为对照，扩增总裂解物的DNA。（A） Vistra Green染色PCR扩增的典型示例。（B）面板A中所示数据的定量分析。数值表示查询基因的免疫沉淀与总裂解物的比率，标准化为SAN1公司。所有值均为至少两个独立实验的平均值。误差条表示标准偏差。

图3。 — 图3。
损失UBP10（UBP10）主要影响端粒区域的表达。使用菌株UCC6389（野生型）和UCC6390进行转录阵列分析(ubp10Δ）对于面板A和菌株UCC6432（野生型）、UCC6435(ubp10Δ），UCC6406(ubp10^C371S型)和UCC6407(ubp10^Δ^94-250)对于B组，细胞在富培养基（YEPD）中生长到对数期，并分离和分析转录物。（A）表达增加ubp10Δ细胞显示端粒偏倚。基因数量增加ubp10Δ细胞根据端粒的位置绘制。直方图表示端粒的20 kb增量。红色直方图表示表达增加的基因；绿色直方图表示表达减少的基因。（B）ubp10^Δ^94-250细胞在端粒沉默方面存在特异性缺陷。位置聚类分析显示了基于端粒距离的基因表达变化。只有在至少一个菌株中表达大于或小于1.5倍的基因才会显示出来（显示的基因总数为222个）。位于各自端粒20kbp内的基因在左侧标记为“端粒区域”。整个标准化数据集见补充材料中的表S1。

图4。 — 图4。
Ubp10p活性的丧失导致组蛋白H3 Lys4和Lys79甲基化增加，端粒Sir3p结合减少。使用菌株UCC4825（野生型）、UCC4857进行体内交联分析(ubp10Δ），UCC4870(ubp10^c371秒)，UCC4836(ubp10^Δ^94-250)和UCC4836(sir4型Δ). 使用H3 Lys4三甲基化、H3 Lys 79二甲基化或Sir3p特异性抗体进行H3 Lys1和Lys79甲基化和Sir3p结合的ChIP分析。进行多重PCR扩增以评估端粒VIR和HMR公司一，活动SAN1公司基因和被抑制的镀锌1基因。作为对照，扩增总裂解物的DNA。（A） Vistra Green染色PCR扩增的典型示例。（B到D）面板A中数据的定量分析。H3 Lys4和Lys79甲基化的值表示查询基因的免疫沉淀与总裂解物的比率，与SAN1公司Sir3p结合的值表示端粒VIR的免疫沉淀与总裂解物的比率标准化为HMR公司一。所有值均为至少两个独立实验的平均值。误差条表示标准偏差。（B）端粒VIR处H3 Lys4三甲基化的相对折叠变化镀锌1（C）端粒VIR和镀锌1（D）端粒VIR处Sir3p结合相对减少。

图5：。 — 图5：。
损失UBP8（UBP8）不会导致组蛋白H3 Lys4和Lys79甲基化增加，端粒Sir3p结合减少。如图4图例所示，使用染色剂UCC6389（野生型）、UCC6392进行体内交联分析(ubp8Δ），UCC6390(ubp10Δ），UCC6393(ubp10Δubp8Δ）和UCC6391(sir4型Δ). （A） Vistra Green染色PCR扩增的典型示例。（B至D）如图4B至D的图例所示，对面板A中所示的数据进行定量分析。（B）端粒VIR和镀锌1（C）端粒VIR处H3 Lys79甲基化相对增加镀锌1（D）端粒病毒Sir3p结合的相对降低。（E） Ubp8p在端粒沉默中不起作用。隔夜，酵母菌株UCC6422（野生型）、UCC6423的饱和培养物(ubp10Δ），UCC6424(sir4Δ），UCC6425(ubp8Δ）和UCC6426(ubp10Δubp8Δ），其均携带URA3公司位于端粒VII（85）附近的基因被连续稀释并在YC板上发现，有或没有尿嘧啶。细胞在30°C下生长3天。

图6。 — 图6。
沉默的丧失不会影响整体H2B泛素化水平。（A） Ubp10p催化活性的丧失而不是Sir4p结合的丧失会影响H2B泛素化和H3 Lys4甲基化。来自UCC6195菌株（野生型）全细胞裂解产物的全局稳态H2B泛素化和H3 Lys4二甲基化水平UBP10（UBP10）)，UCC6199(ubp10Δ），UCC6184(ubp10^C371S型-6个月)，UCC6185(ubp10^Δ^94-250-6个月)和UCC6186(UBP10-6Myc公司)使用抗FLAG抗体（FLAG标记的H2B）或特异性识别H3-Lys4二甲基化的抗体进行测定。（B）沉默缺失并不影响H2B泛素化或H3 Lys4甲基化。如A组所述，使用菌株UCC6195对全局稳态H2B泛素化和H3 Lys4二甲基化水平进行了分析(UBP10（UBP10）)，UCC6196(沉默信息调控因子2Δ），UCC6197(sir3Δ），UCC6198(sir4Δ）和UCC6199(ubp10Δ).

图7。 — 图7。
Ubp10p和Ubp8p在其靶染色质区域重叠。（A）如图1图例所示，对全细胞裂解物中H2B泛素化和H3 Lys4及Lys79甲基化的整体稳态水平进行了分析。全细胞裂解物来源于菌株UCC6369（野生型）、UCC6390(ubp10Δ），UCC6392(ubp8Δ），UCC6393(ubp10Δubp8Δ）和UCC6163(放射性6Δ）在对数生长期、diauxie（隔夜生长至饱和）和稳定期（7天饱和）收获。（B）一些H2B泛素化持续存在于ubp10Δ和ubp8diauxie中的Δ细胞。H2B泛素化检测如图1图例所示。箭头表示双泛素化形式的H2B将按预期在何处运行ubp10Δubp8Δ单元。

图8。 — 图8。
损失UBP10基因和UBP8（UBP8）主要在活性染色质中具有协同转录效应。利用菌株UCC6389（野生型）、UCC6390进行转录序列分析(ubp10Δ），UCC6392(ubp8Δ）和UCC6393(ubp10Δubp8Δ），如图2图例所示。（A）维恩图显示了ubp10Δ,ubp8Δ和ubp10Δubp8Δ单元。（B）中的表达式更改ubp10Δubp8Δ细胞主要位于非异倍体区域。位置聚类分析显示了基于端粒距离的基因表达变化。只显示了在至少一个菌株中表达大于或小于1.5倍的基因（显示的基因总数为368）。位于端粒区域的基因标记在左侧。整个标准化数据集见补充材料中的表S1。

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