Ubp10/Dot4p调节泛素化组蛋白H2B的持久性：在端粒沉默和总染色质中的不同作用^†

重组DNA、分子克隆和酵母菌株。

采用标准分子生物学技术。表中描述了本研究中使用的质粒和酵母菌株​表1。1酵母缺失等位基因是通过PCR扩增合适的敲除结构获得的，然后使用标准酵母转化技术转化为酵母细胞(http://www.fhcrc.org/labs/gottschling).

ChIP分析。

ChIP分析与之前描述的类似(92)，有一些变化。酵母提取物-胃蛋白酶-葡萄糖（YEPD；200 ml）培养物培养至2×10的细胞密度⁷细胞/ml，并与1%甲醛交联。制备细胞裂解物，并使用Fisher Scientific 60型声波分解器对裂解物进行八次声波分解30秒。声波导致平均碎片大小为500至800 bp（数据未显示）。在需要之前，将澄清的裂解液储存在−80°C下。

对于Ubp10p-Myc-ChIP，进行不同的交联。首先通过离心法获取细胞，在磷酸盐缓冲液中洗涤两次，然后再悬浮在50 ml磷酸盐缓冲液内。将己二酸二甲酯添加到最终浓度为10 mM的溶液中，以改善交联(48)，将细胞在室温下培养45分钟。将甲醛添加到最终浓度1%，并在室温下再培养15分钟。按照上述方法制备样品。

对不同浓度的免疫沉淀物和总裂解物进行初始多重PCR扩增，以确定线性范围内扩增所需的浓度。使用之前确定在线性扩增范围内的单一浓度进行最终多重PCR扩增。PCR产物在2%琼脂糖（1×Tris-acetate-EDTA）凝胶上解析。凝胶用Vistra Green染色，并使用荧光成像仪（分子动力学）和ImageJ软件进行分析。PCR扩增的寡核苷酸序列如表所示​表11.

西方分析。

如前所述制备全细胞裂解物(26)，有一些变化。培养物在30°C的YEPD或酵母完全（YC）培养基中生长，达到所需的光密度（2×10⁷对数生长细胞的细胞数/ml，双倍细胞的隔夜饱和，静止细胞的7天饱和），以及相等数量的细胞（1.6×10⁸)通过离心法收获。通过使用酸洗玻璃珠进行机械剪切，将细胞裂解在300μl含有0.01%溴酚蓝和10mM苯甲基磺酰氟的SUME（8M尿素、1%十二烷基硫酸钠、10mM吗啉丙磺酸，pH 6.8，10mM EDTA）中。为了进行免疫印迹，在16%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上分离5至20μl细胞裂解物样品，将蛋白质转移到硝化纤维素中，并用适当的抗体进行免疫印记。

Ubp10/Dot4p在体内负调节组蛋白H2B泛素化。

随着Sir4p作为Ubp10p的底物被消除，我们将注意力转向组蛋白H2B，因为组蛋白H3 Lys4和Lys79甲基化需要H2B泛素化(9，20，67，91)两者都能对抗Sir蛋白与染色质的结合(64，81，92). 为了确定Ubp10p是否靶向泛素化H2B，我们检测了H2B泛素化的稳态水平ubp10Δ单元。与野生型细胞相比，ubp10Δ细胞H2B泛素化的稳态水平大约高出三倍（图。​（图1），1)支持泛素化H2B是Ubp10p真正底物的观点。事实上，H2B泛素化的稳态水平增加ubp10Δ细胞类似于ubp8Δ电池（图。​（图1）；1); Ubp8p是一种泛素蛋白酶，最近被证明可以调节H2B泛素化(18，33). 删除两者UBP10（UBP10）和UBP8（UBP8）导致H2B泛素化的稳态水平进一步增加，这比两种情况都要高ubp10Δ或ubp8Δ电池（图。​（图1）。1). 这些结果表明，Ubp10p和Ubp8p部分作用于不同的泛素化H2B群体，这与它们分别在沉默和SAGA介导的转录中的不同作用一致(33，43).

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图1。

Ubp10p负调控组蛋白H2B泛素化和H3 Lys4和Lys79甲基化水平。使用识别位于H2B N末端的FLAG表位的抗FLAG抗体来测定全细胞裂解物中的全局稳态H2B泛素化水平(76). 还使用针对单甲基、二甲基和三甲基化Lys4形式H3的抗体以及针对二甲基化Lys 79形式H3产生的抗体来检测全球稳态H3 Lys4和Lys79甲基化水平(92). 全细胞裂解物来源于菌株UCC6369（野生型）、UCC6390(ubp10Δ），UCC6392(ubp8Δ），UCC6393(ubp10Δubp8Δ）和UCC6163(放射性6Δ）。放射性6Δ细胞作为缺乏泛素的H2B的阴性对照。标高的变化(n个-相对于野生型菌株，每个突变菌株的H2B泛素化和H3 Lys4和Lys79甲基化的倍数显示在每个相应的车道下方，是三个独立实验的平均值。使用美国国立卫生研究院ImageJ软件进行定量。

Ubp10/Dot4p负调节全球组蛋白H3 Lys4和Lys79甲基化。

先前记录的组蛋白H3 Lys4和Lys79甲基化对H2B泛素化的依赖性，使我们检查了是否丢失UBP10（UBP10）或UBP8（UBP8）H3甲基化改变。使用特定抗体，我们检测了H3 Lys4单、二或三甲基化或H3 Lys 79二甲基化的稳态水平。虽然变化通常不大，ubp10与野生型细胞相比，Δ细胞的所有形式的H3 Lys4甲基化和H3 Lys 79甲基化的稳态水平确实较高（图。​（图1，1，见图。​图66和​和7）。7). 相反，我们观察到H3 Lys4或Lys79甲基化在ubp8Δ电池（图。​（图1），1)这表明H2B泛素化的增加不足以增加H3甲基化。在ubp10Δubp8Δ细胞、H3-Lys4和Lys79甲基化也增加，类似于ubp10Δ电池（图。​（图1B）。1B年). 总之，H2B泛素化的较高稳态水平ubp10Δ细胞可能增加H3 Lys4和Lys79甲基化的机会。

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图6。

沉默缺失不会影响全球H2B泛素水平。（A） Ubp10p催化活性的丧失而不是Sir4p结合的丧失会影响H2B泛素化和H3 Lys4甲基化。来自UCC6195菌株（野生型）全细胞裂解产物的全局稳态H2B泛素化和H3 Lys4二甲基化水平UBP10（UBP10）)，UCC6199(ubp10Δ），UCC6184(ubp10^C371S型-6个月)，UCC6185(ubp10^Δ94-250-6个月)和UCC6186(UBP10-6Myc公司)使用抗FLAG抗体（FLAG标记的H2B）或特异性识别H3-Lys4二甲基化的抗体进行测定。（B） 沉默缺失并不影响H2B泛素化或H3 Lys4甲基化。如A组所述，使用菌株UCC6195对全局稳态H2B泛素化和H3 Lys4二甲基化水平进行了分析(UBP10（UBP10）)，UCC6196(沉默信息调控因子2Δ），UCC6197(sir3Δ），UCC6198(sir4Δ）和UCC6199(ubp10Δ).

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图7。

Ubp10p和Ubp8p在其靶染色质区域重叠。（A） 如图图例所示，对全细胞裂解物中H2B泛素化和H3 Lys4及Lys79甲基化的全球稳态水平进行了分析。​图1。1全细胞裂解物来源于菌株UCC6369（野生型）、UCC6390(ubp10Δ），UCC6392(ubp8Δ），UCC6393(ubp10Δubp8Δ）和UCC6163(放射性6Δ）在对数生长期、diauxie（隔夜生长至饱和）和稳定期（7天饱和）收获。（B） 一些H2B泛素化持续存在于ubp10Δ和ubp8diauxie中的Δ细胞。H2B泛素化检测如图图例所示。​图1。1.箭头表示双泛素化形式的H2B将按预期在何处运行ubp10Δubp8Δ单元。

最近的一项研究发现，H3 Lys4二甲基化和三甲基化的稳态水平略有下降，但在ubp8Δ电池(18). 然而，我们没有发现任何形式的H3 Lys4甲基化水平在ubp8Δ电池（图。​（图1）。1). 这种差异的一种可能性是，在之前的研究中，酸提取组蛋白中分析了H3 Lys4甲基化(18)，而我们检测了整个酵母细胞提取物中的H3 Lys4甲基化（参见材料和方法）。也许存在一个可溶性的非核糖体Lys4-甲基组蛋白H3池，可由全细胞提取物检测到，但不可通过差异提取方法检测到。如果是这样，提取方法将只揭示核小体中H3 Lys4甲基化状态的信息。或者，各种形式的Lys4-甲基化组蛋白H3可能具有不同的溶解度，影响提取过程中的回收。无论是什么原因，我们在全细胞提取物中的结果是可重复的，并且在缺乏UBP8（UBP8）（图。​（图1；1; 参见图。​图7），7)这与Ubp8p在全球转录中的作用很小一致（见图。​图88).

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图8。

损失UBP10（UBP10）和UBP8（UBP8）主要在活性染色质中具有协同转录效应。利用菌株UCC6389（野生型）、UCC6390进行转录序列分析(ubp10Δ），UCC6392(ubp8Δ）和UCC6393(ubp10Δubp8Δ），如图图例所示。​图2。2（A）维恩图显示了ubp10Δ,ubp8Δ和ubp10Δubp8Δ单元。（B） 中的表达式更改ubp10Δubp8Δ细胞主要位于非异倍体区域。位置聚类分析显示了基于端粒距离的基因表达变化。只显示了在至少一个菌株中表达大于或小于1.5倍的基因（显示的基因总数为368）。位于端粒区域的基因标记在左侧。整个标准化数据集见补充材料中的表S1。

Ubp10/Dot4p在沉默位点富集。

H2B泛素化的负调控可以解释Ubp10p在沉默中的作用，因为组蛋白H3 Lys4和Lys79甲基化需要H2B泛素化(9，20，67，91)，两者都能拮抗Sir蛋白与染色质的结合(64，81，92). 因为Ubp10p通过与Sir4p的直接相互作用参与端粒基因表达的沉默(43，85)似乎Ubp10p定位于沉默染色质以逆转H2B泛素化。通过染色质免疫沉淀，我们发现Ubp10p优先定位于沉默的端粒VIR和沉默的交配位点HMR公司一与染色质活性区相比，如镀锌1和SAN1公司（图。​（图22).

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图2。

Ubp10p优先定位于沉默染色质。使用菌株UCC6389（未标记）进行体内交联分析UBP10（UBP10）)，UCC6390(ubp10Δ），UCC6408(UBP10-6Myc公司)，UCC6406(ubp10^C371S型-6个月)，UCC6407(ubp10^Δ94-250-6个月)，UCC6475(UBP10-6Myc公司，沉默信息调控因子2Δ），UCC6477(UBP10-6Myc公司，sir3Δ）和UCC6479(UBP10-6Myc公司，sir4Δ). 使用与野生型Ubp10、突变体Ubp10的C末端融合的6个Myc标签特异的抗Myc抗体对Ubp10蛋白进行ChIP分析^C371S型，和突变型Ubp10^Δ94-255蛋白质。ChIP也使用未标记的野生型Ubp10p作为对照。进行多重PCR扩增以评估端粒VIR和HMR公司一，活动SAN1公司基因和被抑制的镀锌1基因。作为对照，扩增总裂解物的DNA。（A） Vistra Green染色PCR扩增的典型示例。（B） 面板A中所示数据的定量分析。数值表示查询基因的免疫沉淀与总裂解物的比率，标准化为SAN1公司。所有值均为至少两个独立实验的平均值。误差条表示标准偏差。

以前，我们做了一些ubp10/点4端粒沉默受损的突变等位基因(43). 特别是，我们构建了两个等位基因：ubp10^C371S型（原名点4-1)，通过用Ser替换活性位点Cys371使Ubp10p失去功能，以及ubp10^Δ94-250（原名点4-5)，具有催化活性，但由于缺失了由残基94到250跨越的Sir4p结合区域，因此不能再结合Sir4p。我们发现Ubp10^C371S型蛋白质优先定位于端粒VIR和HMR公司一，类似于野生型Ubp10p（图。​（图2），2)，而Ubp10^Δ94-250蛋白质对沉默位点没有偏好（图。​（图2）。2). 当沉默基因缺失时，也观察到Ubp10p优先定位到沉默区域的缺失证券投资风险2，瑞士证券交易所3，或SIR4公司已删除。因此，Ubp10p通过与Sir4p的相互作用富集在沉默染色质上，并且Ubp10p的定位与其泛素蛋白酶的活性无关。

Ubp10/Dot4p功能的丧失和靶向性破坏了端粒基因的全球沉默。

接下来，我们通过检测Ubp10p在基因抑制中的全局基因表达来确定其功能是否同样偏向于沉默区ubp10使用DNA微阵列的突变细胞。为了避免由于ubp10Δ和ubp10^C371S型合成（YC）培养基中的细胞(43)，我们在富（YEPD）培养基中培养用于表达分析的细胞。应用严格的统计标准（见材料和方法）后，我们发现90个基因在ubp10Δ细胞，其中50个基因位于端粒的20kbp范围内（图。​（图3A3A级见补充材料中的表S1）。因为只有不到5%的基因位于端粒的20kbp以内ubp10Δ表达谱表明，Ubp10p在基因表达中的作用偏向于调节端粒沉默。我们还发现，40个基因在ubp10Δ细胞；其中7个基因位于端粒的20kbp范围内（图。​（图3A；3A级; 见补充材料中的表S1）。正如预期的那样ubp10^C371S型细胞与ubp10Δ单元格（图。​（图3B3B公司（见补充材料中的表S1），表明Ubp10p的泛素蛋白酶活性在很大程度上负责其在端粒附近和基因组中其他地方的基因调控作用。

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图3。

损失UBP10（UBP10）主要影响端粒区域的表达。使用菌株UCC6389（野生型）和UCC6390进行转录阵列分析(ubp10Δ）对于面板A和菌株UCC6432（野生型）、UCC6435(ubp10Δ），UCC6406(ubp10^C371S型)和UCC6407(ubp10^Δ94-250)对于B组，细胞在富培养基（YEPD）中生长到对数期，并分离和分析转录物。（A） 表达增加ubp10Δ细胞显示端粒偏倚。基因数量增加ubp10Δ细胞根据端粒的位置绘制。直方图表示端粒的20 kb增量。红色直方图表示表达增加的基因；绿色直方图表示表达减少的基因。（B）ubp10^Δ94-250细胞在端粒沉默方面存在特异性缺陷。位置聚类分析显示了基于端粒距离的基因表达变化。只有在至少一个菌株中表达大于或小于1.5倍的基因才会显示出来（显示的基因总数为222个）。位于各自端粒20kbp内的基因在左侧标记为“端粒区域”。整个标准化数据集见补充材料中的表S1。

基因表达谱ubp10^Δ94-250细胞与来自ubp10Δ和ubp10^C371S型细胞以一种显著的方式。只有端粒基因在ubp10^Δ94-250细胞；其他非异倍体基因在ubp10Δ或ubp10^C371S型细胞受到影响ubp10^Δ94-250电池（图。​（图3B3B公司见补充材料中的表S1），表明Ubp10^Δ94-250Sir4p结合区被删除的蛋白质在端粒沉默中存在特异性缺陷。这些结果还表明，非减数基因表达在ubp10Δ和ubp10^C371S型细胞不是失去端粒基因沉默的间接结果。

Ubp10/Dot4p降低组蛋白H3 Lys4和Lys79在端粒位点的甲基化。

Ubp10p优先定位于沉默染色质，对端粒近端基因的抑制很重要，并负调控H2B泛素化水平。因此，在没有Ubp10p功能的情况下，端粒近端基因的表达增加可能是由于沉默位点内H2B泛素化增加的结果。为了直接确定是否是这种情况，我们需要能够特异识别泛素化H2B并可用于染色质免疫沉淀实验的试剂（即抗体）。尽管进行了多次努力，我们还是无法生产出这种试剂，其他地方也没有这种试剂。相反，我们选择使用H3 Lys4和Lys79甲基化作为H2B泛素化的间接标记，因为这些修饰都需要H2B泛碱化，并且针对这些修饰的抗体很容易获得(9，20，67，91).

对于ChIP分析，我们使用了几个表明不同染色质状态的位点，包括抑制的镀锌1位点，积极转录SAN1公司沉默的轨迹HMR公司一和端粒VIR附近的沉默区。在我们用于分析的生长条件下镀锌1也不表达SAN1公司因以下基因的缺失或突变而改变UBP10（UBP10）（见补充材料中的表S1）。因此镀锌1和SAN1公司基因座作为独立的内部对照来判断H3-Lys4和Lys79甲基化在沉默区的相对变化HMR公司一端粒VIR附近。

使用识别H3 Lys4三甲基化或Lys79二甲基化的抗体，我们发现在端粒VIR的端粒近端位置，这两种修饰都增加了ubp10Δ电池（图。​（图4）。4). 我们还发现端粒VIIL上的端粒近端位置也有类似的增加（数据未显示）。我们无法检测到沉默交配型基因座Lys4甲基化的增加HMR公司一在里面ubp10Δ细胞，但检测到Lys79甲基化略有增加（图。​（图4）。4). H3 Lys4或Lys79甲基化在HMR公司一与沉默交配位点的转录缺失一致ubp10Δcells（见补充材料中的表S1）。

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图4。

Ubp10p活性的丧失导致组蛋白H3 Lys4和Lys79甲基化增加，端粒Sir3p结合减少。使用菌株UCC4825（野生型）、UCC4857进行体内交联分析(ubp10Δ），UCC4870(ubp10^C371S型)，UCC4836(ubp10^Δ94-250)和UCC4836(sir4Δ). 使用H3 Lys4三甲基化、H3 Lys 79二甲基化或Sir3p特异性抗体进行H3 Lys1和Lys79甲基化和Sir3p结合的ChIP分析。进行多重PCR扩增以评估端粒VIR和HMR公司一，活动SAN1公司基因和被抑制的镀锌1基因。作为对照，扩增总裂解物的DNA。（A） Vistra Green染色PCR扩增的典型示例。（B到D）面板A中数据的定量分析。H3 Lys4和Lys79甲基化的值表示查询基因的免疫沉淀与总裂解物的比率，与SAN1公司Sir3p结合的值表示端粒VIR的免疫沉淀与总裂解物的比率标准化为HMR公司一。所有值均为至少两个独立实验的平均值。误差条表示标准偏差。（B） 端粒VIR处H3 Lys4三甲基化的相对折叠变化镀锌1（C）端粒VIR处H3 Lys79甲基化相对增加镀锌1（D）端粒VIR处Sir3p结合相对减少。

我们还对其中一种进行了ChIP分析ubp10^C371S型或ubp10^Δ94-250细胞。有趣的是，在ubp10^C371S型我们发现端粒VIR和HMR公司一尽管两者都有ubp10Δ和ubp10^C371S型细胞在Ubp10p催化活性方面同样缺乏（图。​（图4）。4). 尽管ubp10^Δ94-250细胞端粒VIR处H3 Lys4甲基化增加，增加幅度小于ubp10Δ电池（图。​（图4），4)，这与中较弱的沉默缺陷一致ubp10^Δ94-250电池（见补充材料中的表S1）。我们没有观察到端粒VIR处H3 Lys79甲基化在统计学上显著增加ubp10^Δ94-250细胞。然而，基因组中H3 Lys79甲基化的正常高水平（超过所有核小体的90%）可能导致较高的背景值，掩盖了微小的增加。因此，沉默区H3 K79甲基化的增加始终低于H3 Lys4甲基化增加的两到三倍（图。​（图44和​和55).

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图5：。

损失UBP8（UBP8）不会导致组蛋白H3 Lys4和Lys79甲基化增加，端粒Sir3p结合减少。如图图例所示，进行体内交联分析。​图44使用染色剂UCC6389（野生型）、UCC6392(ubp8Δ），UCC6390(ubp10Δ），UCC6393(ubp10Δubp8Δ）和UCC6391(sir4Δ). （A） Vistra Green染色PCR扩增的典型示例。（B至D）面板A所示数据的定量分析与图图例中所述的相同。4B至D（B）端粒VIR处H3 Lys4三甲基化相对增加镀锌1（C）端粒VIR处H3 Lys79甲基化相对增加镀锌1（D）端粒病毒Sir3p结合的相对降低。（E） Ubp8p在端粒沉默中不起作用。隔夜，酵母菌株UCC6422（野生型）、UCC6423的饱和培养物(ubp10Δ），UCC6424(sir4Δ），UCC6425(ubp8Δ）和UCC6426(ubp10Δubp8Δ），其均携带URA3公司端粒VIIL附近的基因(85)，连续稀释并在YC板上斑点，有或没有尿嘧啶。细胞在30°C下生长3天。

正如预期的那样，端粒VIR和HMR公司一发生于sir4Δ电池（图。​（图4），4)，其中静音被完全破坏（图。​（图5E）。第五版). 虽然端粒处Ubp10p功能的丧失并没有Sir4p功能的丢失那么严重ubp10突变导致沉默位点组蛋白H3修饰增加。

端粒VIR中H3-Lys4和Lys79甲基化增加ubp10突变细胞有望导致Sir蛋白结合减少。在ubp10Δ细胞，我们观察到与端粒VIR结合的Sir3p适度减少（图。​（图4）4)和端粒VIIL（数据未显示），但对Sir3p定位无影响HMR公司一（图。​（图4），4)这与事实相符ubp10Δ细胞在HMR公司（或HML公司)并且仍然能够与高效匹配(43，85). 随着上述H3 Lys4和Lys79甲基化的增加，端粒VIR处Sir3p定位的减少在ubp10^C371S型单元格数多于ubp10Δ电池（图。​（图4）。4). 对此差异的一个可能解释是，全长但催化活性不高的Ubp10^C371S型该蛋白与Sir4p的结合时间比野生型Ubp10p长，这会干扰其他Sir蛋白的结合。喜欢ubp10Δ细胞，ubp10^Δ94-250细胞与端粒结合的Sir3p适度减少。在所有突变体中ubp10细胞中，Sir2p与端粒结合的变化与Sir3p的变化相似，在沉默的交配位点没有检测到变化（数据未显示）。

而Sir2p和Sir3p全部绑定ubp10仍然可以检测到突变细胞，Sir2p和Sir3p结合在sir4Δ电池（图。​（图44和未显示的数据），这与SIR4公司对沉默的影响远大于失去UBP10（UBP10）(85). 因此，似乎Ubp10p活性不是沉默位点Sir蛋白结合所必需的，而是优化了Sir蛋白的结合。

Ubp8p不调节沉默区内Lys4和Lys79甲基化。

损失UBP10（UBP10）导致H2B泛素化增加（图。​（图1），1)这可能是沉默区H3 Lys4和Lys79甲基化增加的原因。损失UBP8（UBP8）还导致H2B泛素化增加（图。​（图1），1)因此，我们测试了H3 Lys4和Lys79甲基化是否在ubp8Δ细胞ubp10Δ单元。通过ChIP分析，我们没有发现损失的影响UBP8（UBP8）我们也没有发现与端粒结合的Sir2p或Sir3p发生可检测的变化（图。5A至D). 损失UBP8（UBP8）对端粒沉默也没有影响（图。​（图5E；第五版; 参见图。​图8）。8). Ubp8p缺乏参与沉默的任何方面，这表明沉默需要Ubp10p对H2B泛素化的调节。

损失UBP8（UBP8）此前曾有报道称，H3 Lys4三甲基化在镀锌1在抑制葡萄糖生长的条件下(33). 这很奇怪，因为H3 Lys4三甲基化已被证明特异性地发生在活性基因的5′编码部分，而在非活性和抑制基因中不存在(66，82). 符合镀锌1在抑制葡萄糖生长的细胞中，我们发现H3 Lys4三甲基化在镀锌1在没有UBP8（UBP8）（图。5A至C). 我们的结果与早期研究结果之间的差异可能是由于每项研究中使用的菌株的差异所致：亨利和同事使用的酵母菌株来自W303(33)，而我们使用来自S288c的酵母菌株。总的来说，W303衍生菌株的葡萄糖抑制似乎不如S288c衍生菌株严格(10). 对于镀锌1特别是基因阻遏，研究表明短期内镀锌1W303衍生菌株中的抑制发生得比S288c衍生菌株慢，也没有那么严格(25). 低水平镀锌1葡萄糖生长的W303衍生菌株中的表达，但S288c衍生菌株中没有表达，这可能解释了结果的差异。

Ubp10/Dot4p的功能并不局限于沉默位点。

基因表达谱点4突变细胞（图。​（图3）三)表明Ubp10p活性并不局限于端粒位点的调节，因为大多数基因在ubp10Δ细胞（130个细胞中有73个）是非异倍体。这些位点的转录效应并不是端粒去表达的间接结果，因为这些基因在ubp10^Δ94-250端粒沉默特异性缺陷的细胞（图。​（图3）。三). 因此，Ubp10p可能对这些非对映体基因座的基因表达有直接影响。然而，尚不清楚这些非对映体基因座的表达是否也通过Ubp10p调节H2B泛素化水平来调节。为了解决这一问题，我们检测了不同基因型中H2B泛素化和H3 Lys4二甲基化的总水平ubp10上述等位基因。H2B泛素化和H3 Lys4二甲基化的稳态水平在ubp10Δ和ubp10^C371S型电池（图。​（图6A）。6A级). 令人惊讶的是，H2B泛素化和H3 Lys4二甲基化水平ubp10^Δ94-250细胞与野生型相同UBP10（UBP10）电池（图。​（图6A），6A级)尽管端粒基因座的沉默在ubp10^Δ94-250细胞。因为沉默区约占总染色质的10%(52，55，92)西方的分析可能无法检测到H2B泛素化稳态水平的任何增加，而这种增加仅仅是由于沉默缺失所致。支持这一想法，删除任何个人统计资料记录基因对H2B泛素化或H3 Lys4二甲基化的稳态水平没有影响（图。​（图6B）。6亿). 因此ubp10^Δ94-250等位基因揭示，Ubp10p活性不仅限于沉默区，而且Ubp10p还作用于非对映体区域以调节H2B泛素化水平。

Ubp10/Dot4p和Ubp8p作用于相同的染色质区域。

如上所示，ubp10Δ细胞比野生型细胞具有更高的H2B泛素化稳态水平，其水平与ubp8Δ单元格（图。​（图11和​和7）。7). 有趣的是，两者都删除了UBP10（UBP10）和UBP8（UBP8）导致H2B泛素化协同增加（图。​（图11和​和7）。7). 我们通过稀释印迹和印迹密度分析估计，野生型细胞中有2%到3%的H2B泛素化，野生型中有7%到10%的H2B被泛素化ubp10Δ电池，12至16%英寸ubp8Δ和35至40%英寸ubp10Δubp8Δ单元。H2B泛素化稳态水平的增加ubp10Δubp8Δ细胞表明Ubp10p和Ubp8p只作用于染色质的不同区域。然而，H2B泛素化水平的协同增加ubp10Δubp8Δ细胞表明Ubp10p和Ubp8p也作用于染色质的重叠区域。

最近的研究表明，当酵母细胞进入diauxie或葡萄糖耗尽时，H2B泛素化不再被检测到(19). 我们检测了diauxie的野生型细胞，同样发现H2B泛素化完全消失（图。​（图7A）。第7章). H2B泛素化也消失于ubp10Δ或ubp8在透析期间，Δ细胞虽然不能完全检测到微量H2B泛素化，但通常可以在这两种细胞中检测到ubp10Δ和ubp8暴露时间较长的Δ电池（图。7A和B). 在ubp10Δubp8然而，Δ细胞中，最初在对数期检测到的大多数H2B泛素化保留在diauxie中（图。​（图7A）。第7章). 虽然尚不清楚Rad6p-Bre1p泛素化活性是否随着细胞进入diauxie而降低，但维持H2B泛素化的高稳态水平ubp10Δubp8Δ细胞表明，Ubp10p和Ubp8p是在此期间减少H2B泛素化所需的主要酶。全球H2B泛素化在ubp10Δubp8Δ细胞在透析期间，但不在ubp10Δ或ubp8Δ细胞进一步支持了Ubp10p和Ubp8p在其修饰的许多染色质区域重叠的观点。

仍然存在于ubp10Δubp8当细胞进入固定相时，透析期间的Δ细胞被消除（图。​（图7A）。第7章). H2B泛素化在固定相的丢失可能是两个原因造成的：Rad6p-Bre1p不再泛素化H2B，另一种机制消除泛素化的H2B。在ubp10Δubp8Δ细胞我们经常观察到H2B的另一种修饰形式，其分子量增加，表明二泛素化（图。​（图7B）。7亿). 这与H2B泛素的缓慢丢失有关ubp10Δubp8Δ电池过渡到固定相时（图。​（图7A）。第7章). 我们推测单泛素对H2B的持久性ubp10Δubp8Δ细胞增加了H2B被多泛素化并最终被蛋白酶体清除的可能性，可能是通过降解。目前尚不清楚这种H2B泛素化去除模式是否在野生型细胞中正常运行，或者它是否只是一种失去Ubp10p和Ubp8p功能的情况。

我们还检测了双歧化和固定细胞中H3 Lys4和Lys79甲基化的稳态水平。与H2B泛素化增加的稳态水平相比，泛素化在ubp10Δ细胞在渗滤和固定期，H3-Lys4和Lys79甲基化的稳态水平增加在所有阶段都保持不变（图。​（图7A）。第7章). 因此，H2B泛素化水平在ubp10Δ细胞导致H3 Lys4和Lys79甲基化相对稳定地增加。

Ubp10/Dot4p在端粒沉默中的作用可能是清除H2B泛素化。

与沉默作用一致，我们发现Ubp10p通过其Sir4p相互作用域靶向沉默区域（图。​（图2），2)这种相互作用通过阻止H3 Lys4和Lys79甲基化的积累促进端粒沉默（图。​（图4）。4). 给定Ubp10p的泛素蛋白酶活性和H2B泛素化对H3 Lys4和Lys79甲基化的要求(9，20，67，91)，我们提出Sir4p靶向Ubp10p沉默染色质，以去除H2B中的泛素。反过来，这将降低H3 Lys4和Lys79在沉默区域内甲基化的可能性。

鉴于染色质蛋白质的动态结合性质，最好考虑Ubp10p在沉默中的作用。染色质蛋白质不断与染色质结合和分离，包括被认为在体外具有相对稳定结合的蛋白质(72，73). 事实上，Sir蛋白与沉默染色质的结合在整个细胞周期中是动态的，即使在G₁和M，当基因组没有被复制时(14，51，56). Sir蛋白与沉默染色质的暂时分离可能会使这些区域短暂接触到Rad6p-Bre1p复合物，从而容易受到H2B泛素化的影响。如果偶然的H2B泛素化持续太长时间，这种可逆的组蛋白标记可能转化为H3 Lys4和Lys79甲基化的更永久标记，这将阻止Sir蛋白的重新结合，并导致沉默的丧失。我们假设，在沉默染色质处，Ubp10p依赖Sir4p的富集集中了其泛素蛋白酶活性，以在Sir蛋白动力学面前保持沉默。

而Ubp10p定位于无声交配区域HMR公司一以Sir4p绑定域相关方式（图。​（图2），2)，损失UBP10（UBP10）没有明显改变HM公司通过将记者置于任一位置来衡量沉默HM公司位点(85)、全局转录分析（见补充材料中的表S1）、H3 Lys4甲基化的ChIP分析（图。​（图4），4)和定量交配分析ubp10Δ单元格（数据未显示）。HM公司沉默天生比端粒沉默更稳定(31)由于Sir1p与染色质结合，Sir蛋白与染色质的结合显著稳定HM公司轨迹消音器区域(15). 如果这种更大的稳定性是由于Sir蛋白解离减少而产生的，那么这很容易解释为什么沉默交配位点对Ubp10p作用的依赖性降低，以及Sir蛋白与HMR公司一在没有UBP10（UBP10）（图。​（图44).

Ubp10/Dot4p负调控全局H2B泛素化和H3-Lys4和Lys79甲基化。

我们发现，通过删除任何一个统计资料记录Ubp10p中的基因或Sir4p结合区不会导致H2B泛素化或H3 Lys4甲基化的更高稳态水平（图。​（图6），6)尽管这些操作导致沉默区H3 Lys4甲基化增加（图。​（图4）。4). 然而，通过删除UBP10（UBP10）或催化Cys残基的突变，确实会导致H2B泛素化和H3 Lys4和Lys79甲基化的稳态水平更高（图。​（图6），6)，表明Ubp10p的活性并不局限于沉默的染色质。

从这些观察结果来看，很可能Ubp10p在基因组中的其他地方具有类似于沉默染色质的功能，通过逆转H2B泛素化来限制或阻止H3 Lys4和Lys79甲基化。然而，在如何使用Ubp10p活动方面可能存在显著差异。在沉默染色质中，H3 Lys4和Lys79甲基化的所有形式都会干扰Sir蛋白结合(64，81，92)因此，可以招募Ubp10p来阻止H3 Lys4和Lys79的任何甲基化。在基因组的其他地方，甲基化的程度与不同的功能状态相一致。例如，H3 Lys4二甲基化和Lys79甲基化在整个基因组中都存在(5，63，64，66，82，92)并有助于防止Sir蛋白的混杂结合(82，92). 相比之下，H3 Lys4三甲基化特异性地发生在活性基因的5′编码部分，而在非活性基因中不存在(66，82). 有人认为H3-Lys4三甲基化促进基因转录，并可能作为最近转录活性的记忆标记(66，82). 在非活性基因中，H2B泛素化必须持续足够长的时间，以使H3 Lys4和Lys79的某些甲基化发生，但在H3 Lys三甲基化发生之前被消除。考虑到UBP10（UBP10）影响H3 Lys4甲基化的稳态水平（图。​（图11和​和7），7)，我们建议Ubp10p作用于非活性或受抑制的基因，以促进及时清除H2B中的泛素。与这个想法一致，大多数非减数基因在ubp10Δ和ubp10Δubp8Δ细胞增加了转录（图。​（图3三和​和8），8)表明Ubp10p可能参与维持他们的不活动或抑制。这不是失去沉默的间接影响，因为这些基因的表达改变不会发生在ubp10^Δ94-250端粒沉默的特异性缺陷细胞。也许Ubp10p通过抑制复合物靶向非活性基因，类似于Sir4p向沉默区域的募集。如果是这样，与阻遏物结合的Ubp10p必须通过与Sir4p结合的域不同的域。另外，Ubp10p活性的丧失可能通过改变除H2B外其他蛋白质的泛素化水平间接影响转录。

Ubp10/Dot4p和Ubp8p具有单独和重叠的功能。

除了在沉默中的作用外，我们认为Ubp10p对全球H2B泛素化水平的调节部分与Ubp8p的调节重叠。当两者都失去时UBP10（UBP10）或UBP8（UBP8）结果是H2B泛素化的稳态水平较高，细胞的表型结果在功能上不同（图。​（图11和​和5），5)，两者缺一不可UBP10（UBP10）和UBP8（UBP8）共同导致H2B泛素化水平和转录的协同增加（图。​（图77和​和8）。8). 泛素化H2B的持续存在进一步强调了Ubp10p和Ubp8p在基因调控或其他染色质相关功能中的重叠作用ubp10Δubp8Δ细胞进入diauxie，这与泛素化H2B在ubp10Δ和ubp8Δ电池（图。​（图7）。7). 当然，Ubp8p和Ubp10p在某些功能上是可分离的：Ubp8p在SAGA介导的转录中的功能(18，33，80)，而Ubp10p在消音中起作用（图。​（图5）。5). 此外，Ubp10p（而非Ubp8p）调节稳态H3 Lys4和Lys79甲基化水平，尽管两者都调节稳态H2B泛素化水平（图。​（图1）。1). 尽管有这些可分离的功能，但协同作用增加了稳态H2B泛素化水平和转录ubp10Δubp8Δ细胞强调了这些泛素蛋白酶的潜在重叠作用。

这个ubp10^Δ94-250等位基因表明，Ubp10p调节H2B泛素化的作用超出了其在沉默中的定义作用，但尚未分离出能证明Ubp8p在SAGA复合物外发挥作用的功能分离等位基因。最近发现Sgf11p促进Ubp8p与SAGA的相互作用(41，53，74). 有趣的是，虽然Sgf11p的纯化主要导致SAGA成分的铜纯化，但其他转录调控因子也与Sgf11p铜纯化(74)表明Sgf11p可能将Ubp8p与SAGA介导的转录以外的其他染色质相关过程联系起来。考虑到这一点和我们的研究结果，我们认为Ubp8p除了在SAGA介导的转录中所定义的作用外，还可以在H2B去泛素化的其他方面发挥作用。

虽然目前尚不清楚Ubp10p和Ubp8p如何调节常见位点的H2B泛素化，但这种效应可能是非特异性染色质结合的结果，而这种结合独立于Sir复合物和SAGA的靶向招募。许多组蛋白乙酰化酶和脱乙酰化酶也是如此(44，47，75，94)，Ubp10p和Ubp8p可能能够从整个基因组的染色质中去除H2B泛素化，而无需高亲和力相互作用。一些位点可能更容易受到这种“hit-and-run”活动的影响，只有当Ubp10p和Ubp8p都不存在时，H2B泛素化和基因表达才会发生变化。

从H2B中去除泛素的多种原因。

由于多种原因，细胞可能通过这些泛素蛋白酶调节H2B泛素化水平。从H2B中去除泛素可用于基因抑制，以防止H3 Lys4和Lys79甲基化，类似于Ubp10p在沉默中的作用(43，85). H2B的去泛素化也可能促进转录，就像Ubp8p在SAGA介导的转录中的作用一样(18，33，80). 有证据表明，H2B的去泛素化也可能发生在有丝分裂期间，以使染色质致密化(12，57，61). 当细胞退出细胞周期时，从H2B中去除泛素对于阻止有丝分裂基因的转录可能很重要，也可能是酵母细胞进入稳定期时H2B去泛素化的原因（图。​（图7）。7). 最后，可能需要从泛素化H2B中去除单一泛素部分，以防止染色质相关蛋白酶体对修饰H2B的多重泛素化和随后的降解(29，30，60). 这些以及其他尚未发现的消除H2B泛素化的结果可能有助于染色质的动态和灵活性。

我们感谢M.A.Osley提供的FLAG标记的H2B质粒和J.Delrow对转录物微阵列数据的统计分析。我们感谢H.Eisen和Gottschling实验室的成员对手稿进行了深入的讨论和批判性阅读。

R.G.G.是生命科学研究基金会的百时美施贵宝研究员。这项工作得到了美国国立卫生研究院对D.E.G.的拨款GM43893的支持。