体外启动真核细胞mRNA合成需要RNA聚合酶II(Pol II)和通用转录因子(GTF),包括TBP、TFIIB、TFIIE、TFIIF和TFIIH(参考文献综述46和49). 然而,转录调控需要额外的辅因子来调节DNA结合激活物或阻遏物与Pol II和GTF之间的通讯。这些辅因子包括与TBP相关的TAF,以形成TFIID(在参考文献中审查17和54)和介体蛋白,包括Srbps,与Pol II结合形成“全酶”(参考文献综述30). 最近几家实验室的工作表明,这些复合物的多种形式存在于不同的细胞类型和不同的生长条件下(参考文献综述6). 因此,不同的辅因子复合物有助于真核基因的复杂调控模式。
我们报道了在酵母中分离和鉴定一种新形式的Pol II,与含有Srbp的“全酶”不同(51,58). 该Pol II复合体包含GTF TFIIB和TFIIF,但缺少TBP和TFIIH(51). Gal11p-Sin4p-Rgr1p亚复合物以Pol II的两种形式存在(35,51). 的产品CDC73型和PAF1型基因以Pol II的新形式存在,但在含有Srbp的全酶中没有发现。Cdc73p和Paf1p定位于细胞核,任一基因的缺失都会导致多效性表型,包括温度敏感性和生长缓慢(52). 与大多数酵母基因转录对某些Srbps的要求相反(55),只有少数基因的表达受到PAF1型和CDC73型(51,52).
为什么酵母含有至少两种复杂的Pol II起始形式?在这项工作中,我们通过鉴定在Paf1p-Cdc73p复合物中唯一发现的两个额外蛋白质,而不是在含有Srbp的Pol II形式中,开始回答这个问题。这些蛋白质,Ccr4p和Hpr1p,都与酵母基因亚群的转录有关(11,63). 这两种因子也被证明与转录机制的组成部分有遗传相互作用(16,38). 通过分析这些Pol II相关蛋白的单个和多个突变体的表型,我们发现该复合物似乎在重组和细胞壁生物合成相关基因的表达中发挥作用。将这两种看似不同的特性联系在一起的一个特征是与蛋白激酶C–丝裂原活化蛋白(MAP)激酶信号通路的已知联系(23,25).
在酵母中,由PKC1基因在维持细胞完整性方面发挥着重要作用。基因突变PKC1导致细胞溶解,渗透稳定剂山梨醇可以缓解这种情况(32,47). Pkc1p在热休克、低渗休克或α因子治疗引起的细胞膜改变时被激活(27,62). 激活的Pkc1p启动其下游MAP激酶级联的顺序激活,包括Bck1p、Mkk1p-Mkk2p和Mpk1p(Slt2p)(参考文献综述33). 膜的状态可能由假定的跨膜蛋白Slg1p向Pkc1p发出信号(18)通过需要Rho1p(一种小GTP结合蛋白)的步骤(45). 激活Pkc1p对细胞周期进展至关重要(34),在响应Cdc28p信号的芽萌发中发挥作用(18,43). Pkc1p通过与Ste20p激活的MAP激酶级联直接通信,对酵母的交配途径也很敏感(5). 在出芽和交配途径中,Pkc1p和MAP激酶级联的激活控制着新形成的细胞壁所需基因产物的合成增加(25).
Pkc1p在酵母重组中也起着不太明显的作用。黄和赛明顿(22,23)发现PKC1导致有丝分裂重组率增加,但与细胞壁生物合成基因的表达不同,与MAP激酶级联的直接联系并不明显。因此,我们发现一种含有影响细胞壁生物合成基因表达和重组频率的因子的Pol II复合物,可能开始解决Pkc1p的这两种截然不同的功能。我们的结果与包含Cdc73p、Paf1p、Ccr4p和Hpr1p功能的Pol II复合体至少部分地从PKC1激酶级联到参与重组和细胞壁完整性的靶基因。
材料和方法
菌株和培养基。
这个酿酒酵母本研究中使用的菌株如表所示菌株YJJ564、YJJ577、YJJ 662、YJ664、YJ J665、YJJ.681、YJJ-691、YJ J 693、YJJ1832、YJ J1854、YJ-J875、YJ J-879、YJ898、YJJC899、YJ J2、YJ935、YJIJ952、YJIJ 954、YJI956和YJJ1027均来自纯合子二倍体YJJ453,因此具有等基因性。YJJ998是通过将YJJ577与YJJ662配对,然后中断MPK1型通过使用下面描述的构建体在二倍体中获得基因。YJJ1027和YJJ756与YJJ75同基因。用于重组分析的HKY菌株是等基因的(16). 酵母菌株在YPD或根据标准方法制备的合成培养基中生长(19).
表1
应变 | 基因型 | 参考或来源 |
---|
YJJ453型 | 垫子一/αleu2Δ1/leu2△1 his3Δ200/his3Δ200 ura3-52/ura3-52 | 56 |
YJJ564型 | 垫子一leu2Δ1 his3Δ200 ura3-52 gal11Δ::亮氨酸2 | 52 |
YJJ577型 | 垫子αleu2Δ1 his3Δ200 ura3-52 paf1Δ::HIS3型 | 52 |
YJJ662型 | 垫子一leu2Δ1 his3Δ200 ura3-52 | 52 |
YJJ664型 | 垫子一leu2Δ1 his3Δ200 ura3-52 paf1Δ::HIS3型 | 52 |
YJJ665型 | 垫子一leu2Δ1 his3Δ200 ura3-52 cdc73Δ::HIS3 | 52 |
YJJ681型 | 垫子αleu2Δ1 his3Δ200 ura3-52 cdc73Δ::HIS3型 | 十、石 |
YJJ691型 | 垫子一leu2Δ1 his3Δ200 ura3-52 cdc73Δ::HIS3型(pEGST-CDC73型) | 52 |
YJJ693型 | 垫子一leu2Δ1 his3Δ200 ura3-52 cdc73Δ::HIS3型(pEGST) | 52 |
YJJ755型 | 垫子一bar1 his6 his7 leu2 ura3 pep4 prb1 trp1 | R.斯拉法尼 |
YJJ756型 | 垫子一bar1 his6 his7 leu2 ura3 pep4 prb1 trp1 paf1Δ::TRP1号机组 | 这项工作 |
YJJ832型 | 垫子一leu2Δ1 his3Δ200 ura3-52 sin4::LEU2级 | 这项工作 |
YJJ854型 | 垫子一leu2Δ1 his3Δ200 ura3-52 trg2Δ::HIS3型(pEGST)-TFG2型) | 52 |
YJJ855型 | 垫子一leu2Δ1 his3Δ200 ura3-52(pEGST) | 52 |
YJJ875型 | 垫子一leu2Δ1 his3Δ200 ura3-52 srb5Δ::URA3公司 | 这项工作 |
YJJ879型 | 垫子一leu2Δ1 his3Δ200 ura3-52 ccr4Δ::URA3公司 | 这项工作 |
YJJ898型 | 垫子一leu2Δ1 his3Δ200 ura3-52 hpr1Δ::HIS3型 | 这项工作 |
YJJ899型 | MATαleu2Δ1 his3Δ200 ura3-52 hpr1Δ::HIS3型 | 这项工作 |
YJJ932型 | MATαleu2Δ1 his3Δ200 ura3-52 ccr4Δ::URA3公司 | 这项工作 |
YJJ935型 | MATαleu2Δ1 his3Δ200 ura3-52 srb5Δ::URA3公司 | 这项工作 |
YJJ956型 | 垫子一leu2Δ1 his3Δ200 ura3-52 srb5Δ::HIS3型 | 这项工作 |
YJJ952型 | MATαleu2Δ1 his3Δ200 ura3-52 hpr1Δ::HIS3型(pEGST-HPR1型) | 这项工作 |
YJJ954年 | MATαleu2Δ1 his3Δ200 ura3-52 hpr1Δ::HIS3型(pEGST) | 这项工作 |
YJJ998型 | 垫子一/MATαleu2Δ1/leu2△1 his3Δ200/his3Δ200 ura3-52/ura3-52 PAF1/PAF1Δ::HIS3 MPK1/MPK1Δ::URA3 | 这项工作 |
YJJ1027型 | MATαhis3Δ1 leu2 trp1 ura3 can1 cyh2 gal1 | R.斯拉法尼 |
YJJ1036型 | 垫子一/MATαbar1 his3Δ1 his6 his7 leu2/leu2 ura3/ura3 pep4 prb1 trp1/trp1 can1 cyh2 gal1 | 这项工作 |
870-12A港元 | 垫子一亮氨酸-k::ADE2-URA3公司::leu2-k ura3-leu2-3112 his3-11,15 trp1-1 ade2-1 can1-100 | 15 |
HFY998-2C型 | 垫子一亮氨酸-k::ADE2-URA3公司::leu2-k ura3-1 leu2-3112 his3-11,15 trp1-1 ade2-1可以达到1-100 hpr1::HIS3型 | 15 |
HFY2074型 | 垫子一亮氨酸-k::ADE2-URA3公司::leu2-k ura3-1 leu2-3112 his3-11,15 trp1-1 ade2-1可容纳1-100 paf1::HIS3型 | 15 |
HFY2059-1A型 | 垫子一leu2-k型::ADE2-URA3公司::leu2-k ura3-1 leu2-3112 his3-11,15 trp1-1 ade2-1 can1-100 cdc73::HIS3型 | 15 |
HFY2085型 | 垫子一亮氨酸-k::ADE2-URA3公司::leu2-k ura3-1 leu2-3112 his3-11,15 trp1-1 ade2-1可以1-100 ccr4::HIS3型 | 15 |
HFY2162型 | MATα列2-k::ADE2-URA3公司::leu2-k ura3-1 leu2-3112 his3-11,15 trp1-1 ade2-1可以1-100 sin4::TRP1号机组 | 15 |
HFY2069型 | 垫子一亮氨酸-k::阿德2-URA3::leu2-k ura3-1 leu2-3112 his3-11,15 trp1-1 ade2-1可以1-100 srb5::HIS3型 | 15 |
蛋白质相互作用分析。
含有谷胱甘肽的菌株S公司-转移酶(GST)标记的Tfg2p和Cdc73p形式先前已有描述(51).高功率1包含pGEST载体或GST-Hpr1p构建物的Δ菌株创建如下。这个HPR1型用引物1(5′-CGCGGATCGATGTCTAATACCGAGGAATTG-3′)和引物2(5′-GCGGATCTTATTATTCATCTTGGGTAGATG-3′)PCR扩增编码区。两个引物的两侧都有巴姆HI站点。PCR产物用巴姆HI并连接到pJJ560(pGEST向量)以生成帧内GST-HPR1型在女孩发起人。将pGEST载体和pGEST-Hpr1p构建体转化到菌株YJJ899中,分别产生菌株YJJ954和YJJ952。GST-Hpr1p结构的存在,而不仅仅是载体的存在,纠正了高功率1Δ应变。GST的表达-HPR1型在中高功率1Δ菌株用Hpr1p抗体经Western blot证实。如前所述,转录活性全细胞提取物是从酵母菌株YJJ691、YJJ69、YJJ 854、YJJ1855、YJJ-952和YJJ954中制备的(61). 使用Bio-Read试剂测量全细胞提取物的蛋白质浓度。将等量的提取物与谷胱甘肽-甘露糖小球混合在SK(20)中(20 mM HEPES[pH7.9],20%甘油,10 mM MgSO4,10 mM EGTA,5 mM二硫苏糖醇[DTT],20 mM乙酸钾,1 mM苯甲基磺酰氟,0.5μg亮蛋白胨/ml,0.4μg bestatin/ml,0.35μg蛋白胨A/ml),在4°C下孵育2至4小时,用SK(20)洗涤一次,用SK(200)洗涤几次(30 mM HEPES[pH 7.9]、10%甘油、1mM EDTA、1mM DTT、200mM醋酸钾和上述蛋白酶抑制剂)。将谷胱甘肽-甘露糖珠快速旋转并用样品缓冲液洗脱。样品在十二烷基硫酸钠(SDS)–10%聚丙烯酰胺凝胶上溶解(20). 采用碱性磷酸酶或增强化学发光(ECL)检测进行蛋白质印迹分析(20). 使用的抗体来源如下:抗Paf1p(52),抗Cdc73p(51),抗Hpr1p-来自M.Christman,抗Ccr4p(42)、抗Gal11p-来自T.Fukasawa、抗Srb5p-来自R.Young、抗TFIIS和抗TBP(57).
差异显示和酵母mRNA分析。
如前所述分离总酵母RNA(13). 已描述差异显示分析(51). 通过在260nm处测量光密度来量化Northern blot的RNA样品,在1%琼脂糖甲醛凝胶上运行等量的RNA,并按照标准方法制备RNA blot(50). [α-32P] dATP标记的探针是通过随机引物制备的(50). 用T4激酶和[γ]标记18S rRNA寡核苷酸探针-32P] 列车自动防护系统(50). Northern印迹通过荧光成像仪分析进行定量。
双缺失和四分体分析。
将适当的缺失菌株进行杂交,以获得所需的二倍体菌株,并对每个二倍体至少解剖30个四分体(19). 通过分析用于替换缺失基因的不同标记,确定单个孢子的基因型。在某些情况下,PCR用于确认孢子的基因型。
缺失菌株的构建。
SRB5号机组用引物1(5′-TGCAGCAGCTAACTCCAC-3′)和引物2(5′-GACGAGACGAAGAGCTAC-3’)扩增编码区和侧翼区。PCR产物连接到pGEM-T(Promega)载体。引物3(5′-ACGAAGCTTTTTCTTAATATGGAATATAC-3′)和引物4(5′-GACGAAGCTTATATCATTGCACCTGG-3′)用于扩增结果质粒。然后将PCR产物切割成欣dIII并用1.2-kb结扎欣dIII型URA3公司来自YEp24的片段(4)给出pJJ995。pJJ995被切割成欣dIII,钝头端接Klenow,并用巴姆HI(高)/Xho公司I-cut和Klenow处理1.4-kbHIS3型YIp1片段(53)给出pJJ1072。pJJ995或pJJ1072被切割Spe公司我/囊II,用于改造YJJ453。这个MPK1型删除构造如下。MPK1型用引物1(5′-ATGGCTGAAGAGAGAGG-3′)和引物2(5′-AGGATATAGAGAGGCGAAC-3′)扩增编码区和侧翼区。PCR产物连接到PCRII(Invitrogen)载体。所得质粒用欣dIII,将4.2-kb片段与1.2-kb连接欣dIII型URA3公司YEp24中的片段(4)给出pJJ1143。pJJ1143被切割生态RI,用于改造YJJ453。这个CCR4号机组删除构造如前所述(42). 这个SIN4公司缺失构建体来源于含有正弦4Δ::LEU2级(摘自D.Stillman),类似于正弦4Δ::TRP1号机组江泽民和斯蒂尔曼描述的破坏(26). 这个HPR1型删除构造hpr1Δ::HIS3型如前所述(2). 上述缺失结构被转化为二倍体菌株YJJ453。这个paf1Δ::TRP1中断器制作如下。引物P1(5′-CTTAGCACTGAATTCGAAGG-3′)和引物P4(5’-ATACGAATGTAATGGACTCCAGGATTCGACT-3′)用于PCR扩增paf1Δ::HIS3型由基因组DNA构建(YJJ664)。将PCR产物亚克隆到pGEMT载体(Promega)中,得到pJJ902。pJJ902用Xho公司我/巴姆HI发布1.2-kbHIS3型碎片。将载体片段进行凝胶纯化并与900-bp连接Sal公司我/Bgl公司二TRP1号机组片段,导致pJJ904。pJJ904线性化为Spe公司我/囊II,用于转化酵母菌株YJJ755获得paf1Δ菌株YJJ756。这个pkc1Δ::LEU2级中断器制作如下。这个PKC1利用引物1(5′-AACTGCAGTTTCACAATTGTAG-3′)和引物2(5′-AACTGCAGTCATGGCATGACCTTCTTC-3′)对酵母基因组DNA(YJJ755)进行PCR扩增,得到编码序列和侧翼序列。
PCR产物用Pst(磅/平方英尺)一、 凝胶纯化后,在Pst(磅/平方英尺)I站点。所得质粒pJJ1193被切割成斯图我释放出一个1.3kb的内部PKC1片段,并对载体片段进行凝胶纯化并连接到2.2kb血红蛋白我LEU2级来自YEp13。所得质粒pJJ1217用线性化Pst(磅/平方英尺)我在转化YJJ756和YJJ1027杂交的二倍体酵母菌株以获得杂合二倍体YJJ1036之前。用Southern印迹和PCR分析确认基因替换。利用孢子化和四分体切割获得单倍体缺失菌株(19).
酶分析。
CYC1(日历年1)和FKS1(FKS1)发起人-lacZ公司用于β-半乳糖苷酶检测的融合报告质粒如前所述(25,28). 质粒转化酵母细胞(19)在添加4%葡萄糖的Ura-Casamino Acid培养基中生长。按照其他说明进行提取物制备和β-半乳糖苷酶分析(44). 如Zarzov等人所述,用血凝素(HA)标记的Mpk1p磷酸化MBP进行Mpk1p-激酶分析(62).
重组率的测定。
根据Lea和Coulson的中位数方法计算重组率(31)如前所述(1).
结果
Ccr4p和Hpr1p位于Paf1p-Cdc73p-Pol II复合体中。
Paf1p和Cdc73p最初被鉴定为与一种转录活性形式的Pol II相关的蛋白质,该Pol II被一种针对C末端结构域非磷酸化形式(CTD)的抗体固定[58]). 与Pol II结合并用中等盐洗脱的蛋白质包括TFIIB、TFIIF、TFIIS、Paf1p、Cdc73p、Gal11p和Sin4p的亚单位,以及大约13种其他多肽,但不包括TBP、TFIIH、Srbps或Swip-Snfp因子(58). 为了证实这些Pol II相关蛋白定义了一种不同于含Srbp全酶的Pol II形式,我们创建了带有GST标记的Cdc73p和Paf1p形式的菌株,功能上取代了CDC73型和PAF1型酵母细胞中的基因和谷胱甘肽-淀粉色谱分离复合物的组成分析(51). 这些实验证实,Cdc73p和Paf1p与Pol II、TFIIB、TFIIF、Gal11p和Sin4p在不同的复合物中被发现。延伸因子TFIIS显然定义了至少一种额外形式的Pol II,因为它不存在于任何GST标记的复合物中,也不存在于含有Srbp的全酶中(51).
与Cdc73p和Paf1p一样,据报道Ccr4p和Hpr1p都会影响酵母基因亚群的表达(11,63,37,38),在高温下生长所需(42,14)与不同于含Srbp全酶的大型蛋白质复合物相关(63,38). 因此,我们测试了在GST标记的Cdc73p-Pol II复合物中也存在Ccr4p和Hpr1p的可能性。如图所示。A、 在GST-Cdc73p复合体中发现了Ccr4p和Hpr1p(图。A、 通道8)和通过TFIIF的Tfg2p亚单位上的GST标签隔离的复合体(图。A、 车道4);GST单独控制通道中没有发现任何蛋白质(图。A、 车道2和6)。此外,我们发现GST-标记的Paf1p与Hpr1p和Ccr4p共定位(数据未显示),GST-标签的Hpr1p结构与Pol II、Cdc73p、Paf1p和Ccr4p共纯化(图。B、 车道4和未示出的数据)。
Hpr1p和Ccr4p存在于Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物中。转移SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离的蛋白质,并用针对Hpr1p和Ccr4p的抗体进行检测,如图所示。ECL用于抗体检测。(A) 如材料和方法中所述,分离转录竞争性全细胞提取物(WCE),并将其用作来源,通过谷胱甘肽琼脂糖色谱纯化GST-标记的Tfg2p、Cdc73p和相关蛋白。通道1、3、5和7(标记为IP)包含来自指示菌株的输入WCE;通道2、4、6和8(标记为B)包含与谷胱甘肽琼脂糖珠结合的蛋白质。通道1和通道2(标记为WT-GST)来自仅用GST载体转化的野生型(YJJ662)细胞;车道3和4(标记为GST-TFG2)来自tfg2型Δ突变体补充GST-Tfg2p(YJJ854);车道5和6(标有cdc73Δ-GST)来自cdc73GST载体转化的Δ(YJJ665)突变细胞;以及泳道7和8(标记为GST-CDC73型)来自cdc73Δ突变体由GST-Cdc73p(YJJ691)补充。(B) 如材料和方法中所述,分离转录竞争性WCE,并将其用作来源,通过谷胱甘肽琼脂糖色谱纯化GST-标记的Hpr1p及其相关蛋白。标有IP和B的车道如面板A所述。车道1和2(标有hpr1Δ-GST)来自高功率1Δ单独用GST载体转化的应变(YJJ954);车道3和4(标记为GST-HPR1型)来自hpr1型Δ应变经GST-Hpr1p(YJJ952)转化。(C) 根据Wade等人(58). 通道:WCE,来自转录活性WCE的40μg蛋白质;α-ς70,10μl盐稀释的部分,来自含有针对的抗体的对照柱70亚单位大肠杆菌RNA聚合酶;α-CTD,10μl来自含有针对RNA Pol II最大亚单位的C末端结构域的抗体的柱的盐稀释部分。
我们也在用于鉴定Paf1p和Cdc73p的与Pol II相关的亲和性分离蛋白的原始集合中寻找Hpr1p和Ccr4p(58). 如图所示。C、 这两种蛋白都存在于用抗CTD抗体纯化的片段亲和力中(第3道),但不存在于对照片段中(第2道)。Ccr4p和Hpr1p与Paf1p-Cdc73p-Pol II络合物的结合非常稳定,因为它耐用0.5 M醋酸钾和0.5 M硫酸铵洗涤(数据未显示)。因此,分析通过两种非常不同的纯化策略分离的复合物,GST标记的复合物和抗体亲和分离的Pol II复合物,我们发现在与Pol II、TFIIB、TFIIF以及Gal11p和Sin4p亚复合物的稳定复合物中发现了Paf1p、Cdc73p、Hpr1p和Ccr4p。虽然我们不能完全排除我们正在通过这些技术研究多种复合物的可能性,但事实上Paf1p、Cdc73p和Hpr1p彼此共定位并与Ccr4p共定位,这与Pol-II相关复合物中存在的这些因素是一致的。
我们已经证明Cdc73p可以直接与纯化的RNA Pol II结合(51),但我们没有关于这种蛋白质复合体组装的任何其他信息。因此,我们分析了突变CDC73型和PAF1型基因对复合物中其他因子丰度的影响。特别是,我们感兴趣的是,消除这些蛋白质可能会破坏其他复杂成分的稳定性。我们发现cdc73Δ和paf1Δ突变并没有减少镀锌11,CCR4号机组,HPR1型,或SRB5号机组基因。中的突变PAF1型和CDC73型对彼此的转录物丰度也几乎没有影响(数据未显示)。然而,如图。,的cdc73Δ突变,但不是paf1Δ突变似乎显著降低了Gal11p和Ccr4p的丰度,在较小程度上降低了Paf1p和Hpr1p(图。,车道2)与任一等基因野生型菌株进行比较(图。,通道1),以缺失菌株补充GST标记形式的Cdc73p(图。或paf1Δ应变(图。,车道4和5)。
基因突变CDC73型基因影响Ccr4p、Hpr1p、Gal11p和Paf1p的丰度。按照材料和方法中的描述,分析了不同转录竞争性WCE中所示蛋白质的丰度。用碱性磷酸酶检测抗体。车道1、2和4显示了野生型WCE(WT;YJJ662),cdc73Δ(YJJ665),和paf1Δ(YJJ664)细胞分别用GST载体转化。3号和5号车道秀cdc73Δ和paf1Δ突变株分别由GST-Cdc73p(YJJ691)和GST-Paf1p(YJ J676)补充。Paf1p上方的箭头指向第5通道中GST-Paf1p蛋白的位置。Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物中缺失的蛋白质,包括Srb5p、TFIIS和TBP,用作负载控制。
Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物中未发现的因子的蛋白质水平,包括TBP、TFIIS和Srb5p,在cdc73Δ应变(图。,将车道2与车道1、3、4和5进行比较)。自从cdc73Δ突变并没有降低所分析基因的mRNA丰度,这些结果表明Cdc73p可能在Pol II复合物的组装或稳定中发挥作用。Gal11p、Ccr4p、Hpr1p和Paf1p的丰度降低cdc73Δ菌株进一步支持了这一观点,即这些蛋白质存在于同一复合物中。
识别受Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物成分突变影响的转录物。
中的突变PAF1型和CDC73型只影响极少数酵母基因的转录丰度(51,52). 一般来说PAF1型影响转录物的表达多于基因突变CDC73型这一发现与其更严重的表型一致。例如,我们之前已经证明了诱导女孩染色体中基因表达的测定镀锌7+10基因和女孩启动子报告子构建体在paf1Δ,但相对不受cdc73Δ(52). 我们还分析了镀锌1,7+10等基因中的基因ccr4号机组Δ和高功率1Δ应变。我们发现了女孩a中的基因诱导ccr4号机组Δ应变实际上在速率和范围上都得到了增强,而对女孩a中的基因表达hpr1型Δ应变(数据未显示)。因此,尽管这些蛋白质在一个复合物中被明确地发现在一起,但它们对基因表达的影响并不相等。
我们之前曾报道过差动显示的使用(36)鉴定基因的表达受基因突变的差异影响PAF1型,CDC73型、和镀锌11(51). 我们已将此分析扩展到鉴定在ccr4号机组Δ,高功率1Δ和斯里兰卡5Δ应变。图中显示了已识别基因的部分集合。虽然图中显示了一些效果。看起来很微妙(不到两倍),请注意,数据代表了RNA分析的六到九个独立重复的平均值。因此,如误差线的使用所示,在许多情况下,所示的差异相对于野生型菌株的水平而言是显著的。这些研究已经确定了一些已知的基因,包括CYC1(日历年1),RSP7B型,减贫战略1、和PFK26型,以及一些未知函数的开放阅读框架。如上所述镀锌1,7+10基因,对于复合物中不同基因的突变,对转录物丰度的影响是不一样的。观察到的最常见的表达模式是,转录物在paf1Δ(注CYC1(日历年1),RSP7B型,减贫战略1,YBR265和YNR067c),并且有几个例子中转录物丰度在高功率1Δ(注减贫战略1,PFK26型和YLR346c)。然而,如前所述,在某些情况下,转录物丰度增加paf1Δ(注意YLR346c增加了四倍)。在所示的大多数示例中cdc73Δ和斯里兰卡5Δ突变对转录物丰度几乎没有影响,尽管在这些背景下YNR067c的表达减少。正如Liu等人之前观察到的(38),ccr4号机组Δ导致正极(YLR346c)和负极(CYC1(日历年1))对转录的影响。
通过差异显示识别的转录物在等基因中有差异表达paf1Δ,cdc73Δ,加仑11Δ,斯里兰卡5Δ,ccr4号机组Δ和高功率1Δ突变株。按照材料和方法中的描述进行差异显示。对编码差异表达转录物的DNA进行克隆和测序,以鉴定酵母基因。从指定的等基因菌株中分离RNA,并如材料和方法中所述探测每个基因的转录物。用荧光成像仪测定丰度,并将其归一化为18S rRNA的信号。数据是相对于野生型转录物丰度的,设置为1,在每个面板中显示为虚线。结果显示了六到九个单独RNA分离的平均值和标准偏差。用于RNA分离的酵母菌株为paf1Δ-YJJ664,cdc73Δ-YJJ665,加仑11Δ-YJJ564,斯里兰卡5Δ-YJJ875,ccr4号机组Δ-YJJ879,和高功率1Δ-YJJ898。
虽然我们不能排除转录物丰度的某些变化可能是由于次要影响,但我们可以证实,正如前面所证明的paf1Δ的减少镀锌7+10转录(52),通过使用表中所示的启动子融合报告子结构,这些效应处于转录起始水平.使用CYC1(日历年1)启动子调控区与β-半乳糖苷酶融合,我们证实了图中所示的RNA分析显示的表达减少。.Liu等人(38)已报告ccr4号机组Δ减少了CYC1-lacZ公司报告构建约为八倍,略大于CYC1(日历年1)mRNA水平见图。.影响paf1报告构建的Δ也更引人注目,与RNA分析中的4倍减少相比,表达减少了12倍以上。在斯里兰卡5Δ应变在CYC1-lacZ公司与野生型菌株相关的表达式(未显示数据),结果与图。因此,很明显CYC1(日历年1)mRNA在ccr4号机组Δ和paf1图中的Δ应变。是由于对启动子驱动的转录起始的影响。
表2
应变 | 启动子β-半乳糖苷酶活性(U/mg):
|
---|
CYC1(日历年1) | FKS1(FKS1) |
---|
野生型 | 24,000 ± 1,500 | 20,000 ± 3,200 |
paf1Δ | 1,900 ± 370 | 2,600 ± 150 |
之间的遗传相互作用PAF1型,CDC73型,CCR4号机组、和HPR1。
我们之前曾报道过paf1Δcdc73Δ双突变体是可行的,没有表现出增强的表型(51),同时paf1Δgal11Δ双突变体表现出显著增强的慢生长表型(52). 这些数据与Paf1p和Gal11p在酵母细胞中具有至少部分重叠的基本功能的想法一致,Paf1p与Cdc73p参与同一途径,因此双突变体的有害性并不比任何一个单一突变都高。为了确定PAF1型,CDC73型以及Pol II杂岩中新发现的成分,CCR4号机组和HPR1型,我们在等基因背景下创建了双突变体,如材料和方法所述。许多双突变分析在其他遗传背景中重复进行,结果相同。我们还评估了将这些基因的突变与其他全酶成分的突变相结合的效果,包括加仑11Δ,信4Δ和斯里兰卡5Δ. 基于每个双突变二倍体30个或更多四分体的结果,我们发现了遗传相互作用的广泛证据,如图所示。。我们发现将paf1Δ突变ccr4号机组Δ或高功率1Δ导致死亡。删除CCR4号机组与cdc73Δ,加仑11Δ,或高功率1Δ和具有增强的表型正弦4Δ。在每种情况下,不能存活的孢子都会发芽并形成微菌落。以下各项的组合cdc73Δ和高功率1Δ导致ts表型增强,允许温度从30°C降至22°C。这些结果,就像我们之前对paf1Δgal11Δ双突变体(51),支持这种新型Pol II复合物的成分对酵母细胞具有冗余基本功能的观点。
RNA Pol II复合物中因子成对组合之间的合成遗传相互作用。通过等基因单缺失突变体和四分体切割之间的孢子杂交获得的杂合二倍体的四分体分析。每分析一个二倍体,至少解剖30个四分体。所有的单缺失突变体在38°C时都是ts。双缺失突变体的生长表型如图所示,阴影区域突出了重要的合成相互作用(实心框,合成致死性;灰色框,合成增强)。不可见孢子的基因型是由用于删除基因的标记推断出来的。“生长缓慢”意味着双突变体的生长速度明显慢于双亲。“ts at 30°”意味着双突变体的允许温度降低到22°C。在一个没有遮蔽的盒子中的“ts”表明,双突变体的表型并不比任何一个亲本菌株差。星号表示以前发布的结果(51,52)包括完整性。杂交中使用的菌株为paf1Δ-YJJ664或-YJJ577;cdc73Δ-YJJ665或YJJ681;加仑11Δ-YJJ564;正弦4Δ-YJJ832斯里兰卡5Δ-YJJ956、-YJJ935或-YJJ 875;ccr4号机组Δ-YJJ932或-YJJ 879和高功率1Δ-YJJ898或-YJJ 899。
除了Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物中各因子之间的遗传相互作用外,我们还发现SRB5号机组和突变PAF1型,CDC73型,CCR4号机组,HPR1型,镀锌11、和信4如上所述,大多数双突变体也是在其他遗传背景下创建和分析的,结果相同。这个斯里兰卡5Δ突变与paf1Δ,ccr4号机组Δ,或正弦4Δ和具有增强的慢生长表型,与cdc73Δ,高功率1Δ,或加仑11Δ. 这表明两个Pol II复合体内部和之间都存在冗余的基本功能。
Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物参与重组。
上述差异显示和遗传分析表明,Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物中的因子具有一些类似的功能。阿奎莱拉和克莱恩(1)报告称高功率1突变导致直接重复序列之间重组水平的增加。因此,我们询问Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物中其他因子的突变是否表现出类似的表型。如表所示中的重组率paf1Δ和cdc73Δ菌株相对野生型分别增加了82倍和45倍,而在高功率1Δ应变。相比之下,重组率相对于野生型在ccr4号机组Δ,正弦4Δ和斯里兰卡5Δ应变。这一结果有力地支持了这样的观点,即Pol II复合物的某些成分中的缺陷,特别是Paf1p-Cdc73p-Pol II复合体中的缺陷会导致重组水平升高。下面将进一步讨论复合物是否直接参与重组或重组底物的形成,或间接影响此过程所需基因的表达。
表3
中的突变HPR1型,PAF1型、和CDC73型导致直接 重复
基因型一 | 重组率(10−6)b条 | 增加折叠次数 |
---|
野生型 | 3.8 ± 1.8 | 1 |
hpr1Δ | 2,700 ± 1,400 | 700 |
paf1Δ | 320 ± 50 | 82 |
cdc73Δ | 170 ± 40 | 45 |
ccr4Δ | 4.1 ± 1.9 | 1 |
sin4Δ | 3 ± 1.7 | 1 |
srb5Δ | 9.2 ± 4.8 | 2 |
细胞壁的完整性需要Cdc73p、Paf1p和Ccr4p。
两者都有paf1Δ和ccr4号机组Δ显示细胞形态扩大,甘油作为碳源的使用非常差(52,10). 此外,ccr4号机组Δ对staurosporine、8 mM咖啡因和0.04%十二烷基硫酸钠过敏(21,37,38)表明细胞壁变弱(8,39). 因此,我们测试了Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物的其他成分也可能具有细胞壁缺陷的可能性。如图所示。,两者都是paf1Δ和ccr4号机组Δ对8 mM咖啡因的生长过敏(图。B) 并且对每毫升20μg钙氟的生长有些敏感(图。D) ,另一种细胞壁完整性检测(39,48). 这些突变株和加仑11Δ应变被0.02%十二烷基硫酸钠上的生长抑制(图。C) 。表达质粒PAF1型可以纠正咖啡因和钙氟敏感性表型paf1Δ,确认表型是由PAF1型基因(数据未显示)。相反,同基因cdc73Δ,斯里兰卡5Δ,高功率1Δ和正弦4Δ菌株对这些细胞壁损伤剂的敏感性并不比野生型菌株高(图。).
中的突变PAF1型,CCR4号机组、和加仑11导致对细胞壁损伤剂的敏感性增加。等基因野生型(WT;YJJ662)和paf1Δ(YJJ664),cdc73Δ(YJJ665),加仑11Δ(YJJ564),斯里兰卡5Δ(YJJ875),ccr4号机组Δ(YJJ879),信4Δ(YJJ832),和高功率1Δ(YJJ898)在YPD或YPD加上指示的添加剂上生长。细胞在30°C下生长3至4天。
酵母细胞壁的缺陷可以通过渗透稳定剂如山梨醇来补偿。此前有研究表明ccr4号机组Δ可以通过向培养基中添加1 M山梨醇进行校正(37,38). 我们在本研究中使用的遗传背景中证实了这一观察结果,并发现加仑11Δ也可以用山梨醇进行校正(图。A) ●●●●。尽管cdc73Δ和正弦4Δ对细胞壁损伤剂不明显敏感,如图所示。,它们在高温下至少部分被山梨醇解救(图。A) 表明这些突变确实会导致一些细胞壁缺陷。尽管paf1在38°C时,山梨醇无法救出Δ(图。A) ,它确实显示了35.5°C下的部分救援(图。B) ●●●●。我们还发现,在液体培养基中加入山梨醇可显著缩短paf130°C时的Δ应变(未显示数据)。山梨醇不足以救人斯里兰卡5Δ和高功率1Δ,这一发现与它们对细胞壁损伤剂不敏感这一事实相一致。这些结果表明paf1Δ,ccr4号机组Δ,可能还有cdc73Δ应变是由于细胞壁形成缺陷引起的。
的ts表型paf1Δ,cdc73Δ,ccr4号机组Δ和加仑11Δ可以通过细胞壁稳定剂山梨醇进行校正。(A) 等基因野生型(WT;YJJ662),paf1Δ(YJJ664),cdc73Δ(YJJ665),加仑11Δ(YJJ564),斯里兰卡5Δ(YJJ875),ccr4号机组Δ(YJJ879),正弦4Δ(YJJ832),和高功率1Δ(YJJ898)菌株在38°C的YPD或YPD加1 M山梨醇上生长4天。(B) 同基因野生型(WT;YJJ662)和paf1Δ(YJJ664)菌株在YPD或YPD加1 M山梨醇的35.5°C下生长2.5天。
细胞壁生物合成基因的表达受以下因素的影响第1页Δ,cdc73Δ和ccr4Δ。
上述两种表型,即直接重复序列之间重组增加和细胞壁完整性缺陷,都是酵母蛋白激酶C突变的观察结果(PKC1) (23,47). 虽然重组和PKC1尚不清楚,Igual等人(25)通过测量细胞壁生物合成中几个关键基因的表达减少,对细胞壁缺陷提供了部分解释(FKS1(FKS1),MNN1型,气体传感器1,韩元6、和VAN2(VAN2))英寸pkc1和英里/千卡1突变菌株。因此,我们分析了Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物中突变对FKS1(FKS1),MNN1型,气体传感器1,韩元6、和VAN2(VAN2)基因如图所示。一些RNA分析的代表性示例如图所示。A、 图中显示了三组独立样本的定量。B.我们发现paf1Δ突变导致其中几个基因在允许温度下的表达减少两到三倍FKS1(FKS1)在38°C下表达。为了进行比较,Igual等人(25)报告称PKC1和中MPK1型(SLT2型),中的末端MAP激酶PKC1信号级联,减少FKS1(FKS1)信使核糖核酸丰度在30°C时为1.5至2倍,在38°C时为3至4倍。此外,他们发现MNN1型和气体传感器1表达减少了两到三倍,而对其丰度几乎没有影响韩元6和VAN2(VAN2)mRNA(25).
细胞壁生物合成相关基因的表达在paf1Δccr4Δ和加仑11Δ突变体。(A) 从等基因突变菌株中制备总酵母RNA,并按照材料和方法中的描述探测指示基因。(B) 显示的结果基于三组或多组独立分离的RNA。RNA丰度标准化为18S rRNA,野生型值设置为1,在每个面板中以虚线显示。面板中标记的RNAFKS1(FKS1)在38°C时,从从30°C转移到38°C的细胞中分离出来,并培养5 h。用于RNA分离的酵母菌株为野生型YJJ662,第1页Δ-YJJ664,cdc73Δ-YJJ665,加仑11Δ-YJJ564,斯里兰卡5Δ-YJJ875,ccr4号机组Δ-YJJ879,和高功率1Δ-YJJ898。
FKS1(FKS1)在ccr4号机组Δ应变,这一发现与Liu等人的观察结果一致(38)来自FKS1(FKS1)启动子-报告子结构相对不受基因突变的影响CCR4号机组然而VAN2(VAN2)和韩元6在ccr4号机组Δ应变和FKS1(FKS1),气体传感器1、和VAN2(VAN2)在加仑11Δ应变。虽然cdc73Δ突变对大多数检测的细胞壁基因几乎没有影响,它确实会导致FKS1(FKS1)表达,这可能有助于解释上述山梨醇的救援。这个高功率1Δ和斯里兰卡5Δ菌株在30°C下对这些基因的表达几乎没有影响,这一发现与它们对细胞壁损伤剂的抗性一致。我们还确认paf1Δ突变处于转录起始水平FKS1(FKS1)-发起人-lacZ公司报告人构建并测定突变菌株中的β-半乳糖苷酶活性。如表所示,我们观察到,在paf1Δ菌株相对于野生型,这与观察到的PKC1(25). 这些结果与Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物参与影响细胞壁生物合成的Pkc1p依赖途径的理论一致。
Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物在Pkc1p-Mpk1p MAP激酶级联中发挥作用。
如果Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物与Pkc1p-MAP激酶级联作用于同一途径,那么结合PKC1或MPK1型带有PAF1型突变对细胞壁完整性的影响不应超过任何单一突变。基因突变的表型MPK1型与基因突变的表型相比,不同菌株的突变不那么严重,变异更大PKC1(43). 因此,我们创造了paf1Δmpk1Δ双突变体在两种不同遗传背景下的影响程度不同英里/千卡1Δ突变。从两处分离的孢子mpk1Δ-mpk1 paf1Δ-paf1杂合二倍体都是活的(图。A) ●●●●。双突变孢子生长缓慢,对ts和咖啡因敏感,与paf1Δ母公司。我们还创建了paf1Δpkc1Δ双突变体,再次发现所有双突变体孢子都是活的,并且依赖于山梨醇类pkc1型Δ父级(未显示数据)。这个paf1Δpkc1Δ双突变体的生长速度确实比单突变体慢一些。然而,当我们分析FKS1(FKS1)mRNA在paf1Δmpk1Δ和paf1Δpkc1Δ双突变体我们发现与单突变体相比,表达没有额外减少(数据未显示)。我们从这些结果中得出结论PAF1型基因和PKC1和MPK1型细胞壁生物合成的基因是由于它们参与了相同的调控途径。
之间的相互作用PAF1型和MPK1型(A)杂合菌株paf1Δ和英里/千卡1对Δ(YJJ998)进行孢子化,并解剖四分体。图中显示了30个四分体中的6个,所有四分体都显示出类似的结果。根据与缺失相关的标记确定孢子的基因型。wt,野生型;m之间,英里/千卡1Δ::URA3;p、 第1页Δ::HIS3型; 议员,mpk1Δpaf1Δ. (B) 从野生型(WT;YJJ755)和paf1Δ(YJJ756)菌株含有3HA标记形式的Mpk1p,并在指定温度下生长。如Zarzov等人所述,分离标记的Mpk1p并用于磷酸化MAP激酶底物MBP(62). 数据表示MBP的磷酸化归一化为每个提取物中HA标记的Mpk1p的量。
Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物在MAP激酶级联的上游或下游起作用吗?为了在该途径中定位Pol II复合物,我们问paf1Δ表型可以通过Pkc1p或Mpk1p的过度表达来纠正。我们发现添加的单拷贝或高拷贝质粒形式PKC1型也不是高拷贝形式的MPK1型可以纠正PAF1型(未显示数据),这与Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物在PKC1-MPK1系列级联。如果Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物在激酶级联的下游发挥作用,那么末端激酶Mpk1p在paf1Δ和cdc73激活Pkc1p(热冲击)条件下的Δ应变。我们通过测量从paf1Δ和cdc73Δ应变。在这两种情况下,突变菌株中的Mpk1p与野生型菌株中的一样活跃(图。B和数据未显示)。因此,Paf1p和Cdc73p似乎在激酶级联激活的下游发挥作用,可能在受Pkc1p和Mpk1p影响的基因转录水平上发挥作用。
讨论
大量且不断增长的蛋白质已被鉴定为介导物或共激活物,这些介导物或共激活物对将信号从转录激活物和阻遏物传递到RNA Pol II至关重要(参考文献综述6). 在这项工作中,我们扩展了与Pol II相关的独特蛋白质集合的描述,每个蛋白质似乎都起到转录介质的作用。该复合物的第一组分Paf1p和Cdc73p不是由必需基因编码的,而是正常表达酵母基因子集所必需的(51,52). 在这项工作中,我们已经表明,同样由非必需基因编码的Ccr4p和Hpr1p也是Pol II复合体的组成部分,它们在酵母基因亚群的表达中发挥作用。虽然基因突变PAF1型,CDC73型,HPR1型、和CCR4号机组导致表达模式的复杂变化,在某些情况下,导致非常不同的表型,我们已经确定Pol II复合体的许多功能与蛋白激酶C信号级联中的特定作用一致。特别是,我们发现Paf1p、Ccr4p和可能的Cdc73p在细胞壁生物合成所需基因的表达中发挥作用,Paf1p,Cdc73p和Hpr1p是直接重复之间正常水平重组所需的。如引言所述,对细胞壁生物合成基因表达和重组的类似影响与PKC1(见图。).
Paf1p-Cdc73p-Pol II转录复合物和Pkc1p-Mpk1p蛋白激酶级联之间相互作用的模型。文本中提供了该模型的解释。
Paf1p、Cdc73p、Hpr1p和Ccr4p与Pol II在一个复合体中同时发现。
我们已经证明Hpr1p和Ccr4p存在于先前描述的Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物中。两种截然不同的分离程序,即RNA Pol II转录活性形式的亲和分离和Cdc73p、Paf1p、Hpr1p和Tfg2p的GST标记形式的分离,确定了这四种蛋白质存在于与RNA PolⅡ、TFIIB、TFIIF和Gal11p-Rgr1p-Sin4p亚复合物的复合物中。这些蛋白质均不以含有Srbp的Pol II形式存在(38,51,63)这进一步支持了我们早先的证据,即该复合物在生化上与含有介质的“全酶”不同。我们目前无法排除酵母细胞中存在含有这些蛋白质亚群的多个复合物的可能性,但事实上,Hpr1p和Ccr4p与Cdc73p和Paf1p的标记形式共定位,以及Ccr4p、Paf1p和Cdc73p都存在于标记的Hpr1p复合体中,这与这是一个单一复合体是一致的。这种复合物,像Pol II中含有Srbp的形式吗(29),在其他真核生物中有同源物吗?目前,没有Paf1p、Cdc73p或Hpr1p同源物的例子,尽管在数据库中可以找到Ccr4p的同源物。由于Pol II的Paf1p-Cdc73p形式在酵母细胞中含量很低(51),未能在其他系统中观察到同源物可能是由于基因产物丰度低或因子分布受限。
虽然Paf1p和Cdc73p的主要部分似乎位于Pol II相关复合物中(51),小部分Hpr1p与Paf1p和Cdc73p共定位(图。)显然,Ccr4p并非仅存在于Pol II杂岩中。有证据表明,在与Caf1p、Not1p、Not2p和Not3p相关的酵母细胞中,Ccr4p至少存在于另一种不同的复合物中(21,38). 我们在Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物或与Pol II相关的亲和性分离蛋白的原始集合中发现很少或没有Caf1p、Not1p、Not2p或Not3p(数据未显示),因此本工作中描述的Pol II复合体与not复合体明显不同。与Ccr4p存在于多个复合体的证据一致,它似乎在基因表达中起着多重作用,因为它的许多性质与Paf1p的性质截然不同。例如,尽管有一些重叠,但受这两个基因影响的转录物的谱是完全不同的(图。和和数据未显示)。此外CCR4号机组引起staurosporine敏感性(21)和6-氮杂嘧啶(数据未显示);这些表型在第1页或cdc73突变株;高功率1突变体对6-氮杂嘧啶稍敏感,但对staurosporine不敏感(7; 数据未显示)。最后CCR4号机组导致细胞周期中的细微缺陷(37)虽然我们还没有观察到PAF1型或CDC73型.
的表型paf1,cdc73,高功率1、和ccr4号机组突变与Pkc1p信号传导中的作用一致。
虽然不同PolⅡ相关因子的突变表型不完全相同,但有一些共同的模式,包括以下事实:PAF1型和CCR4号机组引起对咖啡因、钙氟和SDS的敏感性(图。); 基因突变的ts表型CDC73型和CCR4号机组,在较小程度上,PAF1型可以用山梨醇解救(图。); 和突变HPR1型,PAF1型、和CDC73型所有这些都会导致重组率升高(表).
对细胞壁损伤剂敏感性的机制可以直接解释,至少部分可以通过突变对参与细胞壁生物合成的某些基因表达的影响来解释。例如FKS1(FKS1)和韩元6对氟化钙过敏(8,39); 一PAF1型突变降低了这两种mRNA的丰度CCR4号机组突变减少了韩元6mRNA(图。). 此外气体传感器1其mRNA丰度减少了paf1,导致对SDS敏感(39). 然而,对导致对细胞壁损伤剂敏感的表达模式改变的完整解释要比图中所示的复杂得多。Lussier等人(39)最近报道了82个酵母基因的鉴定,其产物对细胞壁完整性很重要。有趣的是,这项分析中使用的基因筛查没有发现PAF1型或CCR4号机组,证实了作者的结论,即还有许多额外的基因有待鉴定。要理解各种途径中的缺陷,需要了解许多或所有这些基因的表达模式。然而,值得注意的是,我们观察到的细胞壁生物合成基因的模式如图所示。与Igual等人观察到的mRNA丰度变化非常相似(25)用于基因突变PCK1型和MPK1型这表明激酶编码基因突变的大部分影响可以通过Pol II相关因子的特性来解释。
转录和重组之间的联系。
为了确定Pol II相关因子突变的影响处于转录起始水平,我们使用启动子报告子构建体来证实上述RNA分析的结果。尽管β-半乳糖苷酶报告分析的结果与mRNA分析一致,但报告分析的效果更为显著。例如aPAF1型突变降低了FKS1(FKS1)mRNA增加2.5倍,但表达水平降低FKS1(FKS1)启动子结构接近8倍(图。和表). 我们看到了类似的效果CYC1(日历年1)mRNA和aCYC1(日历年1)报告者构造,在一个paf1背景(图。和表). Fan和Klein也观察到了同样的现象(14)查韦斯和阿奎莱拉(7)用于表达镀锌10和镀锌1mRNAs与启动子融合构建物的表达HPR1型突变背景。查韦斯和阿奎莱拉(7)表明差异是由于lacZ公司导致全长RNA丰度降低的编码区高功率1细胞。我们是否发现第1页表明这些基因在转录延伸中起着直接作用?这似乎不太可能,因为我们已经表明镀锌1中的表达式高功率1,级别镀锌1,7+10,CYC1(日历年1)、和FKS1(FKS1)mRNA(加上图中所示的许多其他mRNA。和)在paf1在某些情况下ccr4号机组和cdc73背景。我们在报告构造中看到的附加效应可能是由于通过lacZ公司基因。
查韦斯和阿奎莱拉(7)也推测伸长暂停位置lacZ公司是导致用于分析直接重复序列分辨率变化的结构中重组水平增加的原因。中的突变PAF1型,比如HPR1型,增加重组并显示增强效果lacZ公司相对于直接RNA分析的结果的报告构建体。因此,我们的结果与以下观点一致:lacZ公司基因与重组增加相关。我们不能排除Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物突变形式直接参与转录暂停导致重组水平增加的可能性。然而,该复合物还包含起始因子TFIIB和TFIIF,最初是与非磷酸化的RNA Pol II起始形式相关(51,58). 此外PAF1型和CDC73型不会导致对6-氮杂嘧啶的敏感性(数据未显示),这是一种通常表明转录延伸缺陷的表型(三,7). 因此,在这一点上,Hpr1p、Paf1p和Cdc73p对重组的影响同样可能是通过改变转录延伸或重组所需的因子的表达而间接产生的。自从HPR1型经常导致mRNA丰度增加(见图。和),可能是负责形成重组底物的因子的表达增加导致重组的急剧增加。
Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物位于Pkc1p MAP激酶级联的下游。
如上所述PKC1-MPK1系列途径被基因突变所模仿PAF1型,CDC73型,CCR4号机组、和HPR1型.观察到paf1英里/平方公里1和paf1 pkc1双突变体没有表现出增强的表型(图。以及未显示的数据),有力地支持了所有这些因素在同一途径中发挥作用的理论。我们的研究结果并不排除Pol II复合物整合来自多个信号通路的输入的可能性。事实上,复合体内许多因子的双重突变(paf1 ccr4,paf1 hpr1,cdc73 ccr4、和ccr4高功率1)山梨醇是合成致命的,不能被山梨醇解救,这与此观点一致。因此,我们的结果与Hata等人的结论一致(21)他确定Ccr4p可能在Pkc1p和独立的Caf1p(Pop2p)通路中发挥作用。不同复合物和途径的存在也与Caf1p在Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物中不存在的事实相一致。
信号通路中的Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物在哪里?以下几点支持图中所示的模型。,将Pol II复合物置于激酶级联的下游,从而直接影响靶基因的转录。首先,我们发现Pkc1p或Mpk1p的过度表达并不抑制paf1缺陷(未显示数据)。第二,尽管PKC1mRNA在paf1我们发现其他聚合酶相关因子的突变对PKC1(数据未显示),因此表明缺陷并非由于Pkc1p水平严重降低所致。第三,如图。B、 MAP末端激酶Mpk1p在热应激条件下被激活paf1应变,表明paf1这种缺陷并不是由于激酶级联被激活失败所致。最后,尽管paf1包含在pkc1突变株,突变HPR1型和CCR4号机组每个因子仅包含表型的一个子集,表明这些因子更有可能位于Pkc1p的下游。
试图确定该途径中因素的顺序的一个困难是MPK1型如Madhani等人(41),如本研究和许多其他对MAP激酶的分析中所做的那样,完全删除MAP激酶PKC1-MPK1系列通路可能导致对激酶必要性的不准确结论。当激酶蛋白缺失时,其他相关基因产物可能会弥补缺陷,而当存在缺陷形式的激酶蛋白时,可能会观察到阴性表型。由于YKL161C基因编码的另一种潜在MAP激酶(24)也被证明在细胞壁完整性中起作用(60)可能需要评估这两种激酶的作用,才能清楚地了解生化信号通路。这些问题可能有助于解释为什么黄和赛明顿(22,23)发现PKC1,但不在该途径的其他下游成分中,导致重组增加。级联中的冗余因子可能掩盖了用于这些分析的缺失菌株中重组的影响。在没有进一步澄清这个问题的情况下,我们在图中使用了一条单独的虚线。指示该活动从Pkc1p到Pol II复合体的信号路径的不确定性。
对于PolⅡ相关因子如何响应激酶级联信号,有两种可能的模型。首先,Mpk1p可直接磷酸化一个或多个Pol II相关因子,并改变其活性或组装成复合物的能力。事实上,我们观察到Cdc73p是体外Mpk1p的底物(数据未显示)。然而,我们没有检测到Mpk1p与聚合酶相关因子有任何直接关联。第二种可能性,即Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物对已知Mpk1p靶点磷酸化状态的变化作出反应,目前似乎更可能发生。已知Mpk1与多种转录调控因子相关和/或磷酸化,包括由Swi4p和Swi6p组成的SBF复合物(40),卢比1p(12,59,60)以及HMG-1样蛋白Nhp6Ap和Nhp6Bp(9). 有证据表明,这些因子中的每一个在Pkc1p-Mpk1p途径中都起作用,从而维持细胞壁的完整性。最终,研究Paf1p-Cdc73p-Pol II复合物与这些调节因子之间的相互作用将是一件有趣的事情,以确定聚合酶相关因子在Pkc1p应答基因表达中的作用。