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.2005年3月23日；24(6):1222-31.
doi:10.1038/sj.emboj.7600607。 Epub 2005年3月3日。

Set1的组蛋白三甲基化由RRM、自抑制和催化结构域协调

阿里莎·施利希特 1, 布拉德利·凯恩斯
附属公司

Set1的组蛋白三甲基化由RRM、自抑制和催化结构域协调

阿里莎·施利希特等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

组蛋白H3的赖氨酸4的三甲基化发生在活性基因的5'端，并由酿酒酵母中的Set1催化。三甲基化需要组蛋白H2B泛素化和PAF1复合物，它们与转录延伸有关，但它们如何激活Set1尚不清楚。Set1还含有几个保守的结构域，这些结构域对活性的贡献没有特征化。在这里，我们分离出显性过度活跃的SET1（D）等位基因，揭示了SET1调控域之间的复杂相互作用。值得注意的是，Set1的RNA识别基序（RRM）是H3K4三甲基化所必需的，但不是二甲基化所必需的。此外，还发现了一个通过抑制三甲基化来对抗RRM功能的中央自抑制结构域。此外，催化结构域中的G990E替代物使Set1活性增强，并恢复了对RRM结构域中含有突变的Set1衍生物的三甲基化。令人惊讶的是，某些SET1（D）等位基因也部分恢复了缺乏组蛋白H2B泛素化或Paf1的菌株的三甲基化。综上所述，我们的数据表明，Set1的催化结构域整合了来自RRM和自抑制结构域的相反输入，从而将H3K4甲基化正确地连接到转录延伸过程。

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数字

图1
图1
无线电通信系统2等位基因被Set1截断衍生物N-Set1抑制。(A类)菌株的生长rsc2-V457M（YBC1111）和rsc2-D461G码（YBC1112）在富培养基（YPD）上。(B类)Set1导数映射：Set11–1080（p1067），设置1762–1080（p1102）称为N-Set1，Set1933–1080（p1066）SET域，Set1762–1080H1017K（p1103），设置1762–1080C1019A（第1104页）。(C)Set1的N-Set1导数抑制无线电通信系统2Ts公司−等位基因。（B）中的Set1构造被转换为rsc2-V457M菌株（YBC1111），并在30和33°C下在含有（左侧）或缺乏（右侧）蛋氨酸的培养基上生长。
图2
图2
的特征设置1天和集合1等位基因。(A类)的能力设置1天抑制等位基因rsc2-V457M.应变轴承rsc2-V457M（YBC1111）用空的YEp24载体、N-Set1（p1102）、Set1（p1067）、Set1R483W、A613T（p1368）、Set2G990E（+）S43N、S509F、P975S（p1306）或Set1G990E（p1305）进行转化，并在28和33°C下生长在缺乏尿嘧啶的培养基上。(B类)RRM域突变体无法抑制rsc2-V457M.应变rsc2-V457M（YBC1111）用空YEp24载体、N-Set1（p1102）、Set1（p1067）、SetlΔRRM（p1377）、Set 1 VYL295-297AAA、A293T（p1375）或Set1 VYS295-297DDD（p1376）进行转化，并在28或33°C下生长在缺乏尿嘧啶的培养基上。(C)G990E绕过RRM突变，能够抑制rsc2-V457M.应变rsc2-V457M（YBC1111）用空的YEp24载体、Set1 VYL295-297DDD（p1376）、Set1 R483W（p1409）、Set1G990E（p1305）、Set1-VYL2295-297DDD+R483W（p1431）或Set1VYL259-297DDD+G990E（p1410）进行转化，并在28或33°C下生长在缺乏尿嘧啶的培养基上。
图3
图3
的影响设置1天和集合1组蛋白H3K4甲基化水平的突变体内YBC1236菌株的全细胞提取物（5μg）(集合1Δ）用所示的含有Set1突变的质粒转化（质粒身份见图2），加载到SDS 10-20%丙烯酰胺凝胶上，转移到PVDF，并用所示抗体进行探测。通过将水平归一化到WT进行量化。我们注意到，个体生物复制品之间的H3K4Me散装水平变化±20%，因此准备了许多（3-5）个复制品并进行了比较。趋势是明确的，显示的是一个准确反映趋势的代表性实验。
图4
图4
Set1中的G990E替换产生一个过度活跃的H3K4甲基转移酶。(A类)Set7/9 SET域的结构（Xiao等, 2003). Set1中的G990E显性突变对应于Set7/9的G264（粉红色）。(B类)WT和G990E SET1/COMPASS复合物的纯化。通过TAP纯化从表达TAP标签的菌株中纯化SET1/COMPASS短纤维2（YBC1720），并含有含有WT Set1（p1067）或Set1 G990E（p1305）的质粒。将每个纯化复合物的10μl部分加载到SDS 4–15%丙烯酰胺凝胶上，并用银染色。(C)WT和G990E复合物的HMTase活性。纯化的复合物与2.5μg重组H3在S公司-腺苷蛋氨酸和HMTase缓冲液在30°C下放置16小时。将全细胞提取物（10μg）和每个反应的10%（250 ng H3）加载到SDS 10-20%丙烯酰胺凝胶上，并转移到PVDF膜上。免疫印迹与抗H3K4三甲基（上面板）、抗H3K4二甲基（中面板）、抗血清Set1或泛H3抗体孵育。注：通道1显示出非常弱的H3免疫反应性，因为该通道包含接近该pan-H3抗体检测极限的全细胞提取物，而其他通道具有重组H3。中间面板：用重组未修饰酵母单核小体（Nuc）甲基化H3K4（172 bp DNA，300 ng/反应），用抗H3K4-二甲基和抗H3 C-末端探测。(天)HMTase活动的时间进程。纯化的WT和G990E复合物（400 ng）与2.5μg重组H3在S公司-将腺苷甲硫氨酸和HMTase缓冲液（1、2、4、8或16 h）和20%的每个反应加载到SDS 10-20%丙烯酰胺凝胶上，并转移到PVDF膜上。用抗H3K4三甲基抗体检测免疫印迹。
图5
图5
设置1天等位基因部分绕过调节因子，恢复H3K4甲基化。(A类)甲基化设置1天在一个短纤维2Δ应变。WT（YBC63）和短纤维2用Set1（p1067）、N-Set1（p 1102）、Set1 R483W（p1409）、Set1G990E（p1305）、Set1-R483W-G990E（p1638）或空载体（p525）转化并生长在缺乏尿嘧啶和蛋氨酸的合成培养基中的Δ菌株（YBC1366）被加载到SDS 10-20%丙烯酰胺凝胶上，转移到PVDF，并用所示抗体进行检测。(B类)甲基化设置1天在一个paf1Δ应变。与（A）相同，但paf1Δ（GHY878）。(C)甲基化设置1天在中rtf1Δ应变。与（A）相同，但rtf1Δ（YBC2259）。(天)甲基化设置1天在一个放射性6Δ应变。与（A）相同，但放射性6Δ（YBC1539）。(E类)设置1天等位基因可以部分恢复paf1Δ含有羟基脲的培养基上的菌株。A类paf1用所示质粒转化Δ菌株（GHY880），并在选择性培养基或含有60 mM羟基脲（HU）的选择性培养基上测试其生长能力，然后生长6天。
图6
图6
描述Set1结构域在酶调节中作用的模型。Set1需要至少两个输入：（1）来自RRM结构域的正输入，该结构域依赖于已知与其他RRM蛋白质中RNA相互作用的疏水残基（VYL），以及（2）通过中央自抑制区域缓解抑制。在这里，R483增强了这种抑制，但只有去除整个结构域才能解除抑制。调控整合在SET结构域，其中关键残基（G990）调节活性和对RRM结构域的依赖性，以实现三甲基化。此位置的替换使该酶对H3K4过度活跃，并且不依赖于三甲基化的RRM结构域。N-SET和后SET域是SET域活性所必需的，N-SET域的氨基末端区域是高水平H3K4三甲基化所必需的。
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