共价修饰组蛋白氨基末端尾部调节对潜在DNA和因此在微调基因表达中起着重要作用(1).组蛋白修饰，如乙酰化和磷酸化促进染色质状态之间的转换限制转录(2). 最近，组蛋白甲基化已成为招募决定转录的染色质相关蛋白基因的可及性。几种甲基转移酶已被证明靶组蛋白氨基末端尾和标记相关核小体具有常色或异色状态(三–5).
甲基转移酶的一个子集包含一个高度保守的基序作为SET域。这个图案最初发现于果蝇属蛋白质S公司u（var）3-9，E类nhaceer-of-zeste和T型利托拉克斯，这是参与杂色或发育基因表达(6). 尽管SET结构域的功能作用并没有立即显现，受到限制与植物甲基转移酶的同源性促使人们发现Su（var）3-9及其葡萄裂殖酵母同源CLR4能够将甲基转移到组蛋白H3的Lys-9上(2). 这种甲基标签随后被证明可以标记核小体与转录沉默基因相关的附表。蓬贝交配型轨迹(7)和协会Su（var）3-9同系物与Rb共抑制复合物的同源性表明Lys-9甲基化也可能在常染色基因(8).
人类SET结构域蛋白，如MLL果蝇属三胸、NSD2和NSD3对于正常发育，也与发病机制直接相关癌症(9–11). 然而，这些角色仍有待确定蛋白质在建立和维持染色质状态和染色质修饰活性是否直接失效有助于基因表达谱的改变，导致癌症(12). 这些努力可能会受到哺乳动物细胞中SET结构域蛋白的数量（≈60）可能的功能冗余及其与各种异源合作伙伴(13–18). 相反地，酵母菌属酿酒只包含六个SET域蛋白质。其中之一是Set1p似乎在端粒沉默和交配型位点(19)以及DNA转录激活修复基因(20). 它的SET域与果蝇属Trithorise，trxG的创始成员维持同源异型体所需的转录调节因子哺乳动物和果蝇属(21，22).研究表明，一些trxG蛋白是多蛋白复合物(23)，但仅限SWI/SNF家族成员已被纯化并具有生化特征(24). 研究这种保守的染色质修饰机器的酵母，可以调动并重新配置核小体，为高等植物发育基因表达的分子机制真核生物。
我们在本报告中证明，Set1p是包含另一种trxG的Ash2同源物的七分子复合物蛋白质以及参与X染色体的蛋白质DPY-30剂量补偿(25). 组蛋白H3需要Set1p复合物Lys-4甲基化，表明存在共同的机制联系在以前不相关的染色质调节过程之间。
方法
蛋白质纯化和鉴定。
从RNA的流通部分纯化Set1p复合物聚合酶Ⅱ亲和纯化(26). 简单地说，一种蛋白质提取物由蛋白酶缺乏的酵母经玻璃均质制备而成珠子穿过肝素-脑糖浆柱。结合蛋白用0.6M KCl洗脱，用硫酸铵浓缩沉淀，并在含有0.2 M铵的缓冲液中吸收硫酸盐。将该部分（50 ml）在4°C下与与多元醇敏感共轭的Sepharose 4快速流动（500μl）(27)抗Set1p单克隆抗体。收集Sepharose珠通过离心（4000×克5分钟），然后用50 ml洗涤缓冲液（150 mM铵）洗涤三次硫酸盐/50 mM Tris，pH 7.4/1 mM EDTA/0.01%Nonide P-40/10%甘油/1 mM DTT），在4°C下，在室内用1 ml洗涤缓冲液进行一次温度。结合蛋白在洗涤缓冲液（500μl）中洗脱含40%丙二醇，在37°C。然后将亲和纯化的复合物进行凝胶在连接到智能系统的Superose 6色谱柱（3.2/30）上进行过滤（Amersham Pharmacia）与洗涤缓冲液平衡。大约60从50升中获得95%以上纯度的Set1p复合物μg起始酵母培养物的产率约为30%。纯化的三氯乙酸沉淀Set1p复合物在SDS 8–16%聚丙烯酰胺梯度或10%上分馏聚丙烯酰胺凝胶。考马斯蓝染色后，切割并干燥单个蛋白质带，并确定其特性根据测定的组成肽质量确定基质辅助激光解吸飞行时间质谱(28). 通过凝胶过滤对未净化的复合物进行分级在上述条件下，在Superose 6色谱柱上。小鼠抗血清针对Set1p复合物的特定成分提出了纯化麦芽糖结合蛋白融合蛋白及其在西药中的应用1:500稀释后的斑点。次级抗体由山羊组成抗鼠IgG（Accurate Chemical and Scientific，Westbury，NY）用于1:5000稀释。
酵母菌株和程序。
在破坏单个ORF后，评估端粒沉默菌株UCC3537[垫子一
尿酸3-52赖氨酸-第801页ade2-101吕2-Δ1trp1型-Δ63his3型-Δ200adh4型∷URA3公司(URA3公司在VIIL）直径5-1（VR的ADE2）]（丹·戈特施林的礼物，西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心）URA3公司和ADE2型在端粒的记者第VII号染色体的左臂和第V号染色体的右臂，分别是。每个编码Set1p复合物的基因的整个ORF组件（和证券投资风险2作为对照）被使用标准程序的G418-电阻盒。基因组DNA从起始密码子向上游延伸200bp和200bp的片段从每个ORF的终止密码子下游克隆到pRS315和用于补充。
UCC3537上缺乏Set1p复合物成分的酵母菌株背景测试对甲酰胺（2.5%）、雷帕霉素的敏感性（0.1 ng/ml）和氯丙嗪（30μM）[在Hartwell Complete上（HC）亮氨酸−板]和用于絮凝研究（HC完整Leu−液体介质）。S288C背景下的纯合子二倍体突变体（YM4174垫子一 尿酸3-52赖氨酸-801ade2-101列伊-Δ1trp1 his3-Δ200TYR MET罐1，垫子α尿酸3-52溶血素2-第801页ade2-101列伊-Δ1TRP公司his3型-Δ200tyr MET罐1)进行了生长测试酵母提取物/蛋白胨（YP）葡萄糖（2%）、YP蔗糖（2%）和YP含20μg/ml的棉子糖（2%）和YP半乳糖（2%溴化乙锭。对相同菌株进行了产孢试验通过使用标准协议提高效率。同宗交换内切酶（HO）启动子活性通过测量单倍体S288C菌株杂交后β-半乳糖苷酶活性与CY114相关的突变菌株(垫子一
HO–lacZ ura3-52赖氨酸2-801ade2-101列伊-Δ1his3型-Δ200）（赠与克雷格·彼得森，马萨诸塞大学医学院，马萨诸塞州伍斯特）和四分体解剖。
组蛋白甲基化研究。
核心组蛋白八聚体按所述进行纯化(29)来自野生型或突变酵母菌株（UCC3537衍生物）在YP葡萄糖中生长到OD600 nm时为1.0。通过使用1:2000抗甲基赖氨酸-4 H3抗血清（美国生化）稀释。辣根过氧化物酶结合抗兔IgG继发性抗体以1:5000的稀释度使用。的SET域要求在UCC3537衍生物中分析组蛋白H3 Lys-4甲基化菌株（set1:HIS3）补充全长或突变版本的SET1融合到绿色荧光蛋白（GFP）的羧基末端从行动1来自pRB2138的启动子(30).对结构进行排序，以确认工程Western检测基因突变和GFP融合蛋白表达印迹和荧光显微镜。细胞在HC中生长卢−培养基，组蛋白甲基化被评估为如上所述。
结果和讨论
Set1p复合物的纯化酿酒酵母.
确定Set1p作为多蛋白潜在部分的作用复合物，一种澄清的酵母粗提物通过叠加6个施胶柱。Western blot分析显示Set1p峰值440 kDa时（图。一个)，这是远大于预测的124-kDa分子质量单体Set1p，表明它与额外的蛋白质体内纯化Set1p和相关因子通过使用多元醇敏感的抗Set1p的亲和层析根据Thompson和伯吉斯(27). 用丙烯从亲和柱中洗脱Set1p用乙二醇代替变性剂可以通过凝胶进一步纯化过滤。亲和纯化Set1p的大小分析显示分子质量与在粗提取物中观察到的分子质量相同（图。)表明该综合体的主要组成部分仍然存在在净化过程中相关。
含Set1p蛋白复合物的纯化秒。酿酒(一个)粗提物秒。酿酒蛋白质通过凝胶过滤柱，并通过Western blot分析对所得组分进行分析使用抗Set1p单克隆抗体或针对设置1p复杂组件Bre2p、Saf41p、Saf17p和Saf19p（指示各面板右侧）。(B类)银色染色免疫纯化的凝胶过滤级分的SDS4-16%梯度PAGE抗Set1p的丙二醇辅助释放后的Set1p复合物关联列。点表示从上到下的复杂组件：Set1p、Bre2p、Saf49p、Sav41p、Saf17p、Saf25p和Saf19p产品的设置1基因和ORF2015瓦，YAR003W公司，YPL138C型，YKL018W型，YBR175瓦、和YDR469W型分别是。
纯化Set1p复合物的变性凝胶电泳分析发现了7种多肽的存在。这些是由以Set1p和六种以前未经特征化的蛋白质为例的质谱分析由编码YLR015W（BRE2），YAR003W公司，YPL138C型，YKL018W型，YBR175瓦、和YDR469W型（图。B类和图。). 这些Set1p相关因素包括以下简称Bre2p、Saf49p、Saf11p、Saf27p、Sav35p和分别为Saf19p。他们预测的分子量总计为363kDa，这与Set1p杂岩的表观质量一致凝胶过滤色谱法测定。考马斯群岛纯化复合物的蓝色凝胶表明，每种成分以化学计量的数量存在，尽管我们不能排除这一点一个或多个组分可能以非等摩尔比率存在，这将进一步增加综合体的质量。抗血清根据六种成分中的四种生成的结果表明在粗提取物中与Set1p共分馏（图。一个). 根据我们的观察，全基因组双杂交研究(31)确定Saf49p和Saf35p以及Bre2p和Saf19p之间。总的来说，这些观察结果表明，Set1p是之前未描述的多蛋白复合体。
Set1p复合体的子单位组成。(一个)考马斯蓝染色SDS/10%PAGE分析凝胶过滤部分9（见图。)用于回收复合体质谱分析组件。(B类)Set1p复合体的域结构示意图组件。域分配是使用聪明的工具(32)，除了DPY-30同源结构域基于酿酒酵母，秀丽隐杆线虫，D。黑腹食肉动物、和智人蛋白质序列。
Set1p复合体包含D.黑腹果蝇Ash2和秀丽线虫DPY-30。
序列比对和基序分析(32)表明Bre2p含有SPRY域（图。一个)，一个未知的主题存在于多种蛋白质中的功能(33). Bre2p是与…关系最密切果蝇属阿什2，atrxG公司影像盘图案形成所需的基因产物(34).然而，Bre2p缺乏一个高度保守的PHD指，这是在Ash2直方图黑腹果蝇，秀丽隐杆线虫、和附表。蓬贝(35). 有趣的是Set1p复合体Saf41p包含与Yng2p类似的PHD手指，NuA4组蛋白乙酰转移酶复合物的一种成分(36)及其人类同源物，Ing1抑癌蛋白(37). 因此，它是Bre2p和Saf41p可能共同构成一个二分体Ash2的功能同源物。综合体中最小的成员Saf19p，是一个明显的正交秀丽线虫DPY-30，它是雌雄同体蠕虫X染色体剂量补偿所需(38). 尽管DPY-30本身具有扩散核定位，但它具有被证明对其他人的性别特异性联系至关重要X染色体的剂量补偿因子。的机制DPY-30活性未知(39). 最后，Set1p复合体也含有三种WD重复序列蛋白（Saf49p、Saf37p和Saf35p；裁判。40)没有其他可识别的图案（图。一个).
Set1p复杂成分显示重叠的酵母缺陷表型。
除了WD-重复的Saf37p之外，所有的这些成分对两种植物的营养生长都是不必要的单倍体或二倍体状态。纯合子二倍体突变体的例外集合1应变。单个酵母菌株非重要部件的缺陷显示类似絮凝表型和对甲酰胺的可比敏感性，氯丙嗪和雷帕霉素（表).缺少Saf41p（PHD指蛋白）的细胞持续显示在这些条件下，表型不太严重。缺乏的菌株Set1p复合组分生长在非葡萄糖碳源上与Swi2的酵母突变相比，能够激活HO启动子，另一种trxG相关蛋白。对生长的综合影响没有观察到两个或多个非必需基因缺失的复合突变体组件（未显示数据）。观察到的上位性表明成分在共同的遗传途径中发挥作用，并且与他们参与了一个生化复合物。
表1
酵母突变株中观察到的表型摘要Set1p复合体 组件
| 重量 | 集合1 | 短纤维2 | 安全49 | 安全41 | 安全35 | 安全19 |
|---|
| 絮凝作用 | − | + | + | + | +/− | + | + |
| 甲酰胺敏感 | − | + | + | + | +/− | + | + |
| 氯丙嗪敏感 | − | + | + | + | +/− | + | + |
| 雷帕霉素敏感 | − | + | + | + | +/− | + | + |
| 组蛋白H3裂解-4甲基化 | 100% | 0 | 10% | 0 | 50% | 0 | 10% |
除了激活转录的潜在作用外，Set1p还具有也与端粒和交配型基因座的沉默有关(19). 与之前的研究一致集合1菌株，缺乏其他复杂成分的酵母短纤维2，显示端粒的不同水平的去表达URA3公司以5-氟代甲酸（FOA）为证据的标记尿酸敏感性与正常生长−盘子（图。). 相比之下短纤维2菌株表现出增强的FOA抗性和部分尿嘧啶营养不良（图。). 这种表型可能反映了短纤维2将其发起人与PPR1（PPR1），哪些代码用于激活URA3公司因此短纤维2可能会导致PPR1（PPR1）发起人Ppr1p水平降低。根据这些观察结果，我们建议在缺乏端粒沉默的菌株中观察到端粒沉默缺陷Set1p复杂组件可能是URA3公司-特定事件反映补偿性变化PPR1-BRE2型发起人。这一理论得到了我们无法检测沉默的支持使用ADE2型端粒标记（图。). 尽管其他trxG蛋白的酵母同源物，如Swi/Snf，已经被参与激活和抑制转录过程，Set1p复合体的角色是否在沉默是直接或间接的。
Set1p复合物缺陷酵母菌株的端粒沉默缺陷组件。电镀效率和应变分段URA3公司和ADE2型存在于端粒部位在缺乏Set1p复合物的酵母菌株中评估（UCC3537）组件或证券投资风险2(上部)已转换与pRS315载体互补后，携带各自的外源基因(下部). 等分当量将10倍系列稀释液涂布在缺乏合成介质的情况下亮氨酸是否存在FOA或尿嘧啶。请注意saf37型突变体无法研究，因为它是无法工作。
组蛋白H3甲基化需要Set1p复合物赖氨酸-4。
尽管进行了广泛的遗传学研究SET结构域蛋白未知。最近，SET域蛋白SUV39H1被证明是组蛋白H3特异性甲基转移酶(三)其Lys-9的甲基化在异色沉默(41，42)和常染色体基因抑制(8).与高等真核生物和附表。蓬贝，秒。酿酒没有SUV39H1的同源基因，并且缺乏甲基化组蛋白H3 Lys-9。然而，在残基4处观察到赖氨酸甲基化组蛋白H3的氨基末端尾部内秒。酿酒(43). 因此，我们评估了酵母是否缺乏Set1p复合体成员组蛋白H3的改变Lys-4甲基化。从各种突变菌株中纯化组蛋白并使用针对组蛋白H3的甲基赖氨酸-4。H3 Lys-4甲基化完全丧失是在中观察到集合1菌株以及缺乏的菌株WD-重复蛋白Saf49p和Saf35p。减少90%以上在短纤维2和安全19应变，而缺乏PHD蛋白Saf41p的菌株（图。一个). 相对保存后者的组蛋白甲基化与其温和的表型相关遗传分析中的读数（表). 组蛋白H3 lys4缺失甲基化集合1赛特1p拯救了该菌株，但没有通过缺失羧基末端SET结构域的突变型Set1p（集合11–899). 通过以下方法恢复H3 lys4甲基化包含SET结构域和侧翼的Set1p的C末端部分序列（集合1762–1080). 然而，甲基化未被携带SET突变的可比构建体恢复在植物甲基转移酶和SUV39H1甲基转移酶活性的关键（集合1H1117R型) (三)或胚胎功能果蝇属三胸（套1G951S型)（图。B类; 参考文献。6和44). 这些结果与Set1p作为组蛋白甲基转移酶的作用；然而，我们还没有用纯化的Set1p复合物或重组Set1p在体外.这个观察表明，其活动受到未定义的限制酶的需求，或者不太可能，它起到间接作用组蛋白甲基化。然而，我们的数据表明，Set1p复合物对组蛋白H3的Lys-4甲基化至关重要秒。酿酒并暗示Set1p的SET域（及其MLL同源）可能是组蛋白甲基转移酶。
组蛋白H3的Lys-4甲基化需要Set1p复合物体内(一个)核心组蛋白纯化自野生型（1号道）或突变酵母菌株（2-7号道）Set1p复合物成分不足（如凝胶层所示）是考马斯蓝染色SDS/PAGE分析(上部)和Western blotting使用抗甲基赖氨酸-4抗血清(下部).(B类)核心组蛋白从集合1表达凝胶层上方所示结构的菌株和通过SDS/PAGE和Western分析组蛋白H3 Lys-4甲基化印迹分析。
Set1p综合体提出了一个发展的力学模型和性别特异性表观遗传调控。
这些观察结果表明了一种模型，在该模型中，Trithorax-like SET结构域蛋白质通过组蛋白对染色质产生影响甲基化，而Ash2-like trxG蛋白明显调节这一点通过与DPY-30类分子协同工作来激活。基于Bre2p（Ash2-相关）和Saf19p的物理结合（DPY-30相关）及其突变体的遗传相似性表型，我们建议维持霍克斯基因中的表达式D.黑腹果蝇（灰烬依赖）和小鼠X染色体剂量补偿的调节秀丽线虫（依赖DPY-30）是常见染色质的物种特异性读数改造机械。除了造成XX特定的致命性外，dpy-30型XO动物的突变导致发育迟缓，体型小，无法交配，尾巴形态异常(45). 这些表型表明DYP-30的作用更广泛，甚至更多详细研究霍克斯基因表达模式是有保证的在里面dpy-30型突变体。
Set1p复合物的WD-重复蛋白质可能以其对底物组蛋白H3的甲基转移酶活性。这个建议基于(我)组蛋白H3 Lys-4的完全丢失WD-重复蛋白Saf49p和Saf35p；(ii（ii）)这些蛋白质在物理上在双混合屏幕中进行交互(31); 和(三)的Saf35p与Cac3p和Hat2p的结构相似性结合组蛋白和其他染色质修饰复合物的成分(46). 的作用Saf37p，一种WD-重复蛋白，是复杂，是不确定的，但我们的数据显示它是唯一存在的在含有Set1p的定径柱中的洗脱馏分中。这个调查结果反对其参与其他综合体，或与Set1p无关的函数。
Set1p对组蛋白H3 Lys-4甲基化的潜在作用最近的研究表明，机械附表。蓬贝那个将此修改与转录能力联系起来常染色区(7). 还显示组蛋白H3 Lys-4从酵母到人类，甲基化是保守的(43). 在这种情况下，单一复合物中存在Ash2和Trithori同源物他们对组蛋白甲基化的需求体内提供一个它们基因相互作用的分子基础果蝇属并提出一种维持发育基因的机制表达。
