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.2002年4月；22(7):1971-80.
doi:10.1128/MCB.22.71-1980.2002。

Ctr9、Rtf1和Leo1是Paf1/RNA聚合酶II复合物的成分

切丽·L·米勒 1, 朱迪思·阿杰宁
附属公司

Ctr9、Rtf1和Leo1是Paf1/RNA聚合酶II复合物的成分

切丽·L·米勒等。 分子细胞生物学. 2002年4月.

摘要

酿酒酵母Paf1-RNA聚合酶II（Pol II）复合物在生化和功能上与Pol II全酶的Srb-介体形式不同，是基因子集完全表达所必需的。在这项工作中，我们使用串联亲和纯化标签来分离Paf1复合物，并使用质谱来鉴定其他成分。我们已经确定，Ctr9、Rtf1和Leo1是与Paf1、Cdc73和Pol II相关的因子，但与Srb-介体无关。PAF1或CTR9的缺失导致类似的严重多效性表型，当这两个突变结合时，这些表型没有改变。相反，我们发现LEO1或RTF1的缺失导致很少明显的表型，尽管RTF1的突变抑制TATA-结合蛋白的突变，改变转录起始位点，并影响延伸。值得注意的是，LEO1或RTF1的缺失抑制了许多paf1Delta表型。特别是，rtf1Delta paf1Delta双突变体的生长速度更快，对温度不太敏感，并且比paf1Del塔单突变体对咖啡因和羟基脲的抗性更强。此外，G（1）细胞周期蛋白CLN1在paf1Delta中的表达减少了近三倍，在rtf1Delta paf1Delta-双突变体中恢复到野生型水平。我们认为，缺乏Paf1会导致复合物缺陷和转录障碍，而Leo1或Rtf1的去除可以缓解这一问题。

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数字

图1。
图1。
Paf1杂岩不同于Srb-Med杂岩。用兔IgG琼脂糖培养TAP标记的Cdc73株（YJJ1307）和Srb5株（YJ J1308）的全细胞提取物。洗去未结合的蛋白质，并通过添加TEV蛋白酶洗脱与TAP-Cdc73相关的蛋白质。将组分（IP，输入；FT，流通；E，洗脱液）加载到4-12%NuPAGE凝胶上，并用所示抗体进行Western blotting分析。星号表示来自IgG琼脂糖柱的交叉反应IgG，箭头表示TEV蛋白酶裂解形式的TAP-Srb5。我们观察到与α-Paf1抗体的两条交叉反应带（另请参见图5B和参考文献47）；然而，TAP标记的Srb5洗脱液中的开环指示的微弱带并不对应于Paf1的任何一种形式，并且其存在不可再现（见图5B）。
图2。
图2。
Paf1复合物约为1.7 MDa。与Cdc73-TAP相关的蛋白质经IgG琼脂糖层析和TEV蛋白酶洗脱后，在Superse 6凝胶过滤柱上进行凝胶过滤层析。在4-12%NuPAGE凝胶上分离组分，并用所示抗体进行Western印迹分析。通过使用材料和方法中所述的指定标准校准凝胶过滤柱来确定尺寸。
图3。
图3。
Ctr9、Rtf1、Leo1和Spt5与Paf1复合物相关。将Superose 6凝胶过滤柱中的37至41和69至73馏分混合，TCA沉淀，并在4至12%NuPAGE凝胶上分离。蛋白质条带通过胶体蓝染色显示，并处理用于MALDI-TOF分析。对准确鉴定的蛋白质进行标记。
图4。
图4。
Ctr9和Hpr1均与RNA Pol II和Paf1相关。（A） 从TAP标记的Ctr9菌株（YJJ1329）中纯化Ctr9相关蛋白。样品在Superose 6凝胶过滤柱上分离，并用所示抗体进行免疫印迹。（B） 从TAP标记的Hpr1菌株（YJJ1334）中纯化Hpr1相关蛋白。样品在凝胶过滤柱上分离，并用指示的抗体进行免疫印迹。
图5：。
图5：。
Leo1-HA与Paf1复合物相互作用，但与Srb-Med复合物不相互作用。（A） Leo1-HA与Paf1和Rtf1的共免疫沉淀。按照材料和方法中所述，用抗HA（12CA5）抗体对从野生型（YJJ662）或Leo1-HA株（YJJ1330）制备的全细胞提取物进行免疫沉淀。使用所示抗体通过Western blotting分析免疫沉淀物。IP，输入；UB，未结合部分；B、 束缚分数。（B） Leo1-HA的TAP标签纯化。如材料和方法中所述，用IgG珠培养由含有TAP标签和Leo1-HA标签的菌株（YJJ1309、YJJ1331和YJJ1323）制备的全细胞提取物。洗涤后，加入25 U TEV蛋白酶从珠中洗脱蛋白质。用TCA沉淀洗脱液，并用所示抗体进行免疫印迹分析。IP，输入；FT，流通；E、 洗脱液。
图6。
图6。
Cdc73-TAP与蛋白酶体的成分无关。使用兔IgG琼脂糖珠对Cdc73-TAP菌株的提取物进行亲和纯化。通过添加TEV蛋白酶从树脂中洗脱结合蛋白。洗脱液通过SDS-PAGE溶解，并用蛋白酶体特异性抗体进行免疫印迹。IP，输入；FT，流通；E、 洗脱液。
图7。
图7。
删除RTF1级基因抑制由基因断裂引起的缺陷PAF1型基因。（A） 指示缺失菌株在YPD中30°C下生长的生长曲线。（B） YJJ662（野生型）、YJJ1303的培养物(rtf1Δ::坎第页)、YJJ1326(rtf1Δ::坎第页paf1Δ::HIS3型)、YJJ577(paf1Δ::HIS3型)单元格（约107/ml）在YPD培养基上的10倍系列稀释液中发现，并在30和36°C下生长，在含有4 mM咖啡因和50 mM羟基脲的YPD上生长，并在30C下生长。（C） YJJ662（野生型）、YJJ1336（leo1Δ）、YJ J1361（leo 1Δpaf1Δ）和YJJ577（paf1△）培养物生长在面板B所示的培养基上。培养4天后拍摄平板照片。
图8。
图8。
CLN1消息在rtf1Δpaf1Δ双突变株。所示缺失菌株的重复培养物生长到1.3×10的密度7细胞/ml，收集总RNA，并对每条通道分离15μg RNA。用放射性标记探针检测mRNA水平第1类并归一化为材料和方法中所述的18S rRNA。上面板中的条表示下面板中显示的重复样本的平均值。
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