The Paf1 complex physically and functionally associates with transcription elongation factors in vivo

doi:10.1093/emboj/21.7.1764

.2002年4月2日；21(7):1764-74.

doi:10.1093/emboj/21.7.1764。

体内Paf1复合物在物理和功能上与转录延伸因子相关

沙龙·L·斯夸佐¹, 帕特里克·J·科斯塔, Derek L Lindstrom（德里克·L·林德斯特罗姆）, 凯瑟琳·库默, 拉吉娜·西米奇, 詹妮弗·詹宁斯, 安德鲁·林克, 凯伦·阿恩特, 格兰特·哈特佐格

附属公司

PMID： 11927560
预防性维修识别码： PMC125365型
内政部： 10.1093/emboj/21.7.1764

体内Paf1复合物在物理和功能上与转录延伸因子相关

沙龙·L·斯夸佐等。欧洲工商管理硕士J. 2002.

.2002年4月2日；21(7):1764-74.

doi:10.1093/emboj/21.7.1764。

作者

沙龙·L·斯夸佐¹, 帕特里克·J·科斯塔, 德里克·林德斯特罗姆, 凯瑟琳·库默, 拉吉娜·西米奇, 詹妮弗·詹宁斯, 安德鲁·林克, 凯伦·阿恩特, 格兰特·哈特佐格

附属

¹美国加州大学圣克鲁斯分校MCD生物学系，邮编：95064。

PMID： 11927560
预防性维修识别码： PMC125365型
内政部： 10.1093/emboj/21.7.1764

摘要

我们正在使用生物化学和遗传学方法研究Rtf1和Spt4-Spt5复合物，它们独立地被RNA聚合酶II牵涉到转录延伸。在这里，我们报告了这些研究的显著趋同。首先，我们纯化了Rtf1及其相关酵母蛋白。将此方法与遗传分析相结合，我们发现Rtf1和Leo1，一种功能未知的蛋白质，是RNA聚合酶II相关Paf1复合物的成员。进一步分析揭示了Paf1复合物成员、Spt4-Spt5和Spt16-Pob3（人类延伸因子FACT的酵母对应物）之间的等位基因特异性遗传相互作用。此外，我们在一个无偏见的基因筛查中独立分离了paf1和leo1突变，以筛选对感冒敏感的spt5突变的抑制因子。Paf1复合物、Spt4-Spt5和Spt16-Pob3之间的物理相互作用支持这些遗传相互作用。最后，我们发现Paf1复合物中的缺陷导致对6-氮杂嘧啶的敏感性和PUR5诱导减少，这些特性通常与转录延伸受损有关。综上所述，这些数据表明，Paf1复合物与Spt4-Spt5和Spt16-Pob3一起在转录延长期发挥作用。

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数字

**图1。**Rtf1–TAP与Paf1、Cdc73、Ctr9、Leo1、Spt5和Rpb1共同净化。按照材料和方法中的描述，对表达未标记和TAP标记形式的Rtf1的酵母菌株进行平行处理。(A类)从～150 mg蛋白质提取物中提取的纯化蛋白质银染色凝胶。根据并行进行的免疫印迹分析，识别Rtf1、Paf1和Cdc73条带。没有对Ctr9和Leo1（预测质量分别为~125和54kDa）进行类似的分配，因为这些蛋白质的抗体不可用，也因为我们的质谱分析没有切除单个条带。(B类)纯化蛋白的免疫印迹，用针对Rtf1、Paf1、Cdc73和Spt5的抗血清显示。用单克隆抗体8WG16探针检测Rpb1。

**图2。**Rtf1和Leo1是Paf1复合体的成员。(A类)Rtf1与Leo1-HA1和HA1-Paf1共同免疫沉淀。从缺乏HA1标记蛋白（模拟，GHY1102）的菌株（含有HA1标记的Paf1（GHY1147）或Leo1（GHY1141））的提取物和*LEO1-HA1 paf1Δ*应变（GHY1146）。用HA1抗体结合珠沉淀的蛋白质用1 M KCl洗脱（洗脱）并用SDS-PAGE分离。在1M KCl洗脱后仍与珠结合的蛋白质通过在样品缓冲液（珠）中沸腾而释放。用免疫印迹法观察HA1标记蛋白和Rtf1。(B类)Leo1-HA1与Ctr9-Myc共免疫沉淀。对Leo1-HA1（模拟，GHY1092）和Ctr9-Myc Leo1-HA1菌株（GHY1184）的提取物进行免疫沉淀。(C类)Rtf1与Ctr9-Myc共免疫沉淀。对缺乏myc标签的菌株（模拟，GHY1002）、Ctr9-myc菌株（GHY1184）和*paf1Δ*Ctr9-Myc菌株（GHY1222）。(D类)Paf1、Leo1和Rtf1在凝胶过滤柱上进行共分馏。在Superose 6柱上分离来自Leo1-HA1菌株（GHY1140）和HA1-Paf1菌株（GHK1147）的全细胞提取物，并通过免疫印迹分析洗脱液中的指示组分。每个实验至少进行两次，每个蛋白质的峰洗脱可重复地出现在级分10中。

**图3。**Paf1复合物成员共享的突变表型。(A类)具有指定基因型且含有*his4-912δ*和*lys2-128δ*插入物生长在YPD培养基上，复制到补充有组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、尿嘧啶和色氨酸（完全）以及SC-his和SC-lys培养板的最小培养基，并在30°C下培养3天。菌株：WT，FY118；*rtf1Δ*，KY522；*paf1Δ*，GHY917；*cdc73Δ*，1083加纳；*leo1Δ*GHY240；*ctr9Δ*，1157加纳。(B类)在YPD培养基上培养具有指定基因型的菌株，然后将其复制到缺乏或含有50µg/ml 6AU的SC-ura培养基上。在30°C下生长2天和4天后拍摄照片。菌株：野生型，KY286；*rtf1Δ*，425缅元；*paf1Δ*，KY686；*cdc73Δ*，KY689；*leo1Δ*，KY690；*ctr9Δ*，KY695。

**图4。** *rtf1Δ*和*paf1Δ*应变有缺陷*聚氨酯5*归纳。北方分析*聚氨酯5*对野生型（KY589）制备的总RNA样本进行转录，*rtf1Δ*（KY453）和*paf1Δ*（KY687）细胞。菌株生长至～1×10⁷SC-ura培养基中的细胞/ml，然后分裂。将6AU添加到培养物的一半，最终浓度为75µg/ml，两种培养物在30°C下生长指定时间（小时），然后再分离RNA。每条通道含有10微克总RNA聚氨酯5mRNA被剥离并探测*轿车1*mRNA作为负荷控制。

**图5。**抑制*标准贯入试验5^铯^–*生长缺陷*paf1*和*狮子座1*突变。将具有指定基因型的菌株复制到YPD培养基上，并培养2（30℃）或4（15℃）天。菌株：*spt5C型*^–，GHY92；野生型，FY653；*paf1-49 spt5C*^–，144加纳元；*leo1-43 spt5Cs*^–，141加纳。

**图6。**转录延伸因子与Paf1复合物相关。(A类)Spt5、Spt16和Pob3与HA1-Paf1和Leo1-HA1共同免疫沉淀。从缺乏HA1表位标签的菌株（模拟，GHY1102）、含有Leo1-HA1（GHY1184）、HA1-Paf1（GHY1147）的菌株和*paf1Δ*Leo1-HA1菌株（GHY1146）。如图所示，通过免疫印迹法分析免疫沉淀物中的Spt5、Spt16和Pob3。(B类)Spt5与Ctr9共免疫沉淀。对缺乏Myc标签的菌株（模拟，GHY1002）、Ctr9-Myc菌株（GHY1184）和*paf1Δ*Ctr9-Myc菌株（GHY1222）。结合蛋白通过1 M盐洗脱（洗脱）从抗Myc微球中洗脱，然后通过在样品缓冲液（微球）中煮沸小球。如图所示，通过免疫印迹法分析免疫沉淀物中的Spt5和Ctr9，以及抗Myc抗体。(C类)从酵母菌株FY1639制备全细胞提取物，用于Rtf1的免疫沉淀。用抗Spt5、抗Rtf1和抗TBP抗血清检测蛋白质印迹。用所示抗体进行免疫印迹分析20µg等分全细胞提取物、7µg未结合蛋白和五分之三的免疫沉淀样品（珠）。(D类)生长缺陷*paf1Δ* *dst1Δ*和*paf1Δspt16-197*双突变体。将具有指定基因型的细胞系列稀释液置于YPD培养基上，并在30°C下培养2天。菌株：野生型，FY653；*paf1Δ*，GHY917；*dst1Δ*，GHY285；*spt16-197型*，GHY1059；*paf1Δdst1Δ*，GHY1009；*paf1Δspt16-197*，1228加纳。

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1. Archambault J.、Chambers，R.S.、Kobor，M.S.、Ho，Y.、Cartier，M.、Bolotin，D.、Andrews，B.、Kane，C.M.和Greenblatt，J.（1997）酿酒酵母中与转录因子IIF相互作用的C-末端结构域磷酸酶的基本组分。程序。美国国家科学院。科学。美国，9414300–14305。-项目管理咨询公司-公共医学
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1. Brewster N.K.、Johnston，G.C.和Singer，R.A.（2001）由Pob3和Nhp6蛋白质组成的二分酵母SSRP1类似物调节转录。分子细胞。生物学，213491–3502。-项目管理咨询公司-公共医学

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