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EMBO J。2002年4月2日；21(7): 1764–1774.
doi（操作界面）：10.1093/emboj/21.7.1764
预防性维修识别码：PMC125365型
PMID：11927560

Paf1复合物在物理和功能上与转录延伸因子相关体内

沙龙·L·斯奎佐，1 帕特里克·J·科斯塔，2 Derek L.Lindstrom（德里克·L·林德斯特罗姆），1 凯瑟琳·库默，2 拉吉娜·西米奇，2 詹妮弗·詹宁斯，三 安德鲁·林克，三 凯伦·阿恩特，2,4和格兰特·哈特佐格1,4
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

我们正在使用生物化学和遗传学方法来研究Rtf1和Spt4–Spt5复合物，它们独立地与RNA聚合酶II的转录延长有关。在这里，我们报告了这些研究的显著趋同。首先，我们纯化了Rtf1及其相关酵母蛋白。将此方法与遗传分析相结合，我们发现Rtf1和Leo1，一种功能未知的蛋白质，是RNA聚合酶II相关Paf1复合物的成员。进一步分析揭示了Paf1复合物成员、Spt4–Spt5和Spt16–Pob3（人类延伸因子FACT的酵母对应物）之间的等位基因特异性遗传相互作用。此外，我们独立隔离paf1和狮子座1无偏见的感冒抑制基因筛查中的突变标准贯入试验5突变。Paf1复合物Spt4-Spt5和Spt16-Pob3之间的物理相互作用支持了这些遗传相互作用。最后，我们发现Paf1复合物的缺陷导致对6-氮杂嘧啶的敏感性降低聚氨酯5诱导，通常与受损的转录延伸相关的属性。综上所述，这些数据表明，Paf1复合物与Spt4–Spt5和Spt16–Pob3在转录延伸阶段发挥作用。

关键词：Paf1复合物/Rtf1/Spt4–Spt5/Spt16–Pob3/转录延伸

介绍

RNA聚合酶II（RNA pol II）合成RNA转录物需要成功完成转录周期中的至少四个步骤：启动子结合和启动；启动子清除；伸长率；和终止。调节这些步骤的转录因子通常与聚合酶直接相互作用，一些RNA pol II相关的调控复合物已被鉴定。这些包括Srb-介体复合体，其功能是转录辅激活子(汉普西和莱因伯格，1999年)以及Paf1复合物，该复合物被提议作为Srb-介体的替代物(施等., 1997). 虽然许多研究侧重于启动的调控，但最近的研究表明，转录延伸也受多种转录因子控制，其中许多转录因子与聚合酶结合。例如，DSIF，酵母Spt4–Spt5复合物的人类对应物，与RNA pol II结合并调节转录延长(瓦达等.，1998年a，b条).

SPT4标准，SPT5标准和相关基因SPT6标准最初通过对影响酵母转录因子的遗传选择进行鉴定(Winston等人，1984年). 利用酵母和人类细胞进行的生化和遗传学实验表明，Spt4–Spt5/DSIF和Spt6在转录延长中可能既有积极作用也有消极作用(Hartzog等人，1998年;Wada等人，1998年b;Wu-Baer等人，1998年;Ivanov等人，2000年). 研究涉及果蝇属多线染色体表明果蝇属Spt5和Spt6的同源物与RNA pol II的过度磷酸化延伸形式共同定位于许多活性转录基因，表明这些因子广泛参与转录延伸体内(Andrulis等人，2000年;卡普兰等人，2000年).

SPT16标准/CDC68型被用于发现SPT4标准，SPT5标准和SPT6标准(Malone等人，1991年). 与Pob3一起，Spt16是酵母CP或SP复合物的亚单位(Brewster等人，2001年;福尔摩沙等人，2001年). CP/SP的人类对应物FACT被纯化为一种因子，通过染色质促进RNA pol II的延伸在体外(孤儿等，1998年，1999). 遗传和生物化学研究表明，与Spt4-Spt5类似，CP/SP/FACT既可以促进也可以抑制转录(Malone等人，1991年;Rowley等人，1991年;Brewster等人，1998年;Evans等人，1998年;Wada等人，2000年).

这些蛋白质对伸长的差异影响可能与模板的染色质状态有关。FACT通过核小体促进伸长，FACT和酵母CP/SP复合物（与Nhp6结合）都可以结合核小体(孤儿等，1998年，1999;Formosa等人，2001年). 组蛋白编码基因的类似突变HTA1-HTB1型(Clark-Adams等人，1988年),标准贯入试验4，标准贯入试验5，标准贯入试验6和spt16型突变可以抑制Swi–Snf染色质重塑复合物的丢失(Malone等人，1991年;斯旺森和温斯顿，1992年;Evans等人，1998年). 此外SPT5型，SPT6标准或SPT16标准赋予突变表型类似于由HTA1-HTB1型(克拉克·亚当斯和温斯顿，1987年;Clark-Adams等人，1988年;Malone等人，1991年;Swanson等人，1991年)，Spt6表现出核小体组装活性在体外(Bortvin和Winston，1996年).

酵母的遗传研究揭示了在转录延伸中具有潜在作用的其他因素。酵母RTF1级基因表现出参与这一过程的基因的若干属性。例如RTF1级当与已知延伸因子基因的突变相结合时，引起对碱基类似物6-氮杂尿嘧啶（6AU）的敏感性和一系列合成表型，包括SPT4标准，SPT5标准和DST1型，对TFIIS进行编码(Costa和Arndt，2000年). 此外，对导致致命性的突变与rtf1Δ突变鉴定出三个参与转录延伸的基因，CTK1型，飞行控制面板1和第三波(Costa和Arndt，2000年).CTK1型编码CTDK-I激酶的催化亚单位，磷酸化RNA pol II的C末端结构域（CTD）(Lee和Greenleaf，1991年). 转录周期从起始阶段到延伸阶段的转变与CTD的磷酸化密切相关(Prelich，2002年). 酵母中有四种不同的CTD激酶(Prelich，2002年). 其中，CTDK-I可能对转录延伸特别重要，因为它通过RNA pol II促进有效延伸在体外(Lee和Greenleaf，1997年)、和ctk1型突变与编码已知伸长因子基因突变的遗传相互作用(Jona等人，2001年;Lindstrom和Hartzog，2001年). Fcp1是酵母中唯一已知的CTD磷酸酶，与一般起始和延伸因子TFIIF相互作用(Archambault等人，1997年)，具有独立于磷酸酶活性的正伸长功能(Cho等人，1999年). 此外，在最近的一项研究中，发现Fcp1和Ctk1定位于转录基因的编码区，并影响与RNA pol II延长相关的CTD磷酸化状态(Cho等人，2001年).

为了阐明Rtf1在转录中的功能，我们对Rtf1及其相关蛋白进行了亲和纯化。对这些蛋白质的鉴定表明，Rtf1和Leo1（一种鲜为人知的蛋白质）与Paf1复合物密切相关。Paf1复合物最初是通过其与RNA pol II的物理联系鉴定的(Wade等人，1996年); 然而，这种复合物在转录中的功能尚不清楚。连同我们之前的研究RTF1级(Costa和Arndt，2000年)，我们目前的研究结果表明，Paf1复合物在转录延伸中发挥作用。我们的观察结果有力地支持了这一假设，即RNA pol II、Spt5和Spt16–Pob3与Paf1复合物特异性共纯化，Paf1复合物中的缺陷导致对6AU的敏感性和对聚氨酯5Paf1复合物的成员与SPT4标准，SPT5标准和SPT16标准总之，我们的研究结果表明，Paf1复合物与一组Spt蛋白协同调节转录延伸。

结果

Rtf1和Leo1是Paf1复合体的成员

为了鉴定与Rtf1相关的蛋白质，我们使用了串联亲和纯化（TAP）方法。TAP融合盒编码钙调蛋白结合肽、TEV蛋白酶的裂解识别位点以及金黄色葡萄球菌蛋白质A(Rigaut等人，1999年). 这种三分标签允许在自然条件下通过两步亲和层析程序纯化蛋白质复合物（参见材料和方法）。使用带有功能性RTF1级–TAP标签融合基因，我们亲和纯化了与Rtf1–TAP相对应的～97 kDa蛋白（图1). 当平行处理表达未标记Rtf1的对照菌株时，在最后的柱洗脱液中未观察到Rtf1。重要的是，银染色显示了几种与Rtf1–TAP共同纯化的多肽（图1A） ●●●●。

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图1。Rtf1–TAP与Paf1、Cdc73、Ctr9、Leo1、Spt5和Rpb1共同净化。按照材料和方法中的描述，对表达未标记和TAP标记形式的Rtf1的酵母菌株进行平行处理。(一个)从～150 mg蛋白质提取物中提取的纯化蛋白质银染色凝胶。根据并行进行的免疫印迹分析，识别Rtf1、Paf1和Cdc73条带。没有对Ctr9和Leo1（预测质量分别为~125和54kDa）进行类似的分配，因为这些蛋白质的抗体不可用，也因为我们的质谱分析没有切除单个条带。(B类)纯化蛋白的免疫印迹，用针对Rtf1、Paf1、Cdc73和Spt5的抗血清显示。用单克隆抗体8WG16探针检测Rpb1。

我们对Rtf1–TAP制剂进行了质谱分析，以确定与Rtf1共同纯化的蛋白质（参见材料和方法）。该技术可重复鉴定四种Rtf1相关蛋白，Paf1、Cdc73、Ctr9和Leo1（表我). 在银染凝胶上观察到这些蛋白质中每一种具有预期活动性的条带（图1A） 免疫印迹分析证实了Paf1和Cdc73与Rtf1的共纯化（图1B） ●●●●。

表一。

Rtf1–TAP纯化蛋白的质谱分析
蛋白质名称确定的肽数量
 实验1一实验2一实验3
Rtf1型4513
第1页1三1
抄送7324 
密码9222
狮子座1442

一实验1和实验2还鉴定了核糖体亚单位和翻译延伸因子Tef1/2。在实验3中，通过超速离心步骤去除这些丰富的蛋白质（参见材料和方法）。

其中一些Rtf1相关蛋白之前已经被研究过。值得注意的是，Jaehning及其同事部分纯化了一种新型RNA pol II相关蛋白复合物，该复合物含有Paf1和Cdc73(施等., 1996，1997;张等., 1999)、和科赫等. (1999)鉴定出一种包含Paf1、Cdc73和Ctr9的～670 kDa蛋白复合物。与其他Rtf1相互作用蛋白相比，对Leo1的了解很少(勒英尺o个读笔架；马格多伦等., 1994). 预测的Leo1蛋白的质量为53.7kDa，含有43.8%的带电氨基酸，在两个酸性结构域中有连续的短链天冬氨酸和谷氨酸残基。编码这五种蛋白质的基因都不是必需的，尽管它们都有潜在的后生动物序列同源物(科赫等., 1999; 数据未显示）。

我们使用其中几个蛋白质的功能性表位标记衍生物，并对其进行免疫沉淀，以确定Rtf1和Leo1是否为Paf1复合物的成员。与结合抗原共沉淀的蛋白质通过在1 M KCl（IP洗脱）中孵育从珠中洗脱，通过SDS-PAGE分离并通过免疫印迹分析。在某些情况下，通过在加载缓冲液（珠）中煮沸，从珠中释放结合抗原和其他紧密相关的蛋白质，然后如上所述进行分析。如图所示2A、 Rtf1与Leo1和Paf1的HA1表位标记衍生物共同免疫沉淀，并且无法从未标记的对照提取物中沉淀（模拟）。此外，Leo1-HA1和Rtf1与Myc标记的Ctr9衍生物共沉淀（图2B和C）。如前所述，Ctr9水平在paf1Δ突变体(Koch等人，1999年; 图2C） 。我们还发现，Rtf1和Leo1水平在paf1Δ突变体（图2A和C）。这表明这些蛋白质只有在与Paf1组装成复合物时才稳定。当我们在Superose 6色谱柱上对分馏酵母提取物进行分级时，我们观察到Rtf1、Leo1和Paf1在～670 kDa处共同洗脱，与之前观察到的Paf1、Ctr9和Cdc73类似（图2D类；Koch等人，1999年). 因此，我们得出结论，Rtf1和Leo1相互关联，并与Paf1、Ctr9和Cdc73关联。

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图2。Rtf1和Leo1是Paf1复合体的成员。(一个)Rtf1与Leo1-HA1和HA1-Paf1共同免疫沉淀。从缺乏HA1标记蛋白（模拟，GHY1102）的菌株（含有HA1标记的Paf1（GHY1147）或Leo1（GHY1141））的提取物和LEO1-HA1 paf1Δ应变（GHY1146）。用HA1抗体结合珠沉淀的蛋白质用1 M KCl洗脱（洗脱）并用SDS-PAGE分离。在1M KCl洗脱后仍与珠结合的蛋白质通过在样品缓冲液（珠）中沸腾而释放。用免疫印迹法观察HA1标记蛋白和Rtf1。(B类)Leo1-HA1与Ctr9-Myc共免疫沉淀。对Leo1-HA1（模拟，GHY1092）和Ctr9-Myc Leo1-HA1菌株（GHY1184）的提取物进行免疫沉淀。(C类)Rtf1与Ctr9-Myc共免疫沉淀。对缺乏myc标签的菌株（模拟，GHY1002）、Ctr9-myc菌株（GHY1184）和paf1ΔCtr9-Myc菌株（GHY1222）。(D类)Paf1、Leo1和Rtf1在凝胶过滤柱上进行共分馏。在Superose 6柱上分离来自Leo1-HA1菌株（GHY1140）和HA1-Paf1菌株（GHK1147）的全细胞提取物，并通过免疫印迹分析洗脱液中的指示组分。每个实验至少进行两次，每个蛋白质的峰洗脱可重复地出现在级分10中。

因为之前报道的RNA pol II和Paf1复合物之间的关联(施等., 1996，1997;张等., 1999)，我们用识别RNA pol II最大亚单位Rpb1的抗体探测了TAP纯化的Rtf1的免疫印迹，发现一部分细胞聚合酶也与Rtf1–TAP共同纯化（图1B） ●●●●。然而，通过免疫印迹或银染观察与Rpb1（预测质量为～190 kDa）和Paf1复合物成员相对应的蛋白带的相对强度（图1)，表明RNA pol II仅与细胞中Paf1复合物的一个子集相关。或者，RNA pol II和Paf1复合物之间的相互作用在我们的分离条件下可能不稳定。

Rtf1和Leo1对Paf1复合函数很重要

Rtf1和Leo1是Paf1复合体的成员，这一发现表明它们可能对其功能有贡献。如果是这样，我们希望狮子座1和rtf1与之共享表型的突变菌株paf1，cdc73型和ctr9键突变菌株。缺失突变RTF1级或低地球轨道1与观察到的中度生长缺陷相比，仅导致轻度生长缺陷cdc73Δ细胞和观察到的强烈生长缺陷paf1Δ和ctr9键Δ应变(Shi等人，1996年，1997;Koch等人，1999年; 数据未显示）。然而，这五个基因的突变确实赋予了几种常见的表型。例如，我们之前发现rtf1无效突变赋予Spt–表型(Stolinski等人，1997年). 因此，我们分析了paf1，cdc73，ctr9键和狮子座1无效突变，并发现它们也能导致Spt–不同强度的表型（图三A） ●●●●。我们还观察到这些菌株中具有转录缺陷特征的其他几种突变表型。这个paf1Δ和ctr9Δ突变表现出强烈的Ino–表型，以及leo1Δ和rtf1Δ菌株为弱肌醇营养不良菌（数据未显示）。最后，类似于rtf1Δ突变，paf1，cdc73，ctr9键和狮子座1缺失突变显示与fcp1型和ctk1型突变，包括致命性（表二). 因此，正如对有助于共同功能的基因所预期的那样，这五个基因中任何一个的突变都会导致一组重叠的突变表型。

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图3。Paf1复合物成员共享的突变表型。(一个)具有指定基因型且含有his4-912δ和lys2-128δ插入物生长在YPD培养基上，复制到补充有组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、尿嘧啶和色氨酸（完全）以及SC-his和SC-lys培养板的最小培养基，并在30°C下培养3天。菌株：WT，FY118；rtf1Δ，KY522；paf1Δ，GHY917；cdc73Δ，1083加纳；leo1ΔGHY240；ctr9Δ，1157加纳。(B类)在YPD培养基上培养具有指定基因型的菌株，然后将其复制到缺乏或含有50µg/ml 6AU的SC-ura培养基上。在30°C下生长2天和4天后拍摄照片。菌株：野生型，KY286；rtf1Δ，425缅元；paf1Δ，KY686；cdc73Δ，KY689；leo1Δ，KY690；ctr9Δ，KY695。

表二：。

之间的遗传相互作用CTK1型，飞行控制面板1和Paf1综合体的成员
基因型合成表型一
rtf1Δctk1-217死去的
rtf1Δfcp1-110微菌落
paf1Δctk1-217死去的
paf1Δfcp1-110死亡或微菌落
cdc73Δctk1-217缓慢增长，Ts–，Cs–对0.3 M LiCl和1.4 M NaCl极为敏感
cdc73Δfcp1-110生长缓慢，咖啡馆S公司，T秒–，Ino–
leo1Δctk1-217缓慢增长，Cs–，对1.4 M NaCl极为敏感
leo1Δfcp1-110Ino公司–，对1.4 M NaCl极为敏感
ctr9Δctk1-217生长非常缓慢，Ts–
ctr9Δfcp1-110生长非常缓慢，Cs–，匈牙利S公司，加仑–

一T型–37°C下生长的温度敏感性；铯–，在15°C下生长的冷敏感性；咖啡馆S公司，不能在含有15 mM咖啡因的培养基上生长；Ino公司–肌醇营养不良；匈牙利S公司，对100 mM羟基脲的敏感性；女孩–无法将半乳糖作为唯一碳源。这个rtf1Δ结果以前在Costa和Arndt（2000）为了完整起见，这里给出了和。

如果Paf1复合物的功能需要Rtf1和Leo1，那么rtf1Δ或leo1Δ其他Paf1复合基因的缺失可能不会导致任何新的突变表型。与这一假设一致，当rtf1Δ或leo1Δ突变与缺失突变相结合PAF1型，CDC73型或CTR9号机组（未显示数据）。然而rtf1Δleo1Δ双突变体确实表现出较强的Ino–表型，以及rtf1Δcdc73Δ双突变体显示Spt增强–表型与lys2-128δ插入等位基因（数据未显示）。重要的是，观察到没有双突变体表现出严重的合成表型，这与Rtf1和Leo1作为Paf1复合物的成员发挥作用的假设一致，并且一旦该复合物的一个成员被删除，其他复合物成员的缺失不会导致功能的额外下降。通过对涉及paf1Δ，cdc73Δ和ctr9Δ(Shi等人，1997年;Koch等人，1999年). 总之，上述遗传和生物化学数据与Rtf1和Leo1均与Paf1复合物的正常功能相关，并且是Paf1复合体正常功能所必需的想法最为一致。

除了上述表型外，我们还观察到，类似于RTF1级(Costa和Arndt，2000年)，删除个PAF1型，CDC73型，CTR9号机组和低地球轨道1所有这些都会对6AU产生不同程度的敏感度paf1Δ和ctr9Δ表现出最严重表型的菌株（图三B） ●●●●。对6AU的敏感性通常但并不总是指示转录延伸缺陷(Wind和Reines，2000年). Reines及其同事证明了这一点聚氨酯5编码肌苷一磷酸脱氢酶，是酵母细胞暴露于6AU后转录诱导的(Shaw和Reines，2000年). 引起转录延伸缺陷和6AU敏感性的突变也阻止了聚氨酯5转录对6AU处理的反应。相反，引起6AU敏感性但不影响转录延伸的突变不会干扰聚氨酯5归纳。因此，6AU敏感表型加上不能诱导聚氨酯5对6AU的反应提示转录延伸缺陷。因此，我们从野生型中分离出RNA，rtf1Δ和paf1Δ6AU治疗前后的细胞，并对聚氨酯5mRNA水平（图4). 该分析表明PAF1型或RTF1级显著减少聚氨酯5因此，提示Paf1复合物可能在转录延伸中发挥作用。

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图4。 rtf1Δ和paf1Δ应变有缺陷聚氨酯5归纳。北方分析聚氨酯5对野生型（KY589）制备的总RNA样本进行转录，rtf1Δ（KY453）和paf1Δ（KY687）细胞。菌株生长至～1×107SC-ura培养基中的细胞/ml，然后分裂。将6AU添加到培养物的一半，最终浓度为75µg/ml，两种培养物在30°C下生长指定时间（小时），然后再分离RNA。每条通道含有10微克总RNA聚氨酯5mRNA被剥离并探测轿车1mRNA作为负荷控制。

Paf1复合物与转录延伸因子Spt5和Spt16–Pob3相互作用

以前，我们试图通过选择对感冒敏感的基因抑制因子来鉴定与转录延伸因子Spt5相互作用的蛋白质标准贯入试验5突变(Hartzog等人，1998年). 在我们的初步分析中，我们分离了RPB1型，编码RNA pol II的最大亚单位。我们已经从这个选择中确定了另外两个抑制物，PAF1型和低地球轨道1（图5，参见材料和方法）。这个paf1和狮子座1抑制突变是隐性的PAF1型和低地球轨道1也抑制spt5C类–突变（表三). 我们进行遗传杂交以获得spt5C型–编码Paf1复合物其他成员的基因的等位基因为空。如表所示三，一个ctr9键突变能够被抑制spt5C类–，但是rtf1和cdc73型突变没有。我们通过携带以下任一种病毒的杂交菌株扩展了这一分析标准普尔5-194，不同的等位基因标准贯入试验5，或一个标准贯入试验4Paf1复合物成员缺陷菌株的零突变（表三). 我们在双突变菌株中观察到各种严重的合成生长缺陷，从温度敏感性到不可见性不等。因此，SPT4标准和SPT5标准与编码Paf1复合物的基因表现出广泛的等位基因特异性遗传交互作用，这与表明Paf1复合体在伸长中起作用的模型一致。

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图5。抑制spt5型铯–生长缺陷paf1和狮子座1突变。将具有指定基因型的菌株复制到YPD培养基上，并培养2（30℃）或4（15℃）天。菌株：spt5C类–，GHY92；野生型，FY653；paf1-49 spt5C–，144加纳元；leo1-43 spt5Cs–，141加纳。

表三。

之间的遗传相互作用标准贯入试验和Paf1复合基因一
 spt5C型–标准普尔5-194spt4Δspt16-197型
paf1Δ铯+/–死去的死去的增长非常缓慢
cdc73Δ缓慢增长T型–，增长缓慢死去的ND（无损检测）
ctr9Δ铯+/——死去的死去的增长非常缓慢
leo1Δ铯+T型–死去的无影响
rtf1Δ铯–T型–生长很差，Ts–b个无影响b条

一仅显示合成突变表型。

b条最初描述于Costa和Arndt（2000）.

生长缓慢=在30°C下3天后出现小菌落；生长极差=在30°C下5天后出现小菌落；T型–=37°C时无生长；铯–，Cs+/–，Cs+=否，15°C时接近正常和野生型生长。ND=未完成。

接下来，我们询问Spt5是否与Paf1复合体有物理联系。我们探测了Rtf1–TAP组分的免疫印迹，观察到Spt5与Rtf1特异性共纯化（图1B） ●●●●。为了确认Spt5与Paf1复合物的相互作用，我们对表位标记的Paf1、Leo1和Ctr9进行了免疫沉淀实验，并检测了Spt5的共沉淀。我们发现Spt5与标记的Paf1衍生物共沉淀（图6A） ，狮子座1（图6A） ，Ctr9（图6B） 和Cdc73（未显示数据）。我们还发现，Spt5与Rtf1特异性共免疫沉淀，与Rtf1-TAP亲和纯化结果一致（图6C） 。相反，TBP没有与Rtf1共沉淀，提供了额外的证据证明Rtf1–Spt5相互作用是特定的（图6C） 。最后，通过与Ctr9共同免疫沉淀检测到的Spt5和Paf1复合物之间的相互作用在没有Paf1的情况下被消除（图6B） ●●●●。因此，Paf1复合物在物理和遗传上与Spt5相互作用。

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图6。转录延伸因子与Paf1复合物相关。(一个)Spt5、Spt16和Pob3与HA1-Paf1和Leo1-HA1共同免疫沉淀。从缺乏HA1表位标签的菌株（模拟，GHY1102）、含有Leo1-HA1（GHY1184）、HA1-Paf1（GHY1147）的菌株和paf1ΔLeo1-HA1菌株（GHY1146）。如图所示，通过免疫印迹法分析免疫沉淀物中的Spt5、Spt16和Pob3。(B类)Spt5与Ctr9共免疫沉淀。对缺乏Myc标签的菌株（模拟，GHY1002）、Ctr9-Myc菌株（GHY1184）和paf1ΔCtr9-Myc菌株（GHY1222）。结合蛋白通过1 M盐洗脱（洗脱）从抗Myc微球中洗脱，然后通过在样品缓冲液（微球）中煮沸小球。如图所示，通过免疫印迹法分析免疫沉淀物中的Spt5和Ctr9，以及抗Myc抗体。(C类)从酵母菌株FY1639制备全细胞提取物，用于Rtf1的免疫沉淀。用抗Spt5、抗Rtf1和抗TBP抗血清检测蛋白质印迹。用所示抗体进行免疫印迹分析20µg等分全细胞提取物、7µg未结合蛋白和五分之三的免疫沉淀样品（珠）。(D类)生长缺陷paf1Δ dst1Δ和paf1Δspt16-197双突变体。将具有指定基因型的细胞系列稀释液置于YPD培养基上，并在30°C下培养2天。菌株：野生型，FY653；paf1Δ，GHY917；dst1Δ，GHY285；spt16-197型，GHY1059；paf1Δdst1Δ，GHY1009；paf1Δspt16-197，1228加纳。

在最近一次分离Spt5及其相关蛋白的实验中，我们从酵母提取物中免疫纯化了一种标记有FLAG的Spt5衍生物，发现Spt5与几种蛋白质复合物（D.Lindstrom和G.Hartzog，正在制备中）相互作用。其中之一是由Spt16和Pob3组成的酵母CP/SP复合物(Brewster等人，2001年;福尔摩沙等人，2001年). 此外，我们之前确定了一个三氧化二磷筛选合成致死的突变rtf1Δ(Costa和Arndt，2000年). 因此，我们探测了Spt16和Pob3的Leo1-HA1和HA1-Paf1免疫沉淀物的印迹，发现Spt16–Pob3与Paf1复合物共沉淀（图6A） ●●●●。当我们杂交含有spt16-197型突变为paf1Δ，ctr9Δ和leo1Δ菌株，我们发现spt16狮子座1双突变体，比如spt16 rtf1双突变体(Costa和Arndt，2000年)，没有表现出任何新的突变表型。然而spt16 paf1和spt16控制9双突变体表现出严重的生长缺陷（图6D和表三). 因此，与Spt5一样，Spt16–Pob3复合物与Paf1复合物在生物化学和遗传上相互作用。最后，我们还发现删除DST1型，一般伸长因子TFIIS的基因，当与paf1Δ突变。因此，Paf1复合物显示出对RNA pol II延伸装置的广泛遗传依赖性。

讨论

Paf1复合体新成员的鉴定

通过纯化TAP标记的Rtf1，我们发现它与Leo1（一种非必需的高电荷蛋白质）以及之前已知的Paf1复合物成员Paf1、Cdc73和Ctr9相关。这些蛋白-蛋白相互作用通过联合免疫沉淀得到证实。在包括中等洗涤剂和盐浓度的条件下的凝胶过滤色谱法（图2)证明这些蛋白质被组装成一个或几个大小相似的复合物。正如之前对Ctr9的观察(Koch等人，1999年)，Leo1和Rtf1蛋白水平在paf1Δ突变体（图2)这表明这些蛋白质只有在与Paf1组装成复合物时才是稳定的。与Rtf1是Paf1复合体不可分割的一部分的想法一致，当paf1Δ通过凝胶过滤对提取物进行分级，发现残余的Rtf1蛋白表现为单体蛋白，而不是大蛋白复合物的成员（S.L.Squazzo和G.a.Hartzog，未发表的数据）。双突变分析表明，编码Paf1复合物成员的基因之间缺乏强烈的遗传交互作用（数据未显示；Shi等人，1997年;Koch等人，1999年). 这一观察结果与以下观点一致，即这些蛋白质仅在完整的复合物中发挥作用。因此，尽管我们没有将Paf1复合物纯化为同质性，但这些数据与Paf1复合体由Paf1、Ctr9、Cdc73、Rtf1和Leo1最小组成的模型最为一致。这一结论与最近的两项研究一致，在这两项研究中，通过纯化TAP标记的蛋白质鉴定出了类似的蛋白质复合物(加文等人，2002年;穆勒和杰宁，2002年).

Paf1综合体是否包含其他成员？通过免疫印迹分析，我们证明了Paf1复合物与Spt5、Pob3、Spt16和Rpb1的特异性关联。Rtf1–TAP组分的质谱分析没有观察到这些蛋白质，这表明它们低于我们的检测极限，并且可能以低于Paf1复合物化学计量的量存在。虽然我们之前已经发现，Paf1复合物的所有五个成员都与标记有FLAG的Spt5衍生物共同纯化，但我们无法在该分析中证明特定的Spt5-Paf1复合体相互作用，因为Paf1复合物的成员非特定地保留在反FLAG柱上（G.A.Hartzog、D.L.Lindstrom、J.Yates和N.Muster，未发表的数据）。这一结果可能是由于Rtf1蛋白序列（氨基酸196-202）中存在一个退化版本的FLAG表位。然而，如图所示6当使用除抗FLAG外的抗血清时，Spt5可以与Paf1复合物特异性共免疫沉淀。

尽管之前有报道称Paf1复合物与RNA pol II、Hpr1、Ccr4、TFIIB和TFIIF相关(施等., 1997;张等., 1999)，我们没有通过质谱检测到这些蛋白质。与科赫等. (1999)，我们发现Paf1复合物在凝胶过滤柱上表现为～670kDa复合物。这个质量太小，无法在一个复合物中容纳所有这些蛋白质，除非它有一个不寻常的形状，导致它在凝胶过滤柱中表现异常。此外，凝胶过滤柱中Spt5、Pob3和Spt16的洗脱曲线与Paf1复合物的洗脱轮廓重叠，但不完全相同（S.L.Squazzo、D.L.Lindstrom和G.a.Hartzog，未发表的观察结果）。因此，我们赞成Paf1复合物与这些其他蛋白质短暂或微弱结合的观点。与这些结论一致，Mueller和Jaehning最近发现，在低盐条件下，Paf1复合物分馏为1.7 MDa复合物(穆勒和杰宁，2002年). Paf1复合物与Hpr1、Ccr4、TFIIB或TFIIF的潜在相互作用需要进一步分析。

最近，Paf1复合物的五个成员以及许多其他蛋白质都用蛋白酶体亲和纯化(维玛等., 2000). 我们没有通过质谱法检测到Rtf1–TAP制剂中的蛋白酶体亚单位，也没有试图直接解决Paf1复合物-蛋白酶体相互作用的问题。然而，有趣的是，蛋白酶体的19S亚基与转录延伸有关，并与Spt16在物理和遗传上相互作用(费尔杜斯等., 2001).

Paf1复合亚基不同功能的证据

Paf1复合体的特定成员可能会执行不同或特殊的功能。Paf1复合物成员编码基因的缺失导致轻度生长缺陷(RTF1级和低地球轨道1)，至中等(CDC73型)，至严重(PAF1型和CTR9号机组)在YPD和6AU介质上（图三B类；数据未显示；Shi等人，1996年，1997;Koch等人，1999年). 此外，这五个基因的突变导致可变的Spt–表型（图三A） 以及不同强度的基因与编码伸长因子的基因的相互作用（表二和三). 或者，这些表型和相互作用的强度可能反映了对Paf1复合物其余成员稳定性的不同影响。因此，需要对Paf1复合体的结构和功能进行进一步的遗传分析，以了解其不同的亚基如何对其整体功能做出贡献。

Paf1复合物和转录延伸之间的联系

虽然Paf1复合物与RNA pol II相关（图1D和Shi等人，1996年，1997;Wade等人，1996年;Chang等人，1999年)，其体内功能未知。分析paf1，cdc73和ctr9键突变体对许多不同mRNA的水平显示出多效性效应paf1Δ突变与srb5Δ(Shi等人，1996年，1997;Chang等人，1999年;Koch等人，1999年). 以前，这些数据被解释为表明Paf1–RNA pol II复合物在启动过程中的作用，可能是对特定调控途径作出反应的RNA polⅡ全酶的替代形式(Shi等人，1996年，1997;Wade等人，1996年;Chang等人，1999年). 然而，这些观察结果也可以用Paf1复合物对转录延伸的影响来解释。例如，生物化学实验表明，Srb5促进转录中的一个步骤，可能是CTD磷酸化，这是在激活物介导的全酶募集之后进行的(Lee等人，1999年). 与Srb-meditor中的专业化模型一致(Lee等人，1999年)，我们之前发现rtf1Δ突变导致极端疾病与斯里兰卡5当与其他五个Srb介导基因的突变相结合时，突变但没有严重的合成表型(Costa和Arndt，2000年).

虽然我们还没有研究Paf1复合物在启动过程中的参与，而且我们的数据也不排除这种可能性，但我们已经发现了几条证据表明Paf1复合体在转录延伸中起作用。首先，Paf1复合物中的缺陷导致6AU敏感性降低聚氨酯5感应电动机（图三B和​和4）。4). 其次，我们之前证明了RTF1级以及编码已知伸长因子的基因，包括Spt4–Spt5和TFIIS(Costa和Arndt，2000年). 此外，在筛选合成致死的突变时rtf1突变，我们分离出Pob3、Fcp1和Ctk1基因的突变(Costa和Arndt，2000年). 第三，我们已经证明了Paf1复合基因与SPT4标准，SPT5标准和SPT16标准（表三). 第四，我们恢复了paf1和狮子座1无偏选择一个感冒敏感等位基因的基因抑制因子的突变SPT5标准（图5). 这个spt5C类–等位基因也受到突变和药物治疗的抑制，这些突变和药物治疗会导致RNA pol II延伸缺陷(Hartzog等人，1998年). 最后，我们证明了Paf1复合物与Spt4–Spt5和Spt16–Pob3转录延伸因子的生化相互作用（图6). 在一项补充我们的研究中，还发现Paf1复合物的成员与Spt16–TAP共同纯化(加文等人，2002年). 这些数据提供了强有力的证据，证明Paf1复合物的功能与伸长RNA pol II的功能相关。鉴于Spt4–Spt5和Spt16–Pob3都参与了染色质背景下的转录伸长调节，我们的数据提出了一个有趣的可能性，即Paf1复合物与染色质有功能性相互作用。

RTF1级最初是在基因选择中发现的spt15-122型突变，编码一种具有DNA结合特异性改变的TBP形式(Stolinski等人，1997年). 这些结果之前被解释为Rtf1在转录起始中的作用。然而，导致Spt的机制–表型spt15-122型细胞及其抑制第5-122页rtf1细胞未知。因此，这些观察结果可能反映了rtf1细胞。特别是，启动子对RNA pol II加工能力的特异性影响或通过延长启动上游聚合酶对启动子功能的干扰可以解释这些观察结果。此外，TBP可能影响启动后发生的事件，这一观点已有先例；TBP在将多聚腺苷酸化因子CPSF装载到转录复合物中发挥作用(Dantonel等人，1997年)它与mRNA输出所需的hnRNP蛋白的功能有关(Lei等人，2001年).

在大规模的酵母蛋白质双杂交分析中，Paf1复合物在伸长期间和染色质背景下发挥作用的其他证据包括检测Rtf1和Leo1与Cus1和Hsh49（U2 snRNP的成分）以及Cdc73与Msi1（酵母染色质组装复合物的成分）的相互作用(Ito等人，2001年). 此外，我们最近发现标准贯入试验4和标准贯入试验5突变导致前mRNA剪接缺陷（D.L.Lindstrom和G.A.Hartzog，正在准备中）。因此，未来的研究可能会揭示Paf1复合物与转录延伸甚至前mRNA处理之间更密切的联系。

材料和方法

培养基和遗传方法

用标准方法进行菌株构建和其他遗传操作(Rose等人，1990年). 酵母培养基，包括富（YPD）、微量（SD）、合成完整（SC）和5-氟有机酸（5FOA），如前所述(Rose等人，1990年). 如图图例所示，6AU被添加到SC-Ura介质中。所有FY、GHY和KY酿酒酵母应变（表四、)与S288C同源镀锌2+。这里描述的所有缺失突变都会删除相关基因的整个开放阅读框，因此是真正的空值。

表四。

酿酒酵母菌株
应变基因型
KY286公司垫子一 leu2Δ1
KY425型垫子一 rtf1Δ100:：URA3 his4-912δ lys2-128δura3-52
KY453型垫子αrtf1Δ100:：URA3 his3Δ200 lys2-173R2 leu2Δ1 URA3-52 trp1Δ63
KY522公司垫子一 his4-912δlys2-128δleu2Δ1 ura3-52 trp1Δ63 rtf1Δ101:：leu2
KY589（肯尼亚先令）垫子αleu2Δ1 trp1Δ63
KY686（肯尼亚）垫子一 paf1Δ：URA3 URA3（Δ0或–52）lys2-128δ
KY687型垫子αpaf1Δ：：URA3 URA3（Δ0或–52）leu2（ΔO或1）lys2-173R2
KY689（肯尼亚）垫子αcdc73Δ：：KANMX4 lys2Δ0 leu2Δ0
KY690型垫子一 leo1Δ：：URA3 URA3-52 lys2-128δleu2Δ1
KY695公司垫子αctr9Δ：：KANMX4 lys2-128δleu2Δ1
缅元770垫子一 rtf1Δ101:：LEU2 his4-912δlys2-128δLEU2Δ1 ura3-52 trp1Δ63【pKA61】
KY771公司垫子一 rtf1Δ101:：LEU2 his4-912δlys2-128δLEU2Δ1 ura3-52 trp1Δ63[第59页]
92加纳元垫子αhis4-912δ lys2-128δleu2Δ1 ura3-52 spt5-242一
126加纳垫子一 his4-912δlys2-128δleu2Δ1 ura3-52 paf1-49
127加纳垫子一 his4-912δlys2-128δleu2Δ1 ura3-52 spt5-242一 leo1-43型
141加纳垫子一 his4-912δlys2-128δleu2Δ1 ura3-52 spt5-242一 狮子座1-43
144加纳垫子αhis4-912δlys2-128δleu2Δ1 ura3-52 spt5-242一 第1-49页
240加纳元垫子一 his4-912δlys2-128δura3-52 leu2Δ1 leo1Δ：：ura3
285加纳垫子αhis4-912δlys2-128δura3-52 leu2Δ1 dst1Δ：：HISG-ura3
622加纳元垫子αhisΔ200 lys2-128Δura3Δ0
917加纳垫子αhis4-912δlys2-128δleu2（Δ0或1）ura3（ΔO或52）paf1Δ：：ura3
2002年1月垫子αhis3Δ200 lys2-128δura3（Δ0或52）3×HA-PAF1 SPT5-FLAG
1009加纳垫子一 his4-912δlys2-128δleu2（Δ0或1）ura3（ΔO或52）paf1Δ：：leu2 dst1Δ:：HISG-ura3
1059加纳垫子一 his3Δ200 lys2-128Δleu2Δ1 spt16-197
1083加纳垫子一 his4-912δ lys2-128δleu2（Δ0或1）ura3（ΔO或-52）cdc73Δ：：KANMX4
吉1092垫子一 his3Δ200 lys2-128Δleu2Δ1 trp1Δ63 ura3-52 LEO1-3×HA:：his3
1102加纳垫子αhis4-912δlys2-128δleu2Δ1 ura3-52 trp1Δ63 SPT5-FLAG SPT24-13×MYC:：trp1
1140加纳垫子一 his3Δ200一 lys2-128δ leu2Δ1 ura3-52 trp1Δ63 LEO1-3×HA-HIS3 SPT24-13×MYC:：KANMX4
1141加纳垫子一 his4-912δlys2-128δleu2Δ1 trp1Δ63 LEO1-3×HA:：HIS3 SPT24-13×MYC:：KANMX4 SPT5-FLAG
1146加纳垫子一 his4-912δlys2-128δleu2（Δ0或1）ura3Δ0 trp1Δ63 paf1Δ：：leu2 SPT5-FLAG SPT24-13×MYC:：KANMX4 LEO1-3×HA:：HIS3
GHY1147型垫子一 his4-912δlys2-128δura3Δ0 SPT5-FLAG 3×HA-PAF1 SPT24-13×MYC:：KANMX4
1157加纳垫子αhis4-912δlys2-128δleu2Δ1 ctr9Δ：：KANMX4
1184加纳垫子αhis4-912δlys2-128δleu2（Δ0或1）ura3Δ0 CTR9-6×MYC:：leu2 LEO1-3×HA:：HIS3 SPT5-FLAG
1222加纳垫子一 his3Δ200b条 his4-912δlys2-128δleu2（Δ0或1）ura3（ΔO或52）trp1Δ63 paf1Δ：：HIS3 3×HA-CDC73:：ura3 CTR9-6×MYC:：leu2 SPT5-FLAG
1228加纳垫子αhis3Δ200 lys2-128Δleu2（Δ0或1）ura3（ΔO或52）spt16-197 paf1Δ：：ura3
118财年垫子一 his4-912δlys2-128δleu2Δ1 trp1Δ63 ura3-52
602财年垫子一 his3Δ200 lys2-128Δleu2Δ1 trp1Δ63 ura3-52
653财年垫子αhis4-912δlys2-128δleu2Δ1 ura3-52
1639财年垫子一 HA1-SPT4 HA1-SPT1 SPT5-MYC his4-912δlys2-128δleu2Δ1 ura3-52 trp1Δ63

一称为spt5C类–在文本中。

b条菌株可能携带这种突变。

spt5Cs抑制剂的克隆–

由感冒引起的生长缺陷的基因抑制因子的分离spt5C型–突变，spt5-242型，已在前面描述过(Hartzog等人，1998年). 隐性突变被分配给五个互补组，这些分配通过连锁分析得到证实。就像rpb1号机组抑制器spt5C类–(Hartzog等人，1998年)，其他两个互补组的抑制基因突变导致轻度Spt–phenotypes in anSPT5型+背景。利用酵母基因组DNA文库中的质粒DNA转化菌株GHY126和GHY127，克隆了与这两个互补组相对应的基因(Rose等人，1987年;Yoshihisa和Anraku，1989年)和筛查Spt+转化者。从转化子中分离出候选质粒，并将其重传给酵母菌株，以确认它们可以补充突变体的原始抑制表型。亚克隆表明PAF1型和低地球轨道1仅能补充各自的抑制突变。PAF1型最初从高拷贝质粒库中克隆，也被亚克隆到着丝粒载体。这个欧洲标准化委员会PAF1质粒还补充了GHY126菌株的抑制突变。连锁分析证实PAF1型和低地球轨道1与最初的抑制突变具有等位性。

表位标记

质粒pPC59，a欧洲标准化委员会URA3-携带乳克鲁维酵母TRP1基因和表达Rtf1的基因在其C末端用TAP标记，构建如下。使用扩展高保真PCR系统（Roche），通过质粒pBS1479的扩增产生PCR片段(Rigaut等人，1999年). 该PCR产物用于转化含有pKA61的KY770(CEN URA3 RTF1;Stolinski等人，1997年)，至Trp+原营养，通过同源重组产生pPC59（菌株KY771）。Rtf1–从pPC59表达的TAP在Spt互补的基础上具有完全的功能–一种表型rtf1Δ突变体。

如前所述，在Ctr9的C端用六个Myc表位拷贝进行标记，在Cdc73的N端用三个HA1表位拷贝标记(Koch等人，1999年). 与这里描述的其他表达表位标记蛋白的基因相比，HA1-CDC73型于集成URA3公司而不是它的正常染色体位点。通过pMPY-3×HA的PCR扩增，建立了一株表达Paf1的菌株，在其N末端标记了3×HA1(Schneider等人，1996年)，以及将PCR产物转化为菌株GHY622。乌拉+将转化子纯化并重新接种到5FOA培养基中，以选择丢失URA3公司基因并保留三×HA1型标签位于PAF1型用PCR扩增质粒pFA6a-3HA-HIS3MX6构建了一株表达Leo1的3×HA1标记菌株(Longtine等人，1998年)将产品转化为FY602菌株并选择His+转化者。

协同免疫沉淀实验和凝胶过滤

使用2 mg蛋白提取物进行抗-Rtf1免疫沉淀，该蛋白提取物是通过打球制备的，基本上如前所述(哈特佐格等., 1998)但免疫沉淀物在含有0.2 M醋酸铵和0.1 M醋酸钠的缓冲液中洗涤，而不是在含有0.5 M醋酸铵和和0.1 M乙酸钠的缓冲溶液中洗涤。如前所述，使用通过用研杵和研钵研磨对数相细胞的冷冻细胞颗粒制备的提取物进行所有其他免疫沉淀(Lindstrom和Hartzog，2001年). 在一些实验中，免疫沉淀后，在50 mM HEPES-KOH pH 7.6、1 M氯化钾、1 mM氯化镁、1 mM-EGTA和10%甘油中从珠中洗脱抗原相关蛋白。洗脱的蛋白质用三氯乙酸（TCA）沉淀浓缩，用SDS-PAGE分离并进行免疫印迹。在其他实验中，通过在SDS–PAGE加载缓冲液中煮沸珠子释放与珠子相关的蛋白质。

在裂解缓冲液中平衡的Superose 6柱（Pharmacia）上进行凝胶过滤色谱（30 mM HEPES-KOH pH 7.4，200 mM醋酸钾，1 mM醋酸镁，1 mM-EGTA，0.05%吐温-20，10%甘油）。对于全细胞提取物，将～5 mg清除的裂解液注入色谱柱，并收集0.5 ml组分。用TCA沉淀每个组分的样品（250µl），用SDS–PAGE分离，并转移到硝化纤维素中进行免疫印迹。

串联亲和纯化（TAP）标签实验

菌株KY770(RTF1级)和KY771(RTF1级–TAP）在SC-Ura培养基中生长至～3.5×107细胞/ml。收集细胞并在含有100 mM醋酸钾、2 mM醋酸镁、20 mM HEPES-KOH pH 7.4、1 mM EDTA、10%甘油、1 mM-二硫苏糖醇（DTT）、0.1%NP-40加蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中洗涤。细胞颗粒在液氮中冷冻。细胞重新悬浮在等体积的裂解缓冲液中，并通过打浆进行裂解。在SA600转子中以5000转/分的转速在4°C下离心5分钟。将上清液转移到干净的试管中，并在4°C下以10 000转/分的速度离心10分钟。在实验3中，通过在150 000下离心来澄清从该步骤中获得的上清液克在4°C下放置1小时，以去除大蛋白聚集体和复合物，包括核糖体。

将提取物调节为50 mM醋酸钠和10 mM三醋酸钠，pH值为7.5，并将约40–50 mg蛋白质提取物（来自约3 l细胞）与400µl IgG–Sepharose珠（Amersham Pharmacia）在4°C下混合2 h。为了处理9 l细胞的提取物，平行运行三个色谱柱。TAP纯化中的后续步骤基本上如所述Rigaut等人（1999年）除了所有缓冲液都含有乙酸盐而不是氯离子。用2.4 ml IPP150钙调素洗脱缓冲液从钙调素亲和树脂中洗脱最终Rtf1–TAP部分(Rigaut等人，1999年)含0.01%NP-40。用TCA沉淀TAP络合物，并将其重新悬浮在100 mM碳酸氢铵（5%乙腈）中。纯化的蛋白质被还原并用DTT和碘乙酰胺烷基化，然后用改良的序列级胰蛋白酶（Promega）消化。将肽混合物加载到在0.5%乙酸中平衡的75µm ID RP-HPLC柱（Poros R2，Perceptive Biosystems）上。使用0–40%乙腈的线性梯度在60分钟内洗脱肽，然后在10分钟内以0.3µl/min的流速洗脱40–60%。使用离子阱质谱仪（LCQ Deca，ThermoFinnigan；Gatlin等人，1998年). 根据面包酵母使用SEQUEST算法的开放阅读框架数据库（斯坦福大学SGD）(Eng等人，1994年). 描述了将SEQUEST输出文件数据处理为TAP复合体中存在的蛋白质列表(Link等人，1999年).

抗体和免疫印迹

采用标准方法进行免疫印迹(哈洛和莱恩，1988年). 抗-Spt5、-TBP和-Rpb1（8WG16）抗体已在前面描述过(汤普森等., 1989;Buratowski和Zhou，1992年;哈特佐格等., 1998). 兔抗HA1抗体的制备如下所述(莫特森等2002年). 抗Myc抗体9E10购自Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）。抗Paf1和抗Cdc73抗体是朱迪思·杰宁赠送的(施等., 1996，1997). 抗Pob3和抗Spt16抗体是Tim Formosa赠送的(维特迈尔等., 1999). 抗Rtf1抗体是用含有Rtf1前261个氨基酸的GST融合蛋白免疫兔子制成的，由Cocalico Biological，Inc.（Reamstown，PA）制备。该抗体分别以1:4000和1:3000的稀释液用于免疫印迹和免疫沉淀。

Northern分析

细胞生长如图例至图所示4如前所述，采集细胞，分离RNA并进行northern分析(Swanson等人，1991年). 杂交探针是通过随机引物标记PCR产生的含有聚氨酯5和SED1级用于PCR的寡核苷酸如下所述Shaw和Reines（2000）.

致谢

我们感谢贝特朗·塞拉金和克里斯蒂安·科赫赠送质粒，感谢蒂姆·福尔摩沙、朱迪思·杰宁和史蒂夫·伯拉图夫斯基赠送抗体，感谢切丽·穆勒和朱迪思·杰宁在出版前通报结果。我们感谢Greg Prelich以及Hartzog和Arndt实验室的成员对手稿的宝贵意见。这项工作得到了梅隆基金会（Mellon Foundation）为P.J.C.提供的10月前奖学金以及国家卫生研究院（National Institutes of Health）为K.M.a.（GM52593和AI01816）和G.a.H.（GM60479）提供的资助。A.J.L.得到了范德比尔特-英格拉姆癌症支持基金（5P30CA68485-05）、HHMI和英格拉姆家族礼物的支持。

证据中添加的注释

最近我们注意到，HA1标记了CDC73型文本中描述的基因（株GHY1222）无意中整合在正常CDC73型轨迹而不是在URA3公司基因。这种HA1标记的等位基因CDC73型是功能性的，并且该发现不会影响此处报告的实验结果或结论。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团