ING2 PHD的绑定（ING2博士)脂质信号分子磷脂酰肌醇-5-磷酸（PtdIns（5）P）的结构域对ING2在DNA损伤反应中向染色质募集至关重要7由于一些磷脂酰肌醇磷酸（PtdInsP）结合域通过脂质和肽的双重识别发挥作用8，9，我们询问ING2 PHD结构域除了PtdInsP配体外是否还有蛋白质。在一个在体外ING2下拉屏幕博士蛋白质结合伴侣，我们鉴定了组蛋白H3(补充图S1a). ING2公司博士-与H3的结合独立于PtdIns（5）P结合，并在纯化的大块组蛋白的直接下拉试验中得到证实(;补充图S1a).
ING2 PHD结构域特异性结合H3K4me3在体外一谷胱甘肽的考马斯蓝染色S公司-转移酶（GST）–ING2博士和GST控制小牛胸腺组蛋白的下拉。b条，凝胶位移显示ING2博士-与纯化的天然核小体结合。非变性凝胶上核糖体DNA的溴化乙锭染色。c（c），GST下拉分析的Western blot分析，如a.天，ING2 PHD结构域优先结合H3K4me3肽。用指示的GST融合蛋白和生物素化肽对组蛋白肽下拉的Western分析。用已知的甲基赖氨酸结合域证实了肽的完整性(补充图S1d，e). 氨基酸。e（电子），ING2需要H3K4甲基化博士-与染色质结合在体外.GST–ING2的西方分析博士从野生型或Set1-null纯化的染色质的下拉分析酿酒酵母菌株。（f）在组蛋白肽结合分析中，酵母和人类ING家族蛋白的PHD结构域优先与H3K4me2/3结合。
ING2 PHD结构域与哺乳动物细胞纯化的天然单核小体牢固结合()但是，与ACF（ATP-依赖性染色质组装因子）和p300（E1A结合蛋白p300）PHD结构域相比，没有结合重组组蛋白重组的单核小体(补充图S1b)10，11因此，我们假设该结构域可能识别翻译后H3修饰。ING2的Western blot分析博士-结合组蛋白显示赖氨酸4上H3的显著甲基化，但赖氨酸9上没有(). 在在体外甲基化组蛋白肽的结合分析，ING2 PHD结构域与H3K4me3的结合最为强烈，与H3K4me2的亲和力较低，而与许多其他肽的亲和力则完全不同(;补充图S1c).
在描述ING2晶体结构的随附文件中博士–ING2的H3K4me3肽复合物天冬氨酸230（D230）与H3K4me3识别有关12因此，将D230替换为丙氨酸（ING2博士-D230A)大部分消除了H3K4me3肽结合(). 如核磁共振二维谱所确定的那样，这种取代的效果不是由于PHD结构域的去折叠12值得注意的是，这种突变对ING2 PHD结构域的脂质结合活性没有影响(补充图S2)因此，允许在功能研究中选择性地取消ING2–H3K4me3相互作用（见下文）。最后，全长ING2，但不是PHD域缺失突变体（ING2ΔPHD)与甲基化H3K4肽特异结合(). 因此，ING2 PHD结构域对于ING2与H3K4me3的相互作用是必要且充分的在体外.
通过H3K4甲基转移酶SET7（也称为SET9；参考文献。13)H3K4脱甲基酶LSD1（也称为AOF2；参考文献。14) (补充图S3). 此外，从野生型纯化的染色质中，ING2 PHD结构域与H3有效结合酿酒酵母菌株，但不是来自缺乏H3K4甲基转移酶Set1的菌株(). 总之，这些数据表明H3K4甲基化对ING2至关重要博士-染色质与组蛋白H3结合在体外.
与ING2 PHD域一样酿酒酵母和其他人类ING家族成员都优先结合二甲基化H3K4，而Miα2与三甲基化H3K36结合的自身抗原(;补充图S4a、b). 因此，甲基化组蛋白肽的识别是至少一部分PHD结构域的一般特征，ING PHD家族构成了甲基化H3K4的一类新的结合模块。
ING2在mSin3a–HDAC1复合物中的功能作用尚不清楚6我们假设ING2通过其PHD结构域将mSin3a–HDAC1复合物与甲基化H3K4桥接，从而促进附近乙酰化组蛋白残基的脱乙酰化。为了验证这个想法，我们纯化了包含ING2、ING2的ING2–mSin3a–HDAC1复合物ΔPHD或ING2D230A型两种突变均未改变ING2复合物的组成(;补充图S5). 在肽下拉分析中，野生型而非突变型ING2复合物优先与H3K4me3结合(). 此外，SET7对H3K4的超甲基化增强了野生型而非突变型ING2复合物的组蛋白脱乙酰酶活性(). 因此，ING2 PHD结构域对甲基化H3K4的识别促进了mSin3a–HDAC1复合物的组蛋白脱乙酰酶活性在体外.
ING2 PHD结构域甲基化H3K4识别增强ING2相关的HDAC1组蛋白脱乙酰酶活性在体外一，亲和纯化野生型和突变型Flag–ING2复合物的西方分析。模拟，空载体控制免疫沉淀。b条，ING2复合物与甲基化H3K4肽的结合需要完整的PHD结构域。对所示HDAC1–ING2复合物的组蛋白肽下拉物进行抗ING2西式分析。c（c）在野生型而非突变型中，组蛋白HDAC1脱乙酰化，ING2复合物通过ING2 PHD结构域与甲基化H3K4结合而增加。西方分析在体外在SET7甲基化存在或不存在的情况下，ING2复合物的组蛋白脱乙酰化反应。以曲古抑菌素A（TSA）抑制组蛋白去乙酰化酶为对照。d日，ING2复合物相对组蛋白去乙酰化酶活性的定量c（c）来自三个独立的实验。误差条表示标准误差。
接下来，我们研究了ING2 PHD结构域在细胞生理染色质背景下对甲基化H3K4的识别。蛋白质-蛋白质染色质免疫沉淀（ChIP）分析15，野生型ING2与H3K4me3强相关，但仅与H3K4me2弱相关，而与其他修饰组蛋白无关，表明H3K4me3是首选组蛋白体内ING2的目标(; 数据未显示）。此外，D230A突变和一些破坏H3K4me3结合的额外替换大多消除了H3K4me3相互作用在体外12(; 数据未显示）。我们得出结论，PHD结构域是ING2与H3K4me3在染色质处结合所必需的体内.
ING2与三甲基H3K4发生相互作用体内需要完整的PHD域a、 b条，体内野生型但非PHD域突变体ING2蛋白与染色质处H3K4me3的关联。蛋白质交联的西方分析就地蛋白-蛋白ChIP中的野生型或突变型Flag–ING2蛋白。注意突变型和野生型ING2与SAP30的结合相等(一)和HDAC1(b条). 加载的输入占总数的5%。c（c），WDR5击倒后H3K4me3水平降低。转染HEK293T细胞的Western分析西部数据5或控制RNA干扰（RNAi）载体。d日，Flag–ING2与内源性H3的关联需要H3K4me3。蛋白质-蛋白质ChIP的西方分析一具有或不具有WDR5敲除。e（电子），H3和ING2的内源性结合需要H3K4me3。通过蛋白-蛋白ChIP对H3结合蛋白进行西方分析，有或没有WDR5敲除。（f），WDR5敲除降低细胞周期蛋白D1启动子处的ING2占用率。在显示的ChIP中，无论是否有WDR5敲除，cyclin D1启动子和3′编码区序列的水平（输入百分比=ChIP/input×100）。误差条表示来自三个独立实验的s.e.m。
为了确定内源性H3K4me3对ING2与H3的关联是否重要，我们敲除了甲基转移酶组分WD40-repeat蛋白WDR5的表达，这导致H3K4me3水平的特异性降低()16这伴随着染色质处标记的和内源性ING2与H3的结合大大减少（不影响与HDAC1的复合物形成）(). 因此，ING2与H3的相互作用需要H3K4me3，内源性ING2在染色质处与三甲基化的H3K4特异性结合体内.
为了研究ING2与靶基因染色质的关联，我们将重点放在细胞周期调节因子cyclin D1上。该基因被mSin3a–HDAC1复合物转录失活17在ChIP分析中，Flag–ING2（以及预期的三甲基和二甲基H3K4三，4)在cyclin D1启动子上特异性检测到，但在3′编码区没有检测到(;补充图S6a). 此外，WDR5基因敲除降低了细胞周期蛋白D1启动子的ING2占有率(). 因此，H3K4的三甲基化对细胞周期蛋白D1启动子处ING2的结合很重要。
为了研究ING2–H3K4me3相互作用的生物学意义，我们使用了ING2互补系统7由此，抗RNA干扰（RNAi）的野生型或突变型（D230A或ΔPHD）ING2构建物在ING2敲除细胞中稳定表达。敲除细胞中ING2的表达显著降低，不同的ING2结构在可比水平上重建了表达(). 值得注意的是，与对照（野生型）细胞相比，ING2敲除细胞对阿霉素的反应表现为细胞周期蛋白D1 mRNA的抑制受损，并且敲除细胞与野生型ING2的互补主要恢复了有效的细胞周期蛋白D_1的抑制(). 相比之下，ING2D230A型和ING2ΔPHD蛋白质的重建活性显著降低(). 因此，H3K4me3的PHD域识别对于ING2介导的抑制细胞周期蛋白D1 mRNA表达以应对DNA损伤非常重要。
ING2 PHD结构域对H3K4me3的识别体内对ING2功能至关重要一，所示细胞系中ING2表达的西方分析。*，内源性ING2。b条，ING2是抑制细胞周期蛋白D1表达以响应阿霉素（dox）所必需的。含或不含阿霉素（0.2μg ml）的细胞周期蛋白D1 mRNA定量PCR−1，24小时），在野生型（“WT”）、敲除（“KD”）和用ING2（“KD+ING2”）细胞系重组的敲除中。c（c），突变ING2蛋白在重组阿霉素依赖的细胞周期蛋白D1阻遏中的活性受损，如b条，相对于野生型ING2（“KD+ING2”）。在b条和c（c），误差条表示一式三份实验的s.e.m；对-值<0.01。d-f型细胞周期蛋白D1启动子处ING2-HDAC1占用率的增加依赖于DNA损伤，需要甲基化H3K4结合。带有Flag抗体的ChIP(d日)，巴格达1(e（电子）)和H4K8ac(（f）)在所示细胞系的cyclin D1启动子处，添加或不添加阿霉素（2μM，1 h）。误差条表示至少三个独立实验的标准偏差。对-值<0.05。克在含有或不含有阿霉素（0.2μg ml）的指示细胞系中对细胞周期蛋白D1蛋白进行Western分析−1，24小时）。小时，ING2敲除或用H3K4me3-结合缺陷ING2重组后阿霉素敏感性受损。相对细胞活力归一化为未处理细胞。误差条表示3-6个独立实验的标准误差。
接下来，我们检测了ING2–HDAC1复合物对DNA损伤的反应中的启动子占有率。阿霉素治疗增加了细胞周期蛋白D1启动子处野生型ING2启动子的占有率，但没有突变()以及第二个HDAC1调节的DNA损伤反应基因，c-Myc公司(补充图S7)18此外，细胞周期蛋白D1启动子处的HDAC1占有率和组蛋白去乙酰化均增加了DNA损伤，这些反应在敲除细胞中基本消除，通过野生型而非突变型ING2的重组恢复(). H3K4me2、H3K4me3和H3水平在不同的细胞系中是一致的，并且不受阿霉素治疗的影响(补充图S6b). 在西方分析中，在野生型ING2存在下（在对照细胞和用ING2重组的敲低细胞中），细胞周期蛋白D1蛋白水平在DNA损伤后受到抑制，但在敲低细胞或用突变ING2蛋白重组的敲低细胞中仅略有降低(). 我们得出结论，在DNA损伤反应和启动子同源基因的主动转录抑制期间，ING2 PHD结构域对H3K4me3的识别对于ING2–HDAC1复合物在靶启动子处的正确占据至关重要。
最后，PHD域对H3K4me3的识别对于ING2调节细胞功能至关重要。具体而言，ING2敲除显著降低细胞对阿霉素的敏感性()ING2通过重组具有野生型但没有突变的敲除细胞来逆转这种效应(). 总之，这些数据表明ING2的H3K4me3结合活性对ING2在细胞对DNA损伤的反应中的功能至关重要。
我们的发现和以前的工作表明，ING2的PHD域是一个结合PtdIns（5）P和H3K4me3的双特异性模块。这些活性可由结构域内的特定突变分离，两者似乎对ING2细胞功能至关重要。PtdIns（5）P-结合可能介导ING2向靶启动子的转运，其中与H3K4me3的结合有助于ING2在这些启动子上的保留（参见补充图S8). 在这方面，ING2 PHD结构域的多功能性可能有助于整合将DNA损伤与染色质反应联系起来的复杂核信号事件。
H3K4的甲基化被认为是不同转录因子的结合平台，在基因激活中起着关键作用16，19-21我们的发现确定ING2 PHD域是甲基化H3K4的第一个效应域，它将这种修饰与转录抑制联系起来。通过将HDAC1阻遏物复合物集中在活性转录基因上，ING2对H3K4me3的识别可能对急性基因阻遏的效率很重要。在细胞对急性应激（如DNA损伤）的反应中，这种机制可能特别重要，在这种情况下，快速关闭增殖基因对防止含有受损DNA的细胞繁殖至关重要。其他ING蛋白的PHD结构域也与甲基化的H3K4结合，因此可能将这种修饰与额外的细胞功能联系起来。此外，核小体重塑因子（NURF）复合物成分BPTF（溴代多巴胺和PHD域转录因子）的PHD域也识别甲基化H3K4（参考文献。22)，表明PHD结构域作为甲基赖氨酸效应结构域具有更普遍的作用。总之，我们的发现强调了这样一个概念，即效应蛋白识别染色质修饰，而不是特定修饰就其本身而言决定了生物功能，因此极大地扩展了染色质信号的多样性。
