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.2003年10月；23(19):7005-18.
doi:10.1128/MCB.23.197005-7018.2003。

RNA聚合酶II高效转录延伸需要Bur1激酶

迈克尔·克里斯托弗·基奥 1, 弗拉基米尔·波多尔尼, 斯蒂芬·布拉托夫斯基
附属公司

RNA聚合酶II高效转录延伸需要Bur1激酶

迈克尔·克里斯托弗·基奥等。 分子细胞生物学. 2003年10月.

摘要

酿酒酵母细胞周期依赖性激酶（CDK）Bur1（Sgv1）可能与哺乳动物Cdk9同源，其在转录延伸中起作用。虽然Bur1可以在体外磷酸化Rpb1羧基末端结构域（CTD）激酶，但在普遍存在的七肽YSPTSPS中，它对Ser2或Ser5没有很强的特异性。BUR1突变体对药物6-氮杂嘧啶和麦考酚酸敏感，并与伸长因子Ctk1和Spt5发生遗传相互作用。染色质免疫沉淀实验表明，Bur1及其细胞周期蛋白伙伴Bur2被招募到转录延伸复合物中，与活性转录基因交联。有趣的是，Bur1显示多聚腺苷酸化位点下游转录区的交联减少。此外，bur1突变株在基因3'端相对于启动子区域的RNA聚合酶II交联比率降低。CTD丝氨酸2和5的磷酸化在突变细胞中表现正常，这表明Bur1不是共转录Rpb1磷酸化的重要来源。这些结果表明，Bur1在转录延伸中起作用，但可能磷酸化CTD以外的底物。

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数字

图1。
图1。
Bur1突变体的体内分析。（A） Bur1蛋白的示意图，显示了针对突变的残基。（B） 突变蛋白以正常水平表达。所示HA三-已标记BUR1（燃烧室1）等位基因通过质粒改组取代野生型基因。用SDS-PAGE解析全细胞提取物，用抗HA（12CA5）抗体免疫印迹法检测其表达水平。50kDa附近的非常暗的带是一种与12CA5抗体交叉反应的蛋白质。FL，全长蛋白；CΔ，氨基酸393的截断；Vect，不含no的载体质粒BUR1（燃烧室1）基因。（C） 在含有5-FOA的合成完整（SC）培养基上进行质粒洗牌。除E107Q和D213A外，所有突变体都能支持生长。（D） Bur1 T-loop和CTD突变体的冷敏感表型。在各种介质上发现面板C的应变，以便在指示温度下进行进一步分析。在30、12和37°C下生长于酵母提取物-胃蛋白酶-葡萄糖（YPD）上；咖啡因、SC加15 mM咖啡因；形式，YPD加2%甲酰胺。（E） 突变体的Spt和Bur表型。对来自C组的菌株进行Spt和Bur表型分析。速度−，抑制lys2-128型δ允许SC-赖氨酸生长；布尔−，旁路能力例如2ΔUAS（−1900至−390），并支持2%蔗糖（+1μg放线菌素A/ml）作为唯一碳源的生长。（F） Bur2的过度表达部分抑制了感冒敏感性(反恐精英)T240A和T240D等位基因的表型。通过质粒改组获得菌株，并用高拷贝数载体（pRS424）或携带打嗝2基因。菌株被发现在YPD上，并在12或30°C下生长。
图2。
图2。
Bur1等位基因的表型分析。（A） 温度敏感等位基因毛刺1。通过质粒改组引入突变株，然后将其发现在酵母提取物-胃蛋白酶-葡萄糖上（每行之间稀释10倍）。培养板在30°C（2天）、37°C（两天）和12°C（5天）下培养。（B） 一些Bur1突变体对6AU（75μg/ml）和MPA（15μg/ml。面板A中显示的菌株用pRS316（URA3）进一步转化+)并在合成全介质（SC）板上用指示的添加剂进行标记。（C）BUR1（燃烧室1）突变等位基因显示与ctk1型Δ和标准普尔5-194如其他地方所述，通过交配和转化产生了双突变菌株（表1）。将细胞定位在SC板±5-FOA上，以去除野生型BUR1（燃烧室1）质粒，在30°C下培养2天。
图3。
图3。
Bur1突变等位基因的体外CTD激酶活性。（A） 表达表位标记Bur1突变体的质粒被转化为含有未标记野生型Bur1的YSB787。请注意，由于E107Q和D213A等位基因无法支持生长，因此此处未进行质粒重组。标记的含Bur1的复合物用12CA5蛋白A珠免疫沉淀并分离。在上部面板中，沉淀用抗HA（12CA5）抗体进行免疫印迹。FL，全长蛋白；CΔ，C末端截断蛋白。请注意，免疫球蛋白重链与Bur1 CΔ突变体紧密迁移，形成背景带。用放射性标记的ATP和HA-CTD融合蛋白测试免疫沉淀物的其他等分样品的激酶活性（见材料和方法）。下部面板显示了暴露于放射自显影的反应混合物的SDS-PAGE，显示了Bur1的CTD磷酸化和自磷酸化。注意，Bur1 CΔ蛋白在CTD底物附近运行。Bur1CΔ蛋白自磷酸化在缺乏CTD底物的反应中得到证实。（B） 按照A组所述制备免疫沉淀物。用抗HA（12CA5）抗体检测斑点，以确定Bur1、抗Bur2（由Greg Prelich慷慨提供）或抗TBP作为阴性对照。
图4。
图4。
不同CTD激酶的比较。（A） 从适当的HA标记菌株制备全细胞提取物：Kin28（YSB759）、Ctk1（YSB772）、Srb10（YSB77）、Med6（YSB7）和Bur1（YSB 770）。用12CA5蛋白A珠免疫沉淀指示的表位标记激酶复合物，并用SDS-PAGE和12CA5免疫印迹分析进行分析。中间常见的带是抗体。（B） 用[γ]测定免疫沉淀蛋白复合物的激酶活性-32P] ATP和重组GST-HA-CTD。酪蛋白激酶I用作对照。CTD的磷酸化降低了其凝胶流动性变化（带P*的箭头表示磷酸化形式）。通过放射自显影术（顶面板）、12CA5抗体（抗-HA）或磷酸表位特异性单克隆抗体8WG16（抗-CTD）、H5（抗-CDD S2p）和H14（抗-CDT S5p）观察不同形式的GST-HA-CTD。Bur1 AutoRad和抗-HA面板中未磷酸化GST-HA-CTD下方的附加带为自磷酸化HA-Bur1。
图5：。
图5：。
Bur1与体内转录延伸复合物有关。（A） 透明质酸三-按照材料和方法中的描述，使用ChIPs分析标记的Bur1（YSB770）和Bur2（YSB813）菌株。PCR的PMA1引物的位置如图所示。矩形内的数字给出了ORF在碱基对中的大小。上部面板是用于规范PCR扩增的输入。用抗TBP、识别HA标记的Bur1（左柱）或Bur2（右柱）或抗CTD（8WG16）的单克隆抗体12CA5免疫沉淀样品。星号标记所有反应中包含的非转录PCR片段作为背景对照。（B） 对几个半乳糖诱导基因进行ChIP，以检测转录复合物的从头招募。细胞在2%棉子糖中生长，然后切换到2%葡萄糖（GLU）或2%半乳糖（GAL）中4小时，然后进行甲醛交联和ChIP分析。用识别标记的Bur1蛋白的抗TBP和抗HA抗体进行免疫沉淀。引物扩增了组成ADH1启动子（Adh1p）或编码序列（cds）或所示GAL基因中的相应位置。
图6。
图6。
基因3′端的Bur1交联减少。使用HA进行ChIP三-标记的Bur1菌株（YSB770）。使用抗Rpb3（聚合酶II亚单位）和识别标记Bur1的抗HA进行免疫沉淀。组成性表达基因的不同区域项目管理A1,ADH1（ADH1）,PYK1型、和YEF3年已检查（底面板中描述了引物对的位置）。将PCR结果归一化至输入后的定量如凝胶下方所示。数字(年轴）指定特定引物对产品相对于非转录no-ORF阴性内部控制的信号。
图7。
图7。
Bur1突变体不影响与转录复合物的关联。（A） 表位标记的Bur1突变等位基因被转化为菌株YSB787，并在未标记的野生型Bur1存在的情况下，将所得菌株用于ChIP分析。每个突变体与启动子的交叉链接以及项目管理A1和ADH1（ADH1）基因显示。（B） Bur1 T240A等位基因显示出与野生型Bur1相似的交联模式项目管理A1基因，表明Bur1 T环的磷酸化不是3′非翻译区（UTR）脱离的信号。注意，T240突变株不含野生型Bur1。
图8。
图8。
Bur1是转录延伸所必需的，但不是共转录CTD磷酸化所必需的。（A） 6AU的延伸阻断导致RNApII亚基Rpb1和Rpb3交联时出现5′-3′极性。细胞在25μg/ml的6AU存在下生长4h，然后进行甲醛交联和ChIP。尽管Rpb1和Rpb3的远端水平在6AU存在下降低，但注意S2磷酸化仍然很强。（B） 野生型或伯尔1-23培养物在25°C下生长，并转移到非允许温度下2小时（T2）和4小时（T4）。如前所述进行甲醛交联和ChIP。用抗Rpb3测定RNApII的总水平，而用指示的单克隆抗体检测S2和S5的CTD磷酸化。（C） 面板B中的结果通过磷光成像仪分析进行量化并绘制图表。来自特定引物产品的信号（如下图所示）被归一化为相对于非转录no-ORF内部控制的输入和量化。
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