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.2001年12月17日；20(24):7137-48.
doi:10.1093/emboj/20.24.7137。

酿酒酵母Set1复合物包括Ash2同源物和甲基化组蛋白3赖氨酸4

罗格夫 1, D Schaft公司, 舍甫琴科, W W Pijnappel公司, M Wilm先生, R Aasland公司, A F斯图尔特
附属公司

酿酒酵母Set1复合物包括Ash2同源物和甲基化组蛋白3赖氨酸4

罗格夫等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

SET域蛋白SUV39和G9a最近被证明是组蛋白3（H3）的赖氨酸9和27（仅G9a）的组蛋白甲基转移酶。酿酒酵母Set1和三胸果蝇蛋白质的SET结构域彼此密切相关，但不同于SUV39和G9a。我们对与Set1和Set1C相关的复合物进行了表征，发现它由八个成员组成，其中一个成员Bre2与三Thorax-group（trxG）蛋白Ash2同源。Set1C需要Set1来实现复杂的完整性，并且Set1和Set1C组分的突变缩短了端粒。一个Set1C成员Swd2/Cpf10也存在于裂解聚腺苷酸化因子（CPF）中。Set1C使H3的赖氨酸4甲基化，从而增加了一种新的特异性和一种已知的甲基转移酶SET域蛋白的新亚类。由于H3赖氨酸4的甲基化在真核生物中广泛存在，我们筛选了数据库并发现了其他Set1同源物。我们认为真核生物Set1Cs是H3赖氨酸4甲基转移酶，通过与Ash2同源物结合与trxG作用相关。

PubMed免责声明

数字

无
图1。Set1复合体的组成。亲和纯化的Set1-TAP复合物在7–25%SDS–PAGE上分离，并用考马斯蓝染色进行可视化。左侧显示的分子量标记单位为千道尔顿。该凝胶中存在的所有条带均已鉴定，随后通过重复和进一步亲和力纯化练习确定为Set1C特异性条带如右图所示。每个蛋白质都用可识别的蛋白质域和基序来描述，如下面的图例所示。Set1和Spp1中加厚的灰色线表示进一步保护的区域S.pombe公司蛋白质分别为Set1和SPBC13G1.08c，Bre2中加厚的灰色线表明与SPRY结构域两侧的Ash2进一步同源的程度（见图3C）。每个多肽（aa）的长度标注在右侧。所示域为：PHD指（Pfam:PF00628）；n-SET（SET1家族中的n端SET关联域；见图3A）；SET域（Pfam:PF00856）；SET后，C末端SET相关肽（SMART:00508）；WD域（Pfam:PF00400）；RIIa，蛋白激酶A调节亚单位二聚结构域（Pfam:PF02197）；RRM，RNA识别基序（Pfam:PF00076）和SPRY，SPlA激酶和ryanodine受体的结构域（Pfam：PF00622）。Bre2中的SPRY域被三次插入中断（见图3C）。显示显著比对分数的WD40域以浅绿色显示，推断比对以白色显示（数据未显示）。
无
图2。Set1C的序贯亲和纯化。对Set1C的其他七个成员中的每一个进行TAP标记，并通过考马斯蓝染色对纯化的复合物进行可视化，如每个面板所示。每种蛋白质的身份通过质谱确定，并用数字表示（见右边的键）。许多未标记的带也被鉴定出来，发现是高度丰富的蛋白质（见材料和方法）。TEV裂解后，标签的存在使标记蛋白的大小增加了约10 kDa。
无
图3。Set1C的序列分析。(A类)Set1家族成员的多序列比对显示RRM区域（上部）和n-SET/SET/postSET区域（下部）。根据吉布森的说法，为了突出保留的特征，对路线进行了颜色编码等. (1994). 每个序列中的氨基酸坐标在两个序列块中的每个序列块之后指示。RRM域（也称为RNP）以橙色条高亮显示。包括来自人类U2AF和RNPA的四个RRM进行比较。二级结构元素（H，螺旋；E，链）的赋值基于已知的RRM结构（Burd和Dreyfuss，1994）。下面，n-SET区域由一个浅绿色的条表示，SET域由一个深绿色条表示，postSET基序由一个黄色条表示。SET结构域甲基转移酶催化核心的保守残基特征（Rea等2000）用红点表示。终止密码子的位置用“<”表示。(B类)显示选定的预设区域的多重对齐。顶部显示了SUV39和G9a系列中的preSET区域，称为preSET-s。底部显示了E（Z）和ASH1族中的preSET区域preSET-E。(C)Bre2的SPRY区域与Ash2系列的多重对齐。所示的同源区域比定义的SPRY结构域在N端和C端延伸得更远，在这次比对中，该结构域从残基61开始，到283结束。显示了32、46和42个残基在Bre2中的三个插入。(天)Sdc1中一个区域与Dpy30和其他序列的多重比对，包括四个人类蛋白激酶a因子作为参考。该区域包含一个与蛋白激酶a调节亚单位的二聚化域（此处称为RIIa）相关的基序。图中显示了RIIa结构（pdb:1r2a）中两个α螺旋的位置。本图和本文其他地方使用的所有蛋白质的数据库来源见表二。
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图3。Set1C的序列分析。(A类)Set1家族成员的多序列比对显示RRM区域（上部）和n-SET/SET/postSET区域（下部）。根据吉布森的说法，为了突出保留的特征，对路线进行了颜色编码等. (1994). 每个序列中的氨基酸坐标在两个序列块中的每个序列块之后指示。RRM域（也称为RNP）以橙色条高亮显示。包括来自人类U2AF和RNPA的四个RRM进行比较。二级结构元素（H，螺旋；E，链）的赋值基于已知的RRM结构（Burd和Dreyfuss，1994）。下面，n-SET区域由一个浅绿色的条表示，SET域由一个深绿色条表示，postSET基序由一个黄色条表示。SET结构域甲基转移酶催化核心的保守残基特征（Rea等2000）用红点表示。终止密码子的位置用“<”表示。(B类)显示选定的预设区域的多重对齐。顶部显示了SUV39和G9a系列中的preSET区域，称为preSET-s。底部显示了E（Z）和ASH1族中的preSET区域preSET-E。(C)Bre2的SPRY区域与Ash2系列的多重对齐。所示的同源区域比定义的SPRY结构域在N端和C端延伸得更远，在这次比对中，该结构域从残基61开始，到283结束。显示了32、46和42个残基在Bre2中的三个插入。(天)Sdc1中一个区域与Dpy30和其他序列的多重比对，包括四个人类蛋白激酶a因子作为参考。该区域包含一个与蛋白激酶a调节亚单位的二聚化域（此处称为RIIa）相关的基序。图中显示了RIIa结构（pdb:1r2a）中两个α螺旋的位置。本图和本文其他地方使用的所有蛋白质的数据库来源见表二。
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图3。Set1C的序列分析。(A类)Set1家族成员的多序列比对显示RRM区域（上部）和n-SET/SET/postSET区域（下部）。根据吉布森的说法，为了突出保留的特征，对路线进行了颜色编码等. (1994). 每个序列中的氨基酸坐标在两个序列块中的每个序列块之后指示。RRM域（也称为RNP）以橙色条高亮显示。包括来自人类U2AF和RNPA的四个RRM进行比较。二级结构元素（H，螺旋；E，链）的赋值基于已知的RRM结构（Burd和Dreyfuss，1994）。下面，n-SET区域由一个浅绿色的条表示，SET域由一个深绿色条表示，postSET基序由一个黄色条表示。SET结构域甲基转移酶催化核心的保守残基特征（Rea等2000）用红点表示。终止密码子的位置用“<”表示。(B类)显示选定的预设区域的多重对齐。顶部显示了SUV39和G9a系列中的preSET区域，称为preSET-s。底部显示了E（Z）和ASH1族中的preSET区域preSET-E。(C)Bre2的SPRY区域与Ash2系列的多重对齐。所示的同源区域比定义的SPRY结构域在N端和C端延伸得更远，在这次比对中，该结构域从残基61开始，到283结束。显示了32、46和42个残基在Bre2中的三个插入。(天)Sdc1中一个区域与Dpy30和其他序列的多重比对，包括四个人类蛋白激酶a因子作为参考。该区域包含一个与蛋白激酶a调节亚单位的二聚化域（此处称为RIIa）相关的基序。图中显示了RIIa结构（pdb:1r2a）中两个α螺旋的位置。本图和本文其他地方使用的所有蛋白质的数据库来源见表二。
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图3。Set1C的序列分析。(A类)Set1家族成员的多序列比对显示RRM区域（上部）和n-SET/SET/postSET区域（下部）。根据吉布森的说法，为了突出保留的特征，对路线进行了颜色编码等. (1994). 每个序列中的氨基酸坐标在两个序列块中的每个序列块之后指示。RRM域（也称为RNP）以橙色条高亮显示。包括来自人类U2AF和RNPA的四个RRM进行比较。二级结构元素（H，螺旋；E，链）的赋值基于已知的RRM结构（Burd和Dreyfuss，1994）。下面，n-SET区域由一个浅绿色的条表示，SET域由一个深绿色条表示，postSET基序由一个黄色条表示。SET结构域甲基转移酶催化核心的保守残基特征（Rea等2000）用红点表示。终止密码子的位置用“<”表示。(B类)显示选定的预设区域的多重对齐。顶部显示了SUV39和G9a系列中的preSET区域，称为preSET-s。底部显示了E（Z）和ASH1族中的preSET区域preSET-E。(C)Bre2的SPRY区域与Ash2系列的多重对齐。所示的同源区域比定义的SPRY结构域在N端和C端延伸得更远，在这次比对中，该结构域从残基61开始，到283结束。显示了32、46和42个残基在Bre2中的三个插入。(天)Sdc1中一个区域与Dpy30和其他序列的多重比对，包括四个人类蛋白激酶a因子作为参考。该区域包含一个与蛋白激酶a调节亚单位的二聚化域（此处称为RIIa）相关的基序。图中显示了RIIa结构（pdb:1r2a）中两个α螺旋的位置。本图和本文其他地方使用的所有蛋白质的数据库来源见表二。
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图4。分析Set1C中的交互。Set1C的结构在集合1通过亲和纯化携带TAP-tagged Set1C成员的菌株，如上文所示。所有蛋白质的特性，包括许多未标记的非特异性条带都是通过质谱建立的。数字与图2相同，为2，Bre2；3、Swd1；4、Spp1；6、Swd3；7、Sdc1；8，第1页。
无
图5。Set1C特异性地甲基化H3的赖氨酸4。组蛋白甲基转移酶活性通过H3尾肽（A）或游离组蛋白（B）与亲和纯化提取物的培养进行检测，该提取物由携带TAP标签的酵母菌株制备，并与Clr4或Set1C组分融合，如上文所示。提取物由野生型或集合1菌株如图所示。TAP-Clr4提取物是从携带TAP-Cll4CEN质粒的野生型菌株中制备的。(A类)提取物与H3 N末端肽在S公司-腺苷-L（左）-[甲基-三H] 蛋氨酸和通过过滤器结合测定的结合放射性。缓冲液，培养所有试剂，不添加任何提取物。(B类)提取物与游离组蛋白在S公司-腺苷-L（左）-[甲基-三H] 蛋氨酸，然后进行凝胶电泳和考马斯蓝染色（左）和荧光照相（右）。(C)从包括Bre2-TAP在内的野生型菌株中分离出的Set1C与携带赖氨酸4到亮氨酸（K4L）或赖氨酸9到亮氨酸突变（K9L）的H3 N-末端肽孵育。
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图6。维持端粒长度需要Set1C活性。使用端粒特异性探针通过Southern印迹策略观察端粒。从以下菌株中分离出基因组DNA：集合1（车道1）；野生型（车道2）；Set1-TAP（车道3）；TAP-Set1（车道4）；短纤维2（车道5）；swd1型（6号车道）；开关电源3（第7车道）。
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图7。用两种不同的标准对SET域进行分类会产生相同的分组。在左侧，显示了基于SET域多序列比对的SET域的非根树，其中不包含preSET和postSET区域。有四大类明显[SUV39、ASH1、SET1/TRX、E（Z）]。右侧描述了侧翼层序元素的分布。已知的甲基转移酶存在于四个主要分支中的三个分支中，是盒装的。
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