分子细胞生物学。2003年10月；23(19): 7005–7018.
RNA聚合酶II高效转录延伸需要Bur1激酶
， ，和*
迈克尔·克里斯托弗·基奥
马萨诸塞州波士顿哈佛医学院生物化学和分子药理学系02115
弗拉基米尔·波多尔尼
马萨诸塞州波士顿哈佛医学院生物化学和分子药理学系02115
斯蒂芬·布拉托夫斯基
马萨诸塞州波士顿哈佛医学院生物化学和分子药理学系02115
马萨诸塞州波士顿哈佛医学院生物化学和分子药理学系02115
*通讯作者。通讯地址：马萨诸塞州波士顿龙伍德大道240号哈佛医学院生物化学和分子药理学系，邮编02115。电话：（617）432-0696。传真：（617）738-0516。电子邮件：ude.dravrah.smh@贝弗茨. 收稿日期：2003年2月20日；2003年4月8日修订；2003年7月2日接受。
摘要
这个酿酒酵母细胞周期依赖性激酶（CDK）Bur1（Sgv1）可能与哺乳动物Cdk9同源，在转录延伸中发挥作用。虽然Bur1可以在体外磷酸化Rpb1羧基末端结构域（CTD）激酶，但在普遍存在的七肽YSPTSPS中，它对Ser2或Ser5没有很强的特异性。BUR1（燃烧室1）突变体对药物6-氮杂嘧啶和麦考酚酸敏感，并与伸长因子Ctk1和Spt5发生遗传相互作用。染色质免疫沉淀实验表明，Bur1及其细胞周期蛋白伙伴Bur2被招募到转录延伸复合物中，与活性转录基因交联。有趣的是，Bur1显示多聚腺苷酸化位点下游转录区的交联减少。此外，毛刺1突变株在基因3′端相对于启动子区域的RNA聚合酶II交联比率降低。CTD丝氨酸2和5的磷酸化在突变细胞中表现正常，这表明Bur1不是共转录Rpb1磷酸化的重要来源。这些结果表明，Bur1在转录延伸中起作用，但可能磷酸化CTD以外的底物。
RNA聚合酶II（RNApII）合成mRNA需要转录复合物组装、启动、启动子清除、延伸和终止(22，23). 每个步骤都是一个潜在的调节点。Rpb1是RNApII的最大亚单位，在基因表达中起关键作用(23，27). 除了酶活性外，Rpb1还含有一个保守的羧基末端结构域（CTD），在转录中起着核心作用(15). 这个酿酒酵母CTD包含共有七肽YSPTSPS的27个重复序列(2，13). 在转录过程中，CTD受到一系列细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的多重磷酸化作用。磷酸化主要发生在七肽的丝氨酸2（S2）和丝氨酸5（S5）上(13).
未磷酸化的Rpb1优先被招募到起始前复合物中，并在从起始到伸长的过渡过程中被磷酸化。启动子中以S5磷酸化形式的CTD为主，而S2磷酸化CTD在远端更为普遍(11，36). 高磷酸化CTD是参与mRNA成熟的复合物的对接位点，包括那些参与封盖、剪接和多聚腺苷化的复合物(12，27，46，47). CTD尾部靠近RNApII的信使核糖核酸出口通道，提供了与加工机器接近的新生转录物(14).
四个酿酒酵母据报道，CDK使CTD磷酸化。解释这些激酶之间功能差异的一个吸引人的理论既涉及CTD内不同的位点偏好，也涉及不同的活动时间窗(26，36). Srb10（哺乳动物同源物为Cdk8）是介体的一种成分，但可能在起始前复合物形成之前磷酸化CTD，从而充当转录抑制剂(20，26). Srb10还磷酸化CTD以外的底物(1，三，28，50). Kin28及其细胞周期蛋白伙伴Ccl1（与哺乳动物cdk7/cyclin H同源）是基础转录因子TFIIH的亚单位。Kin28磷酸化预引发复合物中S5上的CTD。这种磷酸化事件对封盖机的补充很重要(6，62). Ctk1和Ctk2是CTDK1复合物的催化亚基和细胞周期蛋白亚基(38，41，44，70). Ctk1的确切作用尚不清楚，但它与转录延伸复合物有关，并且在转录的这个阶段对S2的磷酸化是必要的(11). 删除CTK1型基因导致许多表型和遗传交互作用，与伸长的作用一致(38，41，44).
酵母中第四个依赖细胞周期蛋白的CTD激酶是Bur1（也称为Sgv1）。Ctk1和Bur1与哺乳动物Cdk9的序列相似性相当。Bur1在两个独立的选择中被鉴定：作为Gpa1（Val50）突变引起的交配信息素超适应的抑制剂(30)作为一种突变，可以增加SUC2公司基础启动子缺乏上游激活序列（UAS）（绕过UAS要求）(57). Bur1和Bur2形成一个发散的CDK-cyclin对(76). 许多隐性表型被归因于Bur1突变体。原件sgv1型突变等位基因不在高温或低温下生长，对α因子生长停滞敏感(30). 这种突变体在非允许温度下捕获大的未添加细胞，但可以通过过度表达激活物来拯救CLN3号机组突变体(cln3-2号机组). 一些Bur1(毛刺1-2)和Bur2突变等位基因(bur2-1型和bur2-2型)展示Spt−表型、产孢缺陷和对2%甲酰胺或15 mM咖啡因的敏感性(57，76). 这两个基因之间有一个差异：毛刺1Δ据报道是致命的，而毛刺2Δ可行(76).
Bur1协同免疫沉淀Rpb1并磷酸化S5上的CTD(48). 基因筛选表明毛刺1-2等位基因与Rpb1 CTD截断在遗传上相互作用，一些kin28型突变体，ctk1型Δ，CTD磷酸酶Fcp1的催化突变体(fcp1-110型),标准贯入试验4Δ,标准普尔5-194，并删除延伸系数TFIIS(第2页Δ) (44，48). 然而，与斯里兰卡10观察到Δ(44). Bur1突变体也对核苷酸类似物6-氮杂嘧啶（6AU）敏感(48). 虽然Bur1影响转录，但它似乎不是预引发复合物的成分(61). 所有这些结果都与Bur1在转录延伸中的作用一致，但并没有证明。
为了进一步探讨Bur1的作用，我们生成并分析了一系列突变体。与其他CDK一样，Bur1在T环上磷酸化。除了典型的CDK激酶结构域外，Bur1还有一个扩展的C末端区域。激酶活性对Bur1功能至关重要。T环磷酸化和C末端区域不是必需的，但这些特征的突变导致不同的表型模式，表明这两个结构域的作用是可分离的。在染色质免疫沉淀（ChIP）分析中，Bur1及其细胞周期蛋白伴侣Bur2以依赖于转录但不依赖于Bur1激酶活性的方式与基因编码区交联。有趣的是，RNApII通过多聚腺苷化位点转录后，Bur1和Bur2的交联下降。使用温度敏感突变体使Bur1失活会导致延伸RNApII的交联减少，这在基因的3′端最为明显。这种模式与6AU存在下生长的细胞非常相似。值得注意的是，CTD S2和S5的共转录磷酸化在Bur1突变体中没有受到强烈影响。基于这些结果，我们认为Bur1激酶通过磷酸化CTD以外的底物来促进伸长。
材料和方法
酵母菌株、基因操作和培养基。
表中列出了本研究中使用的酵母菌株所有菌株均为S288C背景。括号表示上位质粒。一份BUR1（燃烧室1）在二倍体菌株YSB455中，通过用HIS3型标记。一个衍生的单倍体菌株YSB787，包含野生型的上染色体拷贝BUR1（燃烧室1）a上的基因URA3公司-标记质粒（pRS316-BUR1）用于重组质粒毛刺1突变体。酵母菌株通过乙酸锂程序转化(19). 使用了培养基制备、交配、产孢和四分体分析的标准方法(5，21).
表1。
| 应变 | 基因型 | 来源 |
|---|
| YSB455型 | 垫子一/αura3-52/ura3-52列伊Δ1/列伊2Δ1个trp1Δ63/trp1号机组Δ63他3Δ200/his3个Δ200 lys2Δ202/lys2年Δ202 | 实验室菌株 |
| YSB725型 | 垫子αura3-52列伊Δ1个trp1Δ63他3Δ200 lys2Δ202 | 本研究 |
| YSB726型 | 垫子一ura3-52列伊Δ1个trp1Δ63他3Δ200 lys2Δ202 | 本研究 |
| YSB759型 | 垫子一kin28Δ：：LEU2 tfb1Δ：:LEU2 ura3-LEU2-3112 trp1-1 his3-ade2-1（pRS314-haKIN28;pRS313-TFB1-6他的) | Keogh等人(34) |
| YSB770型 | 垫子一BUR1-（HA）三：：TRP1（KL）ura3-52 leu2Δ1 trp1Δ63他3Δ200 lys2Δ202 | 本研究 |
| YSB772型 | 垫子一CTK1-（HA）三：：TRP1（KL）ura3-52 leu2Δ1个trp1Δ63 his3Δ200 lys2Δ202 | Cho等人(11) |
| YSB776型 | 垫子一SRB10-（HA）三：：TRP1（KL）ura3-52 leu2Δ1个trp1Δ63他3Δ200 lys2Δ202 | 本研究 |
| YSB777型 | 垫子一MED6-（HA）三：：TRP1（KL）ura3-52 leu2Δ1个trp1Δ63他3Δ200 lys2Δ202 | 本研究 |
| YSB787型 | 垫子一bur1Δ：：HIS3 ura3-52 leu2Δ1个trp1Δ63他3Δ200 lys2Δ202（pRS316-BUR1） | 本研究 |
| YSB788型 | 垫子αbur1Δ：：HIS3 ura3-52 leu2Δ1个trp1Δ63他3Δ200 lys2Δ202（pRS316-BUR1） | 本研究 |
| YSB789型 | 垫子一bur1△：：his3△：：TRP1/菅直人对ura3-52列伊Δ1个trp1Δ63 his3Δ200 lys2Δ202（pRS316-BUR1） | 本研究 |
| YSB797型 | 垫子一bur1△：：HIS3 ppr2△：：hisG ura3-52 leu2Δ1个trp1Δ63他3Δ200赖氨酸2Δ202（pRS316-BUR1） | 本研究 |
| YSB799型 | 垫子αbur1Δ：：HIS3 suc2Δ无人机(−1900/−390)ura3-52列伊Δ1声嘶嘶声3Δ200或HIS3 trp1型Δ63只lys2-128δ（pRS316-BUR1） | 本研究 |
| YSB813型 | 垫子一BUR2-（HA）三：：TRP1（KL）ura3-52 leu2Δ1个trp1Δ63他3Δ200 lys2Δ202 | 本研究 |
| YSB855型 | 垫子一bur1△：：his3△：：TRP1/菅直人对ctk1Δ：：HIS3 ura3-52 leu2Δ1 trp1Δ63他3Δ200 lys2Δ202（pRS316-BUR1） | 本研究 |
| YSB856型 | 垫子一bur1Δ：：HIS3 spt5-194 ura3-52 leu2Δ1声嘶嘶声3Δ200 lys2-128δ（pRS316-BUR1） | 本研究 |
| 121财年 | 垫子一例如2Δ无人机（−1900/−390）尿酸-52 trp1Δ63只lys2-128δ他的4-912δ | 普雷利希和温斯顿(57) |
| 吉100 | 垫子一例如2Δ无人机(−1900/−390)bur1-2、ura3-52、leu2Δ1个lys2-128δ他的4-912δ | 普雷利希和温斯顿(57) |
| 594加纳 | 垫子αspt5-194ura3-52 his3Δ200 lys2-128δ | Hartzog等人(25) |
质粒。
酵母质粒基于pRS序列(67). 对于Bur1的突变分析，一个2.45-kb的片段包含BUR1（燃烧室1）PCR扩增5′启动子区的开放阅读框（ORF）（无终止密码子）和≈400 bp酿酒酵母基因组DNA使用Pfu公司聚合酶和寡核苷酸Bur1 5′囊I（N）（GATCGAGCTCCGAGAATCAGCCGTTGG）和Bur1 3′FL-Bam（CTAGGGATCCATATAGATCCAATATCACTATTTTGG）。将得到的产物进行凝胶纯化，并在含有血凝素（HA）的框架中克隆三表位标签和羧基末端的SSN6终止子。将该产品转移到pRS315以创建pRS315-BUR1-HA三.
使用PCR-介导的定点突变在Bur1（T70A、E107Q、D213A、T240A和T240D）中产生点突变(29，34). 底漆Bur1 5′囊I（N）和适当的诱变引物（序列可根据要求提供）用于扩增BUR1（燃烧室1）基因。将得到的PCR产物进行凝胶纯化，并将其作为5′大引物用于第二次PCR，其中3′引物为Bur1 3′FL-Bam。将得到的2.45-kb扩增片段克隆到pRS315-（HA）中三-SSN6使突变蛋白在C末端标记为表位。
染色体位点的表位标记。
利用PCR策略生成含有（HA）三表位和乳克鲁维酵母TRP1基因两侧有来自靶基因3′端的序列。同源重组插入物由pKL-TRP（HA）PCR扩增三如前所述(59)使用合适的引物（序列可根据要求提供）。转化和同源重组将（HA）三靶基因羧基末端框架中的表位。使用异源选择转化体TRP1号机组标记，并用免疫印迹法进行标记。为此工作标记了Bur1、Bur2、Med6、Ctk1和Srb10蛋白质。
Bur1温度敏感等位基因的分离。
BUR1（燃烧室1）被PCR错误整合后随机诱变塔克聚合酶和偏置脱氧核苷三磷酸浓度（0.4 mM dGTP、dCTP、dTTP和0.1 mM dATP）。PCR片段包含BUR1（燃烧室1）该基因与囊二/Xba公司pRS315-Bur1-HA的I型切割主干三-SSN6。这个缺口质粒包含约500 bp的5′和3′与PCR产物重叠，允许在体内进行重组。在缺乏亮氨酸的培养基上选择菌落。在用5-氟代甲酸（5-FOA）洗出野生型Bur1质粒后，在30和37°C下对细胞进行复制电镀，以筛选温度敏感性。质粒DNA从温度敏感型中解救出来(ts秒)候选和重传以确认质粒连锁。
选择了7个等位基因进行进一步分析：伯尔1-23，-80和-85（非常强大ts秒),布尔1-35，-51个和-65（强大ts秒)、和bur1-78型（弱ts秒). ORF的测序显示每个等位基因包含多个独特突变，如下所示：伯尔1-23（Q258R、L326Q、L334Q、K366R、I375K、Y462C、A478V和N509K）；布尔1-80（N5S、L155P、K374E、T379A和N550Y）；布尔1-85（D31G、R83G、E95G、Q290L、S534P、R553G、N568D、K585停止和S616T）；布尔1-35（S45G、F70L、I147T、I200T、E316G、I387T、K470R、V482A和K522R）；布尔1-51（R44G、V49A、A86V、I109T、G235S和Y351H）；伯尔1-65（Q177R、P301Q、H361R、K441 M、E454G和N458D）；bur1-78型（M175V、L179S、L254F、K278E和H361L）。
蛋白质分析和免疫沉淀。
如前所述，通过玻璃珠破坏细胞制备酵母全细胞提取物(34). 使用标准方法进行免疫印迹。（公顷）三-如12CA5-protein A-completed beads所示，标记蛋白从全细胞提取物中免疫沉淀。通过在Tris-EDTA（TE；pH 8.0）中混合每个样品10μl蛋白A树脂和2μl 12CA5腹水制备复合物，并在4°C下轻轻滚动培养30分钟。通过离心法造粒珠子，用1 ml TE（pH 8.0）洗涤两次，并用TE（pH值8.0）1:1稀释。然后在每个样品中加入10μl等分的该混合物。每个免疫沉淀的蛋白质输入如图所示，但在所有情况下，样品均在4°C下轻轻滚动过夜。在分析之前，通过离心将珠粒化，并在1 ml裂解缓冲液（20 mM HEPES[pH7.6]，200 mM KOAc，10%甘油，1 mM EDTA）中洗涤三次。
体外CTD激酶检测。
重组谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）-HA-CTD融合蛋白（见图。)或由GST融合的凝血酶裂解的HA-CTD蛋白（见图。)用免疫沉淀（HA）磷酸化三-标记蛋白和[γ]32P] 如上所述的ATP(34). 每25μl反应体积的最终浓度为20 mM HEPES-NaOH（pH 7.6）、7.5 mM醋酸镁、2 mM二硫苏糖醇、100 mM醋酸钾、2%甘油、25μM ATP、0.5μl[γ-32P] ATP（3000 Ci/mmol；新英格兰核电厂），100 ng GST-CTD。反应在室温下孵育30分钟，通过十二烷基硫酸钠-10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行解析，转移到硝化纤维素中，并暴露在X射线胶片上。
Bur1突变等位基因的体外CTD激酶活性。（A） 表达表位标记Bur1突变体的质粒被转化为含有未标记野生型Bur1的YSB787。请注意，由于E107Q和D213A等位基因无法支持生长，因此此处未进行质粒重组。标记的含Bur1的复合物用12CA5蛋白A珠免疫沉淀并分离。在上部面板中，沉淀用抗HA（12CA5）抗体进行免疫印迹。FL，全长蛋白；CΔ，C末端截断蛋白。请注意，免疫球蛋白重链与Bur1 CΔ突变体紧密迁移，形成背景带。用放射性标记的ATP和HA-CTD融合蛋白测试免疫沉淀物的其他等分样品的激酶活性（见材料和方法）。下部面板显示了暴露于放射自显影的反应混合物的SDS-PAGE，显示了Bur1的CTD磷酸化和自磷酸化。注意，Bur1 CΔ蛋白在CTD底物附近运行。Bur1CΔ蛋白自磷酸化在缺乏CTD底物的反应中得到证实。（B） 按照A组所述制备免疫沉淀物。用抗HA（12CA5）抗体检测斑点，以确定Bur1、抗Bur2（由Greg Prelich慷慨提供）或抗TBP作为阴性对照。
不同CTD激酶的比较。（A） 从适当的HA标记菌株制备全细胞提取物：Kin28（YSB759）、Ctk1（YSB772）、Srb10（YSB77）、Med6（YSB7）和Bur1（YSB 770）。用12CA5蛋白A珠免疫沉淀指示的表位标记激酶复合物，并用SDS-PAGE和12CA5免疫印迹分析进行分析。中间常见的带是抗体。（B） 用[γ]测定免疫沉淀蛋白复合物的激酶活性-32P] ATP和重组GST-HA-CTD。酪蛋白激酶I用作对照。CTD的磷酸化降低了其凝胶流动性变化（带P*的箭头表示磷酸化形式）。通过放射自显影术（顶面板）、12CA5抗体（抗-HA）或磷酸表位特异性单克隆抗体8WG16（抗-CTD）、H5（抗-CDD S2p）和H14（抗-CDT S5p）观察不同形式的GST-HA-CTD。Bur1 AutoRad和抗-HA面板中未磷酸化GST-HA-CTD下方的附加带为自磷酸化HA-Bur1。
表型分析。
为了进行斑点分析，细胞在10时重新悬浮7/ml，并进行10倍连续稀释。每个平板上取20μl等分稀释液。测定菌株对6AU（10、25、50或75μg/ml）或麦考酚酸（MPA；15μg/ml）的敏感性。如图所示，在48或72小时时对生长进行分析。
炸薯条。
染色质免疫沉淀（ChIPs）基本上如前所述进行(36，39)稍作修改。每种菌株的250-ml体积在600 nm（OD）下生长到光密度600)在必要时补充的合成完全培养基中为≈0.6。将甲醛添加到最终浓度为1%的溶液中20分钟，并通过将甘氨酸添加到240 mM来终止反应。通过离心收集细胞，用Tris缓冲盐水洗涤两次，并在FA裂解缓冲液（50 mM HEPES-KOH[PH7.5]）中用玻璃珠溶解，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1%Triton X-100，0.1%Na-脱氧胆酸盐，0.1%SDS，1 mM-苯甲基磺酰氟）。通过超声波剪切染色质，使平均片段大小在200到500 bp之间。
对于免疫沉淀，在室温下用蛋白A-琼脂糖或蛋白G-Sepharose CL-4B珠预先培养单克隆抗体30分钟，并用TE（pH 8.0）清洗一次。然后添加染色质溶液，并在4°C下培养反应过夜。洗涤免疫沉淀物，蛋白酶处理，并去交叉连接。PCR条件如前所述(36). PCR产物用Fujix BAS 2040荧光成像仪定量。根据输入样本计算每个引物对相对于V号染色体no-ORF控制对的扩增效率。然后使用该值对从每个免疫沉淀中获得的特定信号进行标准化。将该标准化值除以no-ORF控制的背景放大，得出一个相对值（与内部控制相比是x倍），从而可以对样本进行趋势比较。对于来自同一染色质样本的IP和PCR，变异性通常不超过信号的10%至20%。
结果
Bur1突变体分析。
Bur1具有代表CDK的典型基序。对一些保守残基进行突变，以测试催化和调节性磷酸化对Bur1活性的贡献。对Bur1蛋白序列的分析表明，N末端区域类似于CDK。C末端区域（氨基酸392-657）没有显著的同源物，其功能未知。基于与人类CDK2结构的一致性(32，63)，Bur1 E107预计是催化位置内PSTAIRE回路的一部分，D213预计参与镁的配位。有两个潜在的磷酸化位点：T240被预测为激活磷酸化的位点，而T70对应于一些CDK中的失活磷酸化位点（参考文献综述68)（图。).
Bur1突变体的体内分析。（A） Bur1蛋白的示意图，显示了针对突变的残基。（B） 突变蛋白以正常水平表达。所示HA三-已标记BUR1（燃烧室1）等位基因通过质粒改组取代野生型基因。用SDS-PAGE解析全细胞提取物，用抗HA（12CA5）抗体免疫印迹法检测其表达水平。50kDa附近的非常暗的带是一种与12CA5抗体交叉反应的蛋白质。FL，全长蛋白；CΔ，氨基酸393的截断；Vect，不含no的载体质粒BUR1（燃烧室1）基因。（C） 在含有5-FOA的合成完整（SC）培养基上进行质粒洗牌。除E107Q和D213A外，所有突变体都能支持生长。（D） Bur1 T-loop和CTD突变体的冷敏感表型。在各种介质上发现面板C的应变，以便在指示温度下进行进一步分析。在30、12和37°C下生长于酵母提取物-胃蛋白酶-葡萄糖（YPD）上；咖啡因、SC加15 mM咖啡因；形式，YPD加2%甲酰胺。（E） 突变体的Spt和Bur表型。对来自C组的菌株进行Spt和Bur表型分析。速度−，抑制lys2-128型δ允许SC-赖氨酸生长；布尔−，旁路能力例如2ΔUAS（−1900至−390），并支持2%蔗糖（+1μg放线菌素A/ml）作为唯一碳源的生长。（F） Bur2的过度表达部分抑制了感冒敏感性(反恐精英)T240A和T240D等位基因的表型。通过质粒改组获得菌株，并用高拷贝数载体（pRS424）或携带打嗝2基因。菌株被发现在YPD上，并在12或30°C下生长。
这些残基的突变是在表位标记的Bur1的背景下产生的。还创建了一种截断方法，去除Bur1的氨基酸393至657（CΔ）。突变体被转化为毛刺1Δ：：HIS3混洗应变（表)，并通过免疫印迹法确认突变蛋白的表达（图。). 然后进行质粒洗牌，并检查结果菌株的生长情况（图。). 前面描述的毛刺1-2突变型（R311Δ）(57)也进行了测试。与之前的报告相比毛刺1Δ是致命的，我们发现缺失菌株是可行的，尽管生长极慢，基本上无法使用（数据未显示）。这与打嗝2缺失菌株(76). E107Q和D213N突变株的生长速度与毛刺1Δ，表明激酶活性对Bur1活性至关重要。测试的其他等位基因支持生长，并在多种条件下进行了进一步分析（图。和E）。
这个打嗝1-2在所有条件下，突变体生长缓慢。C端删除(bur1-C型Δ）和点突变体T70A、T240A和T240D在30或37°C下生长类似于野生型细胞。这个bur1-C型Δ、T240A和T240D菌株为弱冷敏感菌株(反恐精英12°C但不是16°C）。这表明T240的C末端区域和磷酸化对Bur1的全部活性都是必要的。新的突变体对咖啡因（15 mM）的敏感性和对甲酰胺（2%）的轻度敏感性均不受生长缓慢的突变体的影响毛刺1-2等位基因（图。).
突变体的一个可能影响是削弱Bur1和Bur2之间的相互作用。如果是这样，可能通过Bur2的过度表达部分抑制突变表型。为了测试这种可能性，毛刺1突变菌株被转化为高拷贝数打嗝2质粒或空载体，以及反恐精英再次检测表型。Bur2的过度表达部分抑制了反恐精英T240A和T240D菌株的表型，但不包括毛刺1-2或bur1-C型Δ应变（图。). 这表明Bur1的T环磷酸化促进与Bur2的相互作用，类似于Kin28/Ccl1的相互作用(34).
这个毛刺1-2突变等位基因最初是通过体内转录增加从SUC2公司缺失UAS的基本启动子(例如2ΔUAS）。新的打嗝1突变体在改良的BUR1（燃烧室1）包含例如2ΔUAS（−1900至−390）轨迹（表). 同一菌株可用于测定Spt表型，因为它还含有lys2-128型δ轨迹，其中LYS2型转录被Ty长末端重复序列破坏。如前所述毛刺1-2等位基因支持来自这两个位点的转录(57). T240A和T240D等位基因都显示Bur−和Spt−表型甚至比毛刺1-2也许是因为他们的整体增长率更好。虽然它共享反恐精英表型bur1-C型Δ突变为Spt+只有微弱的Bur−（图。). Bur2的过度表达对任何Bur或Spt表型都没有影响（数据未显示）。
由于寒冷敏感性是一种难以处理的条件表型毛刺1对温度敏感的(ts秒)使用随机PCR介导的突变和质粒洗牌分离等位基因。突变ORF的测序显示，每个ORF都包含多个突变（见材料和方法）。在非许可温度（37°C）下，不同的等位基因表现出不同程度的“紧密性”（图。). 此外，大多数突变体在较低温度下生长较慢。这个bur1-C型Δ和T240突变等位基因对高温不敏感。这个伯尔1-23张力是最紧的ts秒等位基因被识别出来，并因此被用于下面的许多实验中。当测试体外激酶活性时，免疫沉淀Bur1-23蛋白相对于野生型蛋白的活性严重降低（数据未显示）。无论酵母细胞是在允许的还是非允许的温度下生长，这都是正确的。
Bur1等位基因的表型分析。（A） 温度敏感等位基因bur1。通过质粒改组引入突变株，然后将其发现在酵母提取物-胃蛋白酶-葡萄糖上（每行之间稀释10倍）。培养板在30°C（2天）、37°C（两天）和12°C（5天）下培养。（B） 一些Bur1突变体对6AU（75μg/ml）和MPA（15μg/ml。面板A中显示的菌株用pRS316（URA3）进一步转化+)并在合成全介质（SC）板上用指示的添加剂进行标记。（C）BUR1（燃烧室1）突变等位基因显示与ctk1型Δ和标准普尔5-194如其他地方所述，通过交配和转化产生了双突变菌株（表). 将细胞定位在SC板±5-FOA上，以去除野生型BUR1（燃烧室1）质粒，在30°C下培养2天。
Bur1和转录延伸相关表型。
这个毛刺1-2突变体对核苷酸类似物6AU敏感，并与伸长因子TFIIS的突变等位基因发生遗传相互作用(PPR2（PPR2）),飞行控制面板1，CTK1型、和SPT5标准(44，48). 我们检查了定义的毛刺1点突变体和ts秒药物6AU和MPA的等位基因。这些化学物质降低细胞GTP水平，这被认为会影响体内转录延长率(18，65). 几种转录延伸因子中的任何一种发生突变，可能会进一步减缓延伸，从而对这些药物产生敏感性(4，18，43，69).
相对于野生型，Bur1 C末端截断菌株对6AU或MPA不敏感。T环突变体T240D对6AU（75μg/ml）和MPA（15μg/ml。这与T240D更高的冷敏感性相类似（图。). 这个ts秒突变体均表现出一定的6AU和MPA敏感性（图。). 一个有趣的例外是布尔1-80，对6AU敏感，但对MPA不敏感。对于所有毛刺1等位基因，对这些药物的敏感性明显低于TFIIS缺失时观察到的敏感性，但与其他定义的延伸因子的缺失或突变类似，如spt5-194，ctk1Δ和rtf1Δ（数据未显示）。
测试突变体之间的遗传相互作用毛刺1等位基因和已知的伸长因子，创造了一系列包含标准普尔5-194，ctk1型Δ，或第2页Δ与毛刺1Δ：：HIS3由URA3公司-标记BUR1（燃烧室1）质粒（表). 然后通过质粒改组引入指示的表位标记Bur1突变体。尽管毛刺1-2此前有报道称，与第2页Δ(48)，我们没有观察到第2页Δ和我们的任何新Bur1突变体（数据未显示）。自毛刺1-2导致整体生长缓慢表型（图。)，它可能对额外的突变更敏感。所有突变体都具有合成致死性ctk1型Δ，T240A除外。相反，除了bur1-C型Δ为合成致死标准普尔5-194，其生长速度比野生型慢BUR1（燃烧室1）在这种背景下（图。).
Bur1突变等位基因的激酶活性。
Bur1可以在体外磷酸化Rpb1 CTD和自身(48，76). 条件的催化活性伯尔1-C在这些底物上检测Δ、T240A和T240D突变体。还分析了不支持生长的E107Q和D213A突变蛋白（图。). 所有突变体均在未标记的野生型Bur1存在下表达，因此生长速度没有差异。通过表位标签从提取物中免疫沉淀含Bur1的复合物，然后用于体外激酶检测。以HA-CTD融合蛋白为底物。
正如预期的那样，E107Q和D213A蛋白没有催化活性。与野生型Bur1不同，T240A和T240D突变体不会自动磷酸化，这表明T240是T环磷酸化的位点。此外，T240突变体对CTD的活性显著降低（图。和数据未显示）。相比之下bur1-C型Δ等位基因对自身磷酸化和CTD磷酸化都是完全活跃的。从我们产生的新的温度敏感等位基因中，我们测试了Bur1-23蛋白，发现其激酶活性也严重下降（数据未显示）。因此，激酶活性降低的Bur1突变体可以支持酵母活性，但会导致突变表型，而Bur1激酶活性的完全丧失是致命的。
为了比较Bur1和已知的生理性CTD激酶，对Kin28、Srb10和Ctk1进行免疫沉淀并并行分析。免疫印迹法证实了所有四种激酶的有效免疫沉淀（图。). 所有四种激酶在重组GST-HA-CTD上都是活性的，尽管Bur1在组中产生的磷酸化最少（图。). 用单克隆抗体8WG16、H5和H14免疫印迹法检测激酶的CTD七肽位点偏好性。它们主要分别识别S2、S2磷酸化CTD和S5磷酸化CTD-未磷酸化的CTD(11，53). Ctk1和Srb10都显示出对S2的明显偏好，这与之前的报道一致(11，26). 相反，正如体内行为所预期的那样，S5的Kin28磷酸化最强(11，12，62，64)，尽管也观察到一些H5反应性。Bur1可以弱磷酸化S2和S5（图。)，尽管如前所述，有人偏爱S5(48). 值得注意的是，我们的检测是用GST-HA-CTD进行的，而不是之前研究中使用的完整聚合酶，这可能解释了结果的差异。
自从哺乳动物cdk9（P-TEFb）被报道在体外磷酸化TFIIF和Spt5以来(35，40，58)，我们测试了免疫沉淀激酶磷酸化相应酵母因子的能力。未观察到对纯化的TFIIF（Tfg1、Tfg2和Tfg3）的活性，而所有四种激酶都能在相同程度上磷酸化免疫沉淀的Spt5复合物（数据未显示）。
Bur1和Bur2被招募到体内的转录复合物中。
以前的工作(48)上述结果表明Bur1在伸长率中起作用。如果是这样，Bur1可能与体内转录复合物有关。这是使用ChIP测试的(51，52). 表位标记的Bur1在启动子附近和组成转录的整个编码序列中交联项目管理A1基因，而不是V染色体的非转录基因间区域（图。). Bur1的自行车搭档Bur2表现出了完全相同的模式。使用ADH1（ADH1），数据库2，5菲律宾第纳尔，PYK1型、和YEF3年基因（图。和数据未显示）。半乳糖诱导基因的ChIP分析表明，当这些基因在含糖培养基中生长受到抑制时，Bur1不相关。类似地，TATA结合蛋白（TBP）不在女孩没有转录的启动子。经半乳糖诱导后，TBP和Bur1均呈强交联（图。). 因此，Bur1向基因的募集与转录相关。根据经验观察，ChIP测定的分辨率约为200至300bp。因此，我们无法使用该分析来确定Bur1/Bur2是否与预引发复合物或早期伸长复合物有关。然而，最近通过定量质谱对预引发络合物的研究没有检测到Bur1或Bur2(61).
Bur1与体内转录延伸复合物有关。（A） 透明质酸三-按照材料和方法中的描述，使用ChIPs分析标记的Bur1（YSB770）和Bur2（YSB813）菌株。PCR的PMA1引物的位置如图所示。矩形内的数字给出了ORF在碱基对中的大小。上部面板是用于规范PCR扩增的输入。用抗TBP、识别HA标记的Bur1（左柱）或Bur2（右柱）或抗CTD（8WG16）的单克隆抗体12CA5免疫沉淀样品。星号标记所有反应中包含的非转录PCR片段作为背景对照。（B） 对几个半乳糖诱导基因进行ChIP，以检测转录复合物的从头招募。细胞在2%棉子糖中生长，然后切换到2%葡萄糖（GLU）或2%半乳糖（GAL）中4小时，然后进行甲醛交联和ChIP分析。用识别标记的Bur1蛋白的抗TBP和抗HA抗体进行免疫沉淀。引物扩增了组成ADH1启动子（Adh1p）或编码序列（cds）或所示GAL基因中的相应位置。
基因3′端的Bur1交联减少。使用HA进行ChIP三-标记的Bur1菌株（YSB770）。使用抗Rpb3（聚合酶II亚单位）和识别标记Bur1的抗HA进行免疫沉淀。组成性表达基因的不同区域项目管理A1，ADH1（ADH1），PYK1型、和YEF3年已检查（底面板中描述了引物对的位置）。将PCR结果归一化至输入后的定量如凝胶下方所示。数字(年轴）指定特定引物对产品相对于非转录no-ORF阴性内部控制的信号。
令人惊讶的是，Bur1和Bur2与项目管理A1相对于RNApII，该基因位于ORF下游（图。). 最后项目管理A1引物对位于聚腺苷酸化位点的下游（M.Kim和S.Buratowski，未发表的数据）。为了测试这是否是一种普遍现象，我们比较了基因上Bur1和Rpb3的交联项目管理A1，ADH1（ADH1），YEF3年、和PYK1型（图。). 在每个基因中，Bur1与Rpb3在启动子和编码序列上的比率相似，但在poly（A）位点后Bur1水平降低。因为RNApII转录通过poly（A）位点(16)这些结果增加了终止和聚腺苷酸化信号触发伸长复合物释放Bur1/2的可能性。Bur1水平的下降为20%至50%，这取决于所测试的基因，可能反映了引物相对于聚腺苷酸化位点的不同终止效率或位置(7，8，17).
我们测试了突变菌株中Bur1交联是否受到影响。在存在内源性、未标记野生型等位基因的情况下，分析表位标记的突变Bur1蛋白。这确保了菌株的生长速度相似，并表明突变等位基因能否与野生型等位基因竞争占有率。尽管Bur1 T240A、T240D和E107Q突变体的催化活性不同，但它们显示出与野生型相同的交联模式和强度（图。). 催化活性的Bur1仍能与伸长复合物结合的发现可能表明Bur1可以交换，或者在伸长过程中存在多个Bur1分子。Bur1-CΔ蛋白始终显示交联减少（约为野生型的50%）。这表明Bur1的C末端半部分对与延伸复合物的结合很重要，或者截断只是降低了蛋白质的交联效率。我们还检测了在缺乏野生型蛋白的情况下T240A T-loop突变蛋白的交联。Bur1（T240A）与野生型蛋白质交联相同，包括聚腺苷酸化位点下游的下降（图。). 因此，Bur1与伸长聚合酶的结合不需要激酶活性或T环磷酸化。
Bur1突变体不影响与转录复合物的关联。（A） 表位标记的Bur1突变等位基因被转化为菌株YSB787，并在未标记的野生型Bur1存在的情况下，将所得菌株用于ChIP分析。每个突变体与启动子的交叉链接以及项目管理A1和ADH1（ADH1）基因显示。（B） Bur1 T240A等位基因显示出与野生型Bur1相似的交联模式项目管理A1基因，表明Bur1 T环的磷酸化不是3′非翻译区（UTR）脱离的信号。注意，T240突变株不含野生型Bur1。
Bur1突变体对转录延伸复合物的影响。
为了确定Bur1活性对转录延伸是否重要，在野生型和伯尔1-23菌株。我们已经证明Bur1-23显著降低了体外激酶活性（数据未显示）。菌株在室温（25°C）下生长，并在37°C下移动2和4小时。作为伸长率缺陷的阳性对照，也在25μg 6AU/ml的存在下进行交联（图。). 在斑点分析中，选择该剂量作为最低测试剂量（10、25、50或75μg/ml），在该剂量下，一组伸长因子突变体(第2页Δ,ctk1型Δ,标准普尔5-194、和伯尔1-23)相对于野生型细胞，显示出对6AU的选择性敏感性（数据未显示）。
Bur1是转录延伸所必需的，但不是共转录CTD磷酸化所必需的。（A） 6AU的延伸阻断导致RNApII亚基Rpb1和Rpb3交联时出现5′-3′极性。细胞在25μg/ml的6AU存在下生长4h，然后进行甲醛交联和ChIP。尽管Rpb1和Rpb3的远端水平在6AU存在下降低，但注意S2磷酸化仍然很强。（B） 野生型或伯尔1-23培养物在25°C下生长，并转移到非允许温度下2小时（T2）和4小时（T4）。如前所述进行甲醛交联和ChIP。用抗Rpb3测定RNApII的总水平，而用指示的单克隆抗体检测S2和S5的CTD磷酸化。（C） 面板B中的结果通过磷光成像仪分析进行量化并绘制图表。来自特定引物产品的信号（如下图所示）被归一化为相对于非转录no-ORF内部控制的输入和量化。
在野生型菌株中，RNApII在两种温度下都与启动子和编码区交联。在存在6AU的情况下，Rpb1和Rpb3都显示出交联减少，并且随着与启动子的距离增加，交联变得更加明显（图。). 相反，6AU治疗后，聚合酶（Rpb1和Rpb3）和TBP在启动子区域的募集相对不受影响。对此模式的最简单解释是，启动子处启动转录的大多数聚合酶无法到达基因的3′端。
在允许的温度下伯尔1-23菌株表现出与野生型菌株略有不同的RNApII交联模式。当引物远离转录起始位点时，交联度略有降低。增长伯尔1-23在非允许温度（37°C）下应变2或4小时，优先减少Rpb1或Rpb3在项目管理A1相对于启动子（图。和C）。这种极性与6AU存在下的极性相似，表明Bur1活性的丧失导致伸长率降低。这种效应不是等位基因特有的，因为在布尔1-80应变（未显示数据）。我们还监测了突变Bur1-23蛋白的存在（使用HA标签）。突变的Bur1模式与Rpb3在所有温度下的模式相似（数据未显示），表明突变蛋白仍然与伸长复合物相关。
为了确定Bur1在转录过程中是否参与CTD S5或S2磷酸化，用单克隆抗体H14和H5免疫沉淀交联染色质(36)（图。). H14（S5磷酸化）信号在伯尔1-23或布尔1-80突变体（图。和C以及未显示的数据）。此外，即使聚合酶II交联总量减少了6AU或伯尔1-23突变体。由于CTD中有27个H5表位拷贝，因此其检测限低于Rpb3也就不足为奇了。当H5和H14信号归一化为Rpb3信号时，未观察到CTD磷酸化的相对降低。这些结果不能排除Bur1导致CTD磷酸化的比例很小或以H5和H14抗体无法识别的模式磷酸化CTD的可能性。然而，ChIP结果表明，在缺乏Bur1活性的情况下，S5和S2的大部分协同转录CTD磷酸化是正常的。
讨论
Ctk1激酶与伸长复合物相关(11，33，42). S2上Rpb1 CTD的共转录磷酸化是必需的，随着延伸通过基因进行，磷酸化水平增加(11). 我们的ChIP结果表明，Bur1激酶及其相关的细胞周期蛋白也存在于伸长复合物中。Bur1突变体显示出许多表型，表明其在伸长中发挥作用，但使用Bur1条件突变体的ChIP实验提供了迄今为止最明确的证据。在Bur1突变细胞中，RNApII在启动子处有效组装，但大多数复合物未能到达基因的3′端（图。). 用6AU处理细胞时也能看到类似的极性，但令人惊讶的是，在Ctk1缺失菌株中却没有发现(11). 尽管Bur1突变体中的伸长明显受到影响，但转录期间的CTD磷酸化模式似乎正常。Bur1突变等位基因和ctk1型Δ具有许多遗传交互作用。这两个基因的突变都对6AU和MPA敏感（图。) (33，48，65，73)和合成致命性标准普尔5-194，标准贯入试验4Δ和kin28-16型(44)（图。). 尽管有这些相似之处，BUR1（燃烧室1）和CTK1型即使过度表达也无法进行功能替代（数据未显示）(77). 速度−和Bur−表型（图。)与Bur1但不是Ctk1突变体一起出现。ChIP和遗传数据共同表明，Ctk1和Bur1在转录中的作用不重叠。
Bur1具有典型CDK的序列基序。在重要催化残基上具有取代的突变体在体内没有功能（图。). 与Yao和Prelich达成一致(77)，我们发现T环磷酸化位点上的取代是可行的，但有几个突变表型（图。和). T-loop突变蛋白降低了激酶活性，尽管这似乎不是由与Bur2的低效结合引起的（图。). 催化失活突变体和T环突变体都与伸长复合物相关，这表明Bur1激酶活性不需要与之相关（图。).
除了N末端CDK结构域外，Bur1还有一个额外的C末端区域。该结构域在酵母中部分保守酵母菌属但即使在其他酵母中，如葡萄裂殖酵母和白色念珠菌（P.Cliften和M.Johnston，华盛顿大学基因组测序中心，个人通信）。该区域与序列数据库中的其他非同源蛋白质没有序列相似性。缺失表明，C末端区域对活力或激酶活性不是必需的，但它确实导致了对冷敏感的表型。当C端截断S.pombe公司Bur1同源物用于替换酿酒酵母基因(54). Bur1 C末端区域可能有助于Bur1向伸长复合物募集（图。)或与转录复合物的其他成分相互作用，如盖酶三磷酸酶(54).
Bur1的分子功能是什么？Bur1/2复合物被招募到与转录一致的基因中（图。). 然而，ChIP技术的分辨率不允许我们区分它是预引发复合物还是早期延伸复合物的一部分。延伸复合体到达基因3′端的效率低下毛刺1温度敏感应变清楚地表明了在促进伸长率方面的作用（图。和C）。这种缺陷在长基因上最为显著（数据未显示），类似于6AU的作用，6AU是一种通过降低GTP浓度来促进转录停滞的药物。影响毛刺1突变体和延伸率上的6AU是相加的（数据未显示），解释了许多毛刺1突变等位基因。令人惊讶的是，相对于Rpb1和Rpb3，聚腺苷酸化位点下游的Bur1/2交联显著减少（图。). 这种明显分离的信号并不涉及Bur1的T环磷酸化。促进伸长的激酶的解离可能是转录终止机制的一部分。
据推测，Bur1磷酸化一些底物以防止终止或促进伸长。基于其与Bur1共免疫沉淀RNApII，有人建议底物是Rpb1 CTD的S5(48). CTD在体外可作为Bur1底物（图。) (48)尽管我们发现Bur1的活性和位点选择性低于三种先前特征化的CTD激酶（Kin28、Ctk1和Srb10）。在我们的ChIP实验中，CTD S2或S5的磷酸化在伯尔1-23或布尔1-80温度敏感突变体，即使在非允许温度下，对伸长率的影响也相当显著（图。和数据未显示）。此外，在全细胞提取物的免疫印迹上毛刺2Δ菌株的S5磷酸化水平（用单克隆抗体H14测定）正常（M.Kim和S.Buratowski，未发表数据）。虽然这些提取物中的S2磷酸化（即H5反应性）略有降低，但这可能是由较低水平的伸长聚合酶引起的间接影响。在此背景下，值得注意的是CTD截断或替换突变体没有6AU或MPA敏感性（数据未显示）。基于所有这些原因，我们怀疑重要的Bur1底物不是RNApII CTD。
Bur1底物的线索可能来自高等真核生物。Bur1和Ctk1在序列上与高等真核生物Cdk9相同，因此尚未建立准确的同源关系。Cdk9和细胞周期蛋白T形成一种称为P-TEFb的复合物，可刺激体外伸长(31，56). P-TEFb被提议通过在伸长过程中磷酸化CTD发挥作用，这有助于防止聚合酶停滞(45，58). Cdk9的确切七肽特异性存在争议。Ramanathan等人利用多肽发现了对S5的偏好，这种偏好被S2的预先磷酸化所抑制(60). Zhou等人报道，Cdk9在体外诱导复合物中磷酸化S2，但这种底物特异性在人类免疫缺陷病毒反式激活蛋白Tat存在时发生改变。由此产生的复合物磷酸化S2和S5(78). 利用RNA干扰敲除Cdk9秀丽隐杆线虫Shim等人发现S2磷酸化缺失，但S5磷酸化缺失(66).
Cdk9的功能也可以通过另一种底物，即延伸因子Spt5介导(35，55，66，74). Spt5最初是通过酵母基因筛选鉴定并参与转录的(75). Spt4/5复合物与RNApII相关并在体内转录延长中发挥作用(25，37，69)可能是通过结合Spt6改变染色质结构(9). 人类Spt4/5复合物被称为DSIF，在伸长率中起作用(10，74). 有人提出，Spt5的磷酸化调节DSIF活性，非磷酸化形式作为阻遏物。P-TEFb的磷酸化可能减轻这种抑制(55，66，74).
一个有趣的想法是酿酒酵母Bur1和Ctk1都是Cdk9的副产物，是由同一祖先的不同进化产生的。鉴于Cdk9可能同时作用于CTD和Spt4/5，酿酒酵母可以利用不同的CDK复合物实现这两种功能。Ctk1似乎专用于CTD S2磷酸化，而Bur1可能作用于Spt4/5。为了支持这个想法BUR1/2（燃烧室1/2）和SPT4/5/6标准具有许多表型(24，49，57，71，72). 部分功能丧失BUR1（燃烧室1）等位基因显示合成表型标准普尔5-194和标准贯入试验4Δ，表明存在共同途径(44)（图。). 我们发现，Spt5在体外可以作为Bur1底物，尽管它也被Kin28、Ctk1和Srb10磷酸化（数据未显示）。推测的Bur1同源物来自S.pombe公司也可以在体外磷酸化SpSpt5(54). Spt5包含几个让人联想到CTD YSPTSPS七肽的序列基序。需要进一步的实验来确定这些是Bur1还是Cdk9的生理靶点。
致谢
我们感谢Greg Prelich、Fred Winston和Grant Hartzog提供的酵母菌株；P.Cliften、M.Johnston和华盛顿大学基因组测序中心研究其他酵母Bur1同源物的序列；R.Buratowski校对；和Minkyu Kim、Seong-Hoon Ahn、Paul Mason和Fred Winston进行了有益的讨论。
S.B.是白血病和淋巴瘤学会的学者。这项工作得到了NIH向S.B.拨款GM46498和GM56663的支持。
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