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前神经科学。2018; 12: 86.
2018年2月20日在线发布。 数字对象标识：10.3389/fnins.2018.00086
预防性维修识别码：项目编号5826239
PMID：29515358

ALS iPSC-Derived运动神经元蛋白质聚集和热休克反应的模型

Emily R.神学院,萨曼莎·西森、和艾利森·艾伯特*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种破坏性的神经退行性疾病，由上下运动神经元选择性丧失引起。在所有病例中，只有10%是由24个不同的已鉴定基因中的一个突变引起的，而其余90%可能是由尚未确定的遗传和环境因素共同引起的。中的突变C9或72，SOD1，或TDP-43型是家族性肌萎缩侧索硬化症最常见的病因，共同导致了至少60%的此类病例。值得注意的是，尽管存在很大程度的异质性，但所有ALS患者的大脑和脊髓中都有对SOD1、TDP-43、OPTN和/或p62呈免疫阳性的蛋白质聚集体。这些内含物通常被热休克蛋白（Hsps）阻止和清除，这表明ALS运动神经元诱导热休克反应（HSR）的能力受损。因此，有证据表明，与未受影响的对照组相比，ALS小鼠模型和人类尸检样品中Hsps的诱导减少。然而，Hsps在人类运动神经元蛋白质积累中的作用尚未完全阐明。在这里，我们从携带突变的人类诱导多能干细胞（iPSC）系中培养出运动神经元SOD1、TDP-43，或C9或72在本研究中，我们提供证据表明，尽管缺乏明显的运动神经元丢失，但在iPSC衍生的运动神经元培养物中积累了不溶性、聚集性蛋白质，但其含量和水平因遗传背景而异。此外，尽管iPSC-derived运动神经元在暴露于热应激时通常能够诱导HSR，但蛋白质聚集本身不足以诱导HSR或应激颗粒的形成。因此，我们得出结论，ALS iPSC-derived运动神经元重述了该疾病的关键早期病理特征，并且不能内源性上调HSR以应对蛋白质负荷增加。

关键词：C9orf72、SOD1、OPTN、TDP-43、HspB8、HspB1、BAG3、应激颗粒

介绍

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种由上下运动神经元丧失引起的致命的、成年发病的神经退行性疾病。大约90%的病例是散发的（sALS），可能是由尚未确定的遗传和环境因素共同引起的。剩下的病例，家族性ALS（fALS），是由迄今为止与ALS相关的20多种不同基因中的一种突变引起的（Zufiria等人。，2016). 其中C9或72，SOD1，或TDP-43型是最常见的，共同负责至少60%的fALS（Zufiria等人。，2016). 然而，已鉴定的基因具有多种功能，加上sALS固有的异质性，使得确定该疾病的聚合机制具有挑战性。

尽管存在这一困难，但所有ALS病例之间仍有一些相似之处，包括大脑或脊髓中存在蛋白质聚集体（Mizuno等人。，2006). 这些内含物通常包含一组核心蛋白质，包括SOD1、TDP-43和视神经磷酸酶（OPTN）等。鉴于蛋白质聚集体的已知毒性作用（Boya等人。，2003; De Kimpe等人。，2013; Yu等人。，2014)，试图清除这些聚集物代表了一个可能广泛适用的理想治疗靶点。

热休克蛋白（Hsps）是细胞抵抗蛋白质聚集的天然防御系统。这些伴侣蛋白识别并结合错误折叠的蛋白质，并促进其重折叠或降解。有趣的是，研究表明，在自然衰老和各种神经退行性疾病期间，Hsps下调（Brehme等人。，2014). 据此，据报道，TDP-43连锁的ALS和sALS死后组织小鼠模型中Hsp70、Hsp40和HSF1蛋白水平降低（Chen等人。，2016). 此外，Hsps在ALS疾病状态下的保护性质得到了以下因素的进一步支持在体外和小鼠研究表明，通过上调热休克反应（HSR）可以改善疾病症状（Kieran等人。，2004; Kalmar等人。，2008; Lin等人。，2013,2016). 然而，与这些数据相反，其他人报告ALS患者的血清Hsp70和Hsp90水平升高（Miyazaki等人。，2016). 正如先前的研究表明，HSR的异常和持续激活会降低其整体功能（Roth等人。，2014)重要的是要更好地了解生理条件下人类ALS运动神经元中Hsps的表达水平，以及这些水平在多种遗传背景下是否一致。

以前的报告表明，来自ALS小鼠、死后人类患者和iPSC的运动神经元呈现蛋白质聚集（Mizuno等人。，2006; Mackenzie等人。，2007; Kalmar等人。，2008; Maruyama等人。，2010; DeJesus-Hernandez等人。，2011; Lin等人。，2013; Chen等人。，2016; Dafinca等人。，2016; Bhinge等人。，2017)可能导致运动神经元丢失。由于不溶性蛋白质水平的增加触发了HSR，以降解和/或重新折叠异常蛋白质（Ananthan等人。，1986; 打捆机等。，1992; 森本茂，1998; Westerheide等人。，2012)，我们假设ALS运动神经元具有最小的内源性HSR激活，从而有助于蛋白质聚集的存在。在这里，我们使用了从表达SOD1、C9orf72和TDP-43突变的ALS患者产生的iPSC衍生的运动神经元。与之前的报道一致，ALS iPSC衍生的运动神经元显示出不溶性SOD1、TDP-43和OPTN的积累，但具体含量因不同的遗传背景而异。然而，不溶性蛋白质的存在不足以在ALS iPSC衍生运动神经元中诱导强劲的HSR或增强应激颗粒的形成，尽管热应激通常能够诱导HSR。因此，这些数据表明，ALS iPSC-derived运动神经元无法内源性上调HSR以应对蛋白质积累，这可能会对运动神经元的健康和生存产生不利影响。

材料和方法

iPSC文化

iPSC生长在Matrigel（Corning，cat.354230）涂层的6孔板（VWR，cat.82050-842）上，在mTeSR1（STEMCell Technologies，cat.5850）或Essential 8（Life-Technologies，cat.A1517001）中生长。用Versene（Life Technologies，cat.15040-066）每4-7天分离一次菌落，并使用Mycoalert检测试剂盒（Lonza，cat.LT07-318）定期检测支原体。在通过时，对剩余的井进行了采收，以用于过滤捕集试验。对于这些研究，一个SOD1（N139K）系（Hosoyama等人。，2014)，三条C9orf72线路（Sareen等人。，2013)，一条TDP-43（M337V）管线（Bilican等人。，2012)和三条控制线（Ebert等人。，2009; McGivern等人。，2013; Riedel等人。，2014)使用了。

运动神经元分化

运动神经元是按照Maury及其同事描述的方案生成的，只需稍作修改（Maury等人。，2015). 简单地说，从单层iPSC菌落中生成类胚体（EB）并转移到T25培养瓶中。EB在被分离并镀到Matrigel涂层板上进行RNA和蛋白质分析之前，或镀到Mattrigel涂层玻璃盖玻片上进行免疫细胞化学分析之前，受到各种模式因子的影响2周。运动神经元在被用于进一步实验之前被允许再成熟1-2周。对于热休克实验，用副膜包裹平板，并将其置于42°C的水浴中1小时。立即采集细胞进行RNA和蛋白质分析。

免疫细胞化学

将生长在玻璃盖玻片上的运动神经元在室温下用4%多聚甲醛固定10分钟。将细胞渗透并用0.1%Triton和5%驴血清封闭1 h，然后在4°C或室温下在一级抗体中培养过夜。在室温下添加二级抗体1小时。使用Fluoromount-G（Southern Biotech，cat.0100-01）将染色盖玻片遮盖并安装在玻璃显微镜载玻片上（Fisher，cat.22-230-891）。表中列出了使用的抗体​表11.

表1

抗体。

抗体单位目录编号
兔α-BAG3abcam公司ab47124号
山羊α-ChATMillipore公司AB144P型
小鼠α-G3BPabcam公司约56574
兔α-HSF1磷酸S326abcam公司约76076
小鼠α-HspB1细胞信号2402
兔α-HspB8abcam公司公元151552年
小鼠α-胰岛1双稳态血红蛋白40.2月6日
兔α-Optineurinabcam公司公元151240年
兔α-SOD1abcam公司ab13498型
兔α-TDP-43abcam公司澳大利亚银行109535
鸡肉α-Tuj1GeneTex公司GTX85469型
兔α-Tuj1文斯MRB-435P型

显微镜

图像是在直立的尼康E400显微镜和QCapture相机上拍摄的。光源为Lumen200金属弧光灯（Prior Scientific）。用100倍油物镜拍摄点状染色照片，像素分辨率为0.06μm/px。其他所有照片均采用40倍物镜拍摄，像素分辨率为0.16μm/px。曝光时间因每个靶点而异，但在成像每个分化时保持一致。每个通道的曝光时间范围如下：FITC 700 ms−1 s、TRITC 700 ms−1 s、Cy5 1 s−2 s、DAPI 40–100 ms。

图像分析

在NIS Elements（尼康）中进行量化。对于细胞计数量化，细胞由盲法观察者计数。通过选择感兴趣的区域，确定总强度，然后除以总面积，对HspB1和HspB8染色进行量化。利用对象计数模块自动检测NIS元素中的点状表达。设置强度和大小阈值，并使每个目标保持一致。单个神经元被概括为感兴趣的区域，以量化带有点的神经元数量以及每个神经元的点数量。

定量PCR

用RNeasy Mini Kit（Qiagen，cat.74104）从完全分化4周时收集的细胞颗粒中分离总RNA。根据制造商说明（Promega，cat.A3500），使用2μg RNA生成cDNA。使用20 ng cDNA和Bio-Rad Connect96热循环器，在以下循环条件下，对HspB1、HspB8、BAG3和GAPDH进行qPCR：95°C 10 min，40个95°C循环10 s，60°C 45 s，对HpsB1、HpsB8和GAPDH。BAG3 qPCR在相同的循环条件下进行，但退火温度为55°C。所有信号均按GAPDH标准化，然后与对照组进行比较。引物序列如表所示​表22.

表2

引物序列。

目标序列引用
HSPB1前进AAGCTAGCCACGCATCCAWang等人。，2013
HSPB1反向加拿大政府Wang等人。，2013
HSPB8转发GCCAGAGGAGTTGATGGTAAGACC公司Ospelt等人。，2014
HSPB8反向CATGTTTGCCAGACCTCCACG公司Ospelt等人。，2014
BAG3转发CATCCAGGT GCTGAAAGTG公司Li等人。，2017
BAG3反向TCTGAACCT TCCTGACACCG公司Li等人。，2017
GAPDH转发GTGGACCTGACCTGCCGTCT公司帕蒂图奇和埃伯特，2016
GAPDH倒档GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT公司帕蒂图奇和埃伯特，2016

蛋白质印迹

通过在1x CHAPS缓冲液（细胞信号，cat 9852S）中重新悬浮细胞颗粒，然后进行三次冻融循环，分离蛋白质。通过Bradford分析测定所得裂解液的蛋白质浓度。将20μg蛋白质装入4–15%Mini-PROTEAN®TGX无染色™蛋白质凝胶（Bio-Rad，目录4568083）中，在105 V下运行约70 min，然后在105 V将其转移到PVDF膜（Li-COR，目录926-31099）中30 min。使膜在转移后立即干燥至少1小时，以在进行之前交联蛋白质。进行REVERT总蛋白染色（Li-COR，cat.926-11010），以确认正确转移和相等负荷。用1:1稀释的Odyssey Blocking Buffer（Li-COR，cat.927-50000）和TBS轻轻摇晃，封闭印迹。在相同的1:1稀释液和0.2%吐温-20中稀释一级抗体，并在4°C下轻轻摇晃培养过夜。通过在二级抗体中孵育检测信号，二级抗体在奥德赛阻断缓冲液、TBS、0.2%吐温-20和0.02%十二烷基硫酸钠中稀释，在避光箱中室温下孵育30分钟。用奥德赛扫描仪（Li-COR）对斑点进行成像。所有信号在Image Studio（Li-COR）中进行量化，并根据制造商说明归一化为REVERT总蛋白染色。数据显示为折叠转换控制。代表性图像被转换为图形的灰度。表中列出了使用的所有抗体​表11.

过滤器陷阱分析

40微克蛋白质在1x PBS和10%SDS中稀释，然后在1x PBS+0.1%SDS中进一步稀释。蛋白质被加载到醋酸纤维素膜上（SterliTech，cat。CA023001号)通过点印迹设备，并用1x PBS+0.1%SDS洗涤。立即将膜在5%牛奶中封闭1小时，并在4°C的一级抗体中孵育过夜，轻轻摇晃。WesternBright ECL（Advansta cat.K-12045）在HRP结合二级抗体中孵育1小时后检测到信号。在ImageJ中进行密度测定。代表性图像被转换为图形的灰度。表​表11列出了使用的抗体。

统计分析

每个实验至少进行三个独立实验，至少进行三次生物复制。通过与Tukey进行单向方差分析来分析数据事后的，事后的测试或学生的t吨-测试，视情况而定。重要性是根据第页< 0.05.

结果

来自多种ALS基因型的运动神经元培养没有显示出活力下降

虽然运动神经元丢失是fALS和sALS的主要特征在体外研究表明，iPSC-derived运动神经元在没有星形胶质细胞的情况下生长时，其活力不会降低（Egawa等人。，2012; Almeida等人。，2013; Chen等人。，2014; Devlin等人。，2015). 与之前的报告一致，与培养4周的对照组相比，SOD1、C9orf72或TDP-43培养物中运动神经元的数量没有差异（图​（图1）。1). 培养物中约60%的细胞为Tuj1+神经元，绝大多数神经元（约95%）表达运动神经元标记物Islet1和ChAT（图​（图1）1)星形胶质细胞标志物GFAP的表达可忽略不计（数据未显示；Maury等人。，2015).

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来自多种ALS基因型的iPSC-derived运动神经元在培养中的存活率没有降低。（A）对Tuj1（绿色）、ChAT（红色）和Islet1（白色）的对照组和ALS运动神经元分化3周时的代表性图像进行免疫染色。细胞核用赫斯特核染料（蓝色）标记。比例尺=50μm。（B）量化显示分化3周或4周时运动神经元的数量没有差异。n个= 3–4. Tukey的单向方差分析不显著事后的，事后的测试。

聚集蛋白在ALS运动神经元中的分散溶解度

接下来，我们试图确定ALS iPSC衍生运动神经元培养物是否内源性产生蛋白质聚集体，因为这是ALS病理学的重要表型标志。虽然在ALS小鼠模型中始终观察到蛋白质聚集（Kalmar等人。，2008; Lin等人。，2013; Chen等人。，2016)，iPSC模型中存在可变性（Devlin等人。，2015; Dafinca等人。，2016; Bhinge等人。，2017). 我们首先询问是否可以检测到SOD1聚集体。先前的研究报告了SOD1 iPSC衍生运动神经元中的SOD1+聚集体（Chen等人。，2014; Bhinge等人。，2017)，但TDP-43和C9orf72运动神经元尚未评估。我们发现，虽然SOD1+点状突起的神经元数量在不同线之间没有差异，但C9orf72和TDP-43运动神经元培养物与对照运动神经元相比，每个神经元的点状突触更少（图​（图2A）。2安培). SOD1 iPSC衍生的运动神经元也表现出不溶性SOD1水平增加的趋势（图​（图2C）2摄氏度)与对照组相比，可溶性SOD1蛋白水平呈下降趋势（图​（图2B）。2B型). 有趣的是，C9orf72运动神经元中不溶性SOD1的水平也呈上升趋势（图​（图2C），2摄氏度)尽管这一表型在三个独立的C9orf72 iPSC系中有所不同。这些数据与C9orf72运动神经元每个神经元的SOD1+点较少的结果形成对比，这表明可观察到的点可能与蛋白质不溶性没有直接关系。在所有iPSC菌落中均未检测到不溶性SOD1（图​（图2C），2摄氏度)这表明SOD1聚集随着神经元分化而增加。

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改变SOD1在SOD1和C9orf72运动神经元中的溶解度。（A）分化4周时，Hoechst核染色（蓝色）、SOD1（绿色）和Tuj1（白色）的代表性免疫细胞化学图像显示，与对照组相比，ALS运动神经元中带有SOD1+点状突起的神经元数量没有显著差异（ns，第页>与Tukey单向方差分析0.05事后的，事后的测试）。与对照组相比，C9orf72和TDP-43运动神经元每个神经元的SOD1+点较少(*第页Tukey单向方差分析<0.05事后的，事后的测试）。n个=3，比例尺=10μm（全图像）或2μm（展开）。（B）与对照品系相比，ALS品系的SOD1蛋白印迹无显著差异。将数据归一化为REVERT总蛋白染色，并表示为对照组的倍数变化（ns，第页>与Tukey单向方差分析0.05事后的，事后的测试，n个= 3–6).（C）滤器陷阱分析显示，SOD1和C9orf72运动神经元中的不溶性SOD1水平有增加的趋势，但iPSC集落中的SOD1含量没有增加（ns，第页>与Tukey单向方差分析0.05事后的，事后的测试）。数据表示为控件上的折叠变化。n个= 3.

在评估TDP-43聚集时，我们发现与对照组相比，任何ALS iPSC细胞系中具有胞质TDP-43+点的神经元数量或每个神经元点的数量没有显著差异（图​（图3A），3A级)与之前的报告相比，该报告显示TDP-43 iPSC衍生培养物中包含更多内含物（Egawa等人。，2012). 与对照组相比，所有品系都表现出TDP-43可溶性水平增加的趋势（图​（图3B），3B公司)，这些数据没有达到显著性。然而，与对照组相比，TDP-43运动神经元确实表现出增加不溶性TDP-43的强烈趋势（图​（图3C）。3C公司). 与SOD1蛋白聚集一样，不溶性蛋白的增加在运动神经元培养物中最为明显（图​（图3C3C公司).

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TDP-43运动神经元中TDP-43溶解度的变化。（A）分化4周时的典型图像显示，ALS运动神经元培养物中每个神经元的胞质TDP-43+点的神经元数量或TDP-43+点的数量没有变化（ns，第页>单向方差分析0.05）。n个=3，比例尺=10μm（全图像）或2μm（展开）。（B）TDP-43的蛋白质印迹显示ALS运动神经元培养物中的蛋白质水平没有显著差异。将数据归一化为REVERT总蛋白染色，并表示为对照组的倍数变化（ns，第页>单向方差分析0.05，n个= 3–5).（C）TDP-43的滤器陷阱分析显示TDP-43运动神经元中的不溶性水平有增加的趋势，但iPSC菌落中的不溶解性水平没有增加（ns，第页>与Tukey单向方差分析0.05事后的，事后的测试）。数据表示为控件的折叠变化，n个= 3.

最后，我们询问OPTN是否在ALS iPSC衍生运动神经元中聚集。OPTN是自噬中的一种衔接蛋白，与HSR一起是蛋白质平衡网络的一个组成部分。OPTN在sALS和fALS中都存在聚集体，并且特定突变与小部分fALS病例有关（Maruyama等人。，2010). 然而，尚未对iPSC-derived运动神经元的OPTN病理学进行评估。我们发现SOD1、TDP-43或C9orf72培养物中含有OPTN+内含物的神经元数量与对照组相比没有差异（图​（图4A）。4A级). 此外，每个神经元的OPTN+点的数量在所有行中都是相似的（图​（图4A）。4A级). 然而，尽管可溶性蛋白水平在不同线之间没有变化（图​（图4B），4B类)，与对照培养物相比，SOD1和C9orf72运动神经元培养物中的不溶性水平趋于更高，对照培养物表现出低的不溶性蛋白基础水平（图​（图4C）。4摄氏度). 虽然一个C9orf72 iPSC细胞系在未分化状态下表现出不溶性OPTN增加，但这种表型主要局限于运动神经元（图​（图4C）。4摄氏度). 综上所述，这些数据表明，ALS iPSC衍生的运动神经元表现出聚集蛋白的积累，但遗传背景确实影响蛋白质含量和溶解度。

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OPTN不溶于SOD1和C9orf72运动神经元。（A）分化4周时Hoechst核染色（蓝色）、OPTN（绿色）和Tuj1（白色）的典型免疫细胞化学图像。OPTN+puncta（ns，第页>与Tukey单向方差分析0.05事后的，事后的测试）。n个=3，比例尺=10μm（全图像）或2μm（展开）。（B）经Western blot检测，OPTN的总蛋白水平没有变化。数据归一化为REVERT总蛋白，并表示为对照组的倍数变化（ns，第页>与Tukey单向方差分析0.05事后的，事后的测试）。n个= 3.（C）OPTN过滤陷阱分析显示SOD1和C9orf72运动神经元（ns，第页>与Tukey单向方差分析0.05事后的，事后的测试）。在一个C9orf72 iPSC系的菌落中观察到不溶性OPTN，但在其他系中没有观察到。数据表示为控件的折叠变化，n个= 3.

ALS运动神经元无法完全上调HSR

蛋白质聚集通常由蛋白质质量控制网络阻止，其中包括HSR。因此，之前的研究已经调查了诱导HSR是否会降低SOD1或TDP-43聚集体的毒性（Kieran等人。，2004; Lin等人。，2013,2016; Chen等人。，2016). 然而，其他数据表明HSR的持续激活实际上削弱了蛋白质质量控制网络的功能（Roth等人。，2014). 由于ALS iPSC衍生运动神经元中不溶性蛋白质增加（图​（图22–4)我们接下来的目的是测试这是否是由于HSR激活不足或异常所致。因此，我们检测了ALS iPSC衍生运动神经元培养物中HspB1、HspB8和BAG3的表达水平（图​（图5）。5). 这些伴侣蛋白引起了人们的兴趣，因为之前的数据将它们与SOD1联系起来（Crippa等人。，2010; Mateju等人。，2017)和TDP-43病理学（Crippa等人。，2016; Ganassi等人。，2016)在细胞培养和体内模型。此外，已证明BAG3与HspB1和HspB8复合以促进蛋白质清除（Ganassi等人。，2016; 劳赫等人。，2017). 虽然C9orf72运动神经元中HspB1、HspB8和BAG3的转录水平没有显著改变，但我们发现与对照运动神经元相比，SOD1和TDP-43运动神经元中BAG3转录水平有增加的趋势（图​（图5A）。5A级). 这对应于TDP-43运动神经元中BAG3蛋白水平的适度但显著的增加，以及通过蛋白质印迹检测到的与对照培养物相比SOD1运动神经元中蛋白水平增加的强烈趋势（图​（图5B）。5亿). 通过免疫细胞化学强度定量评估HspB1和HspB8蛋白水平，发现与对照组相比，任何ALS细胞系中的HspB1蛋白水平均无变化，但与对照组比较，仅SOD1运动神经元中的HpsB8蛋白显著增加（图​（图5C）。5摄氏度). 这些数据表明，ALS iPSC衍生的运动神经元并没有内源性激活HSR以应对蛋白质负荷增加。

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ALS运动神经元改变了HspB1、HspB8和BAG3的表达。（A）ALS iPSC衍生运动神经元中BAG3、HspB1和HspB8转录水平没有显著增加，n个= 3–6.（B）BAG3的Western blot显示TDP-43运动神经元增加。数据归一化为REVERT总蛋白，并表示为对照组的倍数变化(*第页通过Bonferroni的单向方差分析，<0.05事后的，事后的测试，n个= 3).（C）HspB1（绿色）和HspB8（红色）免疫细胞化学强度的定量显示，SOD1运动神经元中HspB八的蛋白水平显著增加(*第页Tukey单向方差分析<0.05事后的，事后的测试，n个= 3). 比例尺=50μm。（D）S326磷酸化HSF1的Western blot显示ALS运动神经元中没有明显的HSR诱导。数据归一化为REVERT总蛋白，并表示为对照组的倍数变化（ns，第页>与Tukey单向方差分析0.05事后的，事后的测试）。n个= 3.

考虑到ALS iPSC衍生的运动神经元中HSR的适度和不完全上调，我们假设上游HSR信号也可能被钝化。因此，我们接下来评估了ALS iPSC衍生运动神经元磷酸化HSF1的水平。HSF1已被证明是HSR（桑托罗，2000; Westerheide等人。，2012). HSF1由Hsp70、Hsp90和Hdj1组成性表达，并以其非活性单体形式（Morimoto，1998; Shi等人。，1998). 在应激和蛋白质聚集时，携带HSF1的伴侣被招募到错误折叠蛋白质的位点，释放HSF1（Morimoto，1998; Shi等人。，1998; 桑托罗，2000; Westerheide等人。，2012). HSF1随后可以三体化并转位到细胞核（森本，1998; 桑托罗，2000). 此外，HSF1经历了许多翻译后修饰，包括丝氨酸326的磷酸化，这已被证明是转录活性所必需的（Guettouche等人。，2005). 因此，S326磷酸化形式的表达可用于确定HSR是否被强烈激活。然而，与对照组相比，我们在任何ALS iPSC衍生运动神经元中均未检测到HSF1磷酸化水平的显著增加（图​（图5D），第五天)，与HspB1、HspB8和BAG3的不完全诱导一致。因此，这些数据表明，观察到的不溶性蛋白质负荷增加不足以激活ALS iPSC衍生运动神经元中的HSR。

由于ALS iPSC-衍生运动神经元不会强烈激活HSR以应对蛋白质聚集增加，我们接下来试图确定ALS运动神经元是否能够上调HSR。因此，我们培养ALS并在42°C下控制iPSC-衍生运动神经元1小时，以对细胞进行热应激。除HspB8外，控制运动神经元表现出对HspB1和BAG3转录物的强烈诱导（图​（图6A）第6页)和磷酸化HSF1蛋白（图​（图6B）6亿)热应激后。同样，热应激SOD1运动神经元显著诱导HspB1、HspB8和BAG3的转录水平（图​（图6A），第6页)与非应激状态相比，磷酸化HSF1蛋白水平增加（图​（图6B）。6亿). C9orf72运动神经元在热应激后也表现出HspB1、HspB8和BAG3转录水平的增加，尽管程度低于对照组或SOD1运动神经元（图​（图6A）。第6页). 类似地，C9orf72运动神经元表现出磷酸化HSF1水平的增加，尽管这种增加略低于显著性（图​（图6B）。6亿). 有趣的是，TDP-43运动神经元在热休克后没有显著诱导任何测量到的HSR成分（图​（图6），6)这表明这些运动神经元诱导这种蛋白质质量控制途径的能力存在内在缺陷。总之，这些数据表明，ALS iPSC衍生的运动神经元在某些条件下可能能够激活HSR，但不溶性蛋白质负荷并不是激活HSR的足够信号，遗传背景可能会影响整体反应。

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SOD1和C9orf72运动神经元在急性热应激后诱导HSR。（A）与热休克1小时后未处理的样本相比，SOD1和C9orf72运动神经元的HspB1、HspB8和BAG3转录水平增加。将数据标准化为未经处理的对照(**第页< 0.01,*第页<0.05（学生）t吨-测试）。n个= 3–4.（B）S326磷酸化HSF1的Western blot显示，与热休克1小时后未处理的样本相比，对照组和SOD1运动神经元培养物中的HSR显著诱导。图中未处理的western印迹​图5D第五天为了便于比较，再次显示。将数据归一化为REVERT总蛋白染色，并表示为未经处理的对照样品的倍数变化。(**第页< 0.01,*第页<0.05（学生）t吨-测试）。n个= 3–4.

ALS运动神经元没有表现出增强的应激颗粒形成

应激颗粒（SG）传统上在急性细胞应激期间将mRNA和RNA-结合蛋白（如TDP-43）隔离到无膜隔室中（Kedersha等人。，1999). 压力缓解后，SG分解和翻译恢复（Kedersha等人。，1999). 然而，在长期应激下，错误折叠的蛋白质，包括SOD1，可以积累成SG，这可以改变SG动力学，导致不溶性（Ganassi等人。，2016; Mateju等人。，2017). 此外，在死后ALS组织中的聚集物中发现了一些SG成分，包括eIF3和TIA-1（Liu-Yesucevitz等人。，2010)最近的一份报告已确定TIA-1是fALS的罕见诱因突变（Mackenzie等人。，2017). 因此，我们试图确定是否在ALS iPSC-derived运动神经元中自发形成SG，以此来指示ALS运动神经元是否上调应激通路，作为对不溶性蛋白增加的反应。我们发现，虽然SG标记物G3BP的染色模式主要是弥漫性的，但大多数神经元至少有一个G3BP+点，G3BP+点的平均数量为每个神经元3-5个（图​（图7A）。第7章). 有趣的是，C9orf72运动神经元在每个神经元的SG数量上表现出适度但显著的减少（图​（图7A），第7章)这可能表明C9orf72运动神经元诱导这种保护机制的能力不足。与对照组相比，ALS品系中G3BP的蛋白质水平没有总体变化（图​（图7B），7亿)在热应激后，与未应激状态相比，我们也未检测到任何样本中G3BP蛋白水平的变化（图​（图7B）。7亿). 这些数据与之前的研究（Mateju等人。，2017)并表明急性热应激可能不足以在iPSC系统中诱导应激颗粒的形成。综上所述，这些数据表明，尽管不溶性蛋白质负荷增加，但ALS iPSC衍生的运动神经元缺乏充分激活应激反应系统的能力。

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肌萎缩侧索硬化运动神经元没有表现出增强的应激颗粒形成。（A）Tuj1（白色）和G3BP（红色）的免疫细胞化学显示至少有一个G3BP+点的神经元数量没有差异，但C9orf72运动神经元每个神经元的G3BP+点较少(*第页Tukey单向方差分析<0.05事后的，事后的测试）。n个=3，比例尺=2μm。（B）G3BP的蛋白质印迹显示在未处理或热休克的运动神经元中的蛋白质水平没有差异（ns，第页>0.05（学生）t吨-测试）。将数据归一化为REVERT总蛋白染色，并表示为未经处理的对照样品的倍数变化。

讨论

ALS是一种高度复杂的神经退行性疾病，既没有治愈方法也没有有效的治疗方法。尽管第一次被描述是在19世纪末，但sALS的病因仍不清楚。此外，有24个不同的基因具有不同的发病率和蛋白质功能，已被确定为fALS的病因。鉴于这种异质性，必须确定任何聚合机制和表型，以开发适用于最多患者的治疗方法。以前的研究使用在体外和体内模型系统主要关注SOD1、TDP-43和近年来C9orf72连锁的ALS，因为这三个基因的突变是fALS最常见的原因。然而，这些研究有局限性。SOD1和一些TDP-43小鼠模型是通过过度表达人类蛋白的突变形式而产生的，这可能不能准确地反映人类的状况。迄今为止，已经建立了多个C9orf72小鼠模型，但由于每只小鼠表现出不同的表型，结果喜忧参半。C9orf72基因敲除小鼠没有表现出运动障碍，但确实表现出免疫表型和脾脏增大（O'Rourke等人。，2016). 或者，两个BAC C9orf72模型没有发展成ALS，尽管存在RNA焦点和二肽重复蛋白，这是该突变的特征（O'Rourke等人。，2015; Peters等人。，2015)而第三只BAC小鼠确实表现出运动障碍和生存率降低，这与ALS疾病状态一致（Liu等人。，2016). 许多其他研究使用了依赖突变蛋白在潜在的非疾病相关细胞类型中过度表达的非运动神经元细胞类型。相反，iPSC提供了一个独特的人体模型系统，用于研究与疾病相关细胞类型中ALS相关的内源性细胞过程（Dimos等人。，2008). 此外，多能干细胞更容易同时研究多种遗传背景，这对于确定融合性疾病机制至关重要。

尽管运动神经元丢失是ALS的主要病理特征，但iPSC衍生的运动神经元培养物在没有星形胶质细胞的情况下生长时不会表现出细胞死亡表型（图​（图1），1)（Dimos等人。，2008; Egawa等人。，2012; Almeida等人。，2013; Chen等人。，2014; Devlin等人。，2015). 然而，ALS iPSC衍生的运动神经元确实再现了ALS的其他特征。具体而言，我们检测到分化运动神经元中不溶性SOD1、TDP-43和OPTN蛋白水平增加（图​（图22–4)但是，每个基因型都有不同的成分和特征。例如，与对照运动神经元相比，SOD1和C9orf72运动神经元（而非TDP-43运动神经元）增加了不溶性SOD1（图​（图2C）。2摄氏度). 在任何未分化的iPSC株系中均未观察到SOD1蛋白聚集，这表明蛋白质负荷随着末端分化而增加。尽管先前的研究表明SOD1运动神经元含有丰富的不溶性SOD1蛋白（Chen等人。，2014; Bhinge等人。，2017)之前未对TDP-43和C9orf72 iPSC-derived运动神经元的SOD1表达水平进行评估。平均而言，C9orf72线显示出SOD1不溶性水平增加的趋势（图​（图2C），2摄氏度)然而，这种表型在多个品系中是不同的。由于每一行的扩展重复数大致相同（Sareen等人。，2013)，可能还有其他疾病调节剂导致了该表型在人群中的不同。此外，值得注意的是，这些研究只使用了一条SOD1线和一条TDP-43线。因此，利用多个iPSC-line来考虑人群差异对于未来的研究是必要的。

我们还检测到TDP-43运动神经元中的TDP-43病理学。不溶性蛋白质水平的增加证明了这一点（图​（图3C），3C公司)，TDP-43似乎聚集在TDP-43运动神经元中，这与之前的报告一致（Egawa等人。，2012). 有趣的是，C9orf72患者的尸检组织显示TDP-43+聚集物（DeJesus-Hernandez等人。，2011)，我们没有观察到C9orf72 iPSC衍生运动神经元培养物中不溶性TDP-43水平的增加（图​（图3C）。3C公司). 这可能是因为C9orf72 ALS中的TDP-43病理学很可能是由二肽重复启动的次级表型，二肽重复是C9orf 72连锁病理学的特征（Khosravi等人。，2017). 虽然iPSC-derived运动神经元在培养中培养了四周，但随着培养时间的延长，TDP-43蛋白的聚集和病理可能变得明显。

OPTN通常存在于死后ALS样本的蛋白质聚集体中，是与fALS相关的许多罕见突变之一（Maruyama等人。，2010). 重要的是，OPTN是一种自噬衔接蛋白，因此是蛋白质平衡网络的一部分。因此，任何OPTN水平、溶解度或定位的改变都可能对神经元清除蛋白质聚集物的能力产生有害影响。然而，以前还没有在ALS iPSC衍生的运动神经元培养物中评估OPTN病理学。虽然TDP-43运动神经元中没有OPTN聚集的证据，但与对照组相比，在SOD1和C9orf72运动神经元中观察到不溶性OPTN蛋白水平增加（图​（图4C）。4摄氏度). 重要的是，除了一个显示不溶性OPTN的未分化C9orf72 iPSCline外，不溶性蛋白在分化的运动神经元中最为显著。总之，最近的一份报告支持了这些数据，该报告显示运动神经元中SOD1、TDP-43和OPTN过饱和，因此特别容易聚集（Ciryam等人。，2017). 因此，尽管遗传背景可能会改变聚集蛋白的特定含量，但运动神经元可能无法有效处理蛋白质负荷，从而导致运动神经元功能障碍和丢失。

蛋白质平衡网络包括HSR、泛素-蛋白酶体系统和自噬，其功能是防止蛋白质聚集。除了运动神经元丢失外，蛋白聚集是ALS患者唯一的病理学相似性之一。因此，上调蛋白质平衡网络的一个或多个成分可能是许多ALS患者的潜在治疗方法。因此，以前的研究已经确定，通过过度表达HSR成分或使用药理激动剂诱导HSR可以减少SOD1和TDP-43 ALS细胞培养和小鼠模型中蛋白质聚集体的数量和毒性（Kieran等人。，2004; Kalmar等人。，2008; Crippa等人。，2010,2016; Lin等人。，2013,2016; Chen等人。，2016; Ganassi等人。，2016). 然而，以前的工作也表明，HSR的异常激活会降低蛋白质折叠和分解的整体功效（Roth等人。，2014); 有趣的是，来自帕金森病、亨廷顿病和阿尔茨海默病患者的人脑样本都显示出异常的HSR激活（Brehme等人。，2014)表明这可能是神经退行性变的一个重要特征。我们发现，SOD1、TDP-43和C9orf72运动神经元对生理蛋白质负荷的反应中HSR激活最少和/或不完全（图​（图5）。5). HspB1和HspB8都是识别错误折叠蛋白的小伴侣蛋白家族的一部分。此外，这两个基因的突变与远端遗传性运动神经病有关（Echaniz-Laguna等人。，2017)进一步表明其在运动疾病中的作用。BAG3，一种共伴侣蛋白，可以与HspB1和HspB8复合以帮助蛋白质清除（Ganassi等人。，2016; 劳赫等人。，2017). 我们发现，与对照组相比，尽管TDP-43运动神经元增加了BAG3的表达（图5A、C)，HspB1或HspB8没有同时增加（图5A、B级). 同样，我们发现与对照组相比，SOD1运动神经元在HspB8表达中表现出诱导作用（图5A、B级)，但只有BAG3升高的趋势，HspB1没有增加（图5A、B级). 有趣的是，与对照组相比，C9orf72 iPSC-derived运动神经元的BAG3、HspB8或HspB1没有明显增加（图​（图5）。5). 这些数据，以及与对照组相比，任何ALS品系中磷酸化HSF1水平没有显著变化（图​（图5D），第五天)表明增加不溶性蛋白质负荷不足以完全激活ALS运动神经元中的HSR。

也许最有趣的是，ALS运动神经元在热休克反应中表现出不同的HSR诱导。当在42°C下培养1小时时，与非应激状态相比，SOD1运动神经元培养能够强烈诱导HSR（图​（图6）。6). 鉴于此途径在清除SOD1聚集物方面的明显益处（Kieran等人。，2004; Kalmar等人。，2008; Crippa等人。，2010; Lin等人。，2013)这些数据支持HSR激动剂在治疗SOD1相关的ALS中的应用，例如HSR诱导剂阿立莫洛尔（Kieran等人。，2004; Kalmar等人。，2008,2014). 尽管与对照组和SOD1运动神经元相比，C9orf72 iPSC-derived运动神经元在热休克后能够诱导该通路（图​（图6）。6). 这些结果还表明，HSR激动剂可能对C9orf72相关的ALS有益，尽管在较温和的诱导下可能需要一种特别有效的激动剂。然而，TDP-43运动神经元在热休克后并没有诱导HSR，这可以通过HspB1、HspB8或BAG3转录水平的显著增加或HSF1磷酸化的增加来证明（图​（图6）。6). TDP-43运动神经元激活HSR的能力可能存在内在缺陷，HSR激动剂可能不是TDP-相关ALS的有效治疗方法，但由于只使用了一个TDP-43 iPSC细胞系，因此需要进行更多研究。奇怪的是，我们没有观察到热休克后控制运动神经元中HspB8转录水平的诱导（图​（图6A）。第6页). 鉴于这些qPCR实验是在与用于HspB1和BAG3的样品相同的样品上进行的，因此热休克本身不太可能有问题。然而，由于HspB8对温度敏感，不清楚为什么在三个对照系中都没有诱导。

SG主要与FUS连接的ALS连接，因为FUS是一种RNA结合蛋白，可以在正常颗粒中发现。然而，之前在TDP-43免疫阳性的死后蛋白质聚集体中发现了各种SG成分（Liu-Yesucevitz等人。，2010)以及HspB1和HspB8被招募到异常SG中（Ganassi等人。，2016; Mateju等人。，2017). 虽然动态SG是正常应激反应的一部分，但长时间接触错误折叠的蛋白质会导致SG失去这种活力，进而导致更难溶的聚集物（Mateju等人。，2017). 有趣的是，在肌萎缩侧索硬化运动神经元培养中，我们发现至少有一个SG的神经元数量没有变化（图​（图7A）。第7章). 这与之前的报告形成了鲜明对比，之前的报告显示在体外SOD1-、TDP-43-或C9orf72-连锁ALS的模型（Liu-Yesucevitz等人。，2010; Dafinca等人。，2016; Mateju等人。，2017). 然而，之前的大多数研究表明，SG生成增加是在外源胁迫条件下观察到的，包括热冲击。然而，我们没有发现热休克后G3BP的蛋白质水平显著增加（图​（图7B）。7亿). 因此，急性热休克可能不足以诱导ALS iPSC衍生运动神经元中SG的形成，衰老或DNA损伤可能是必要的。研究表明，FUS iPSC运动神经元培养物中SG数量的诱导显示出显著的DNA损伤，这也证实了这一点（Higelin等人。，2016).

为了进一步研究HSR在ALS发病机制中的作用，iPSCs代表了一个有价值的人类运动神经元模型系统，因为不同的遗传背景和可变的蛋白质负荷可能会影响整体细胞反应。这些数据表明，尽管维持了生存能力，但SOD1、TDP-43和C9orf72 iPSC-derived运动神经元中突变蛋白的生理水平诱导了不溶性蛋白的积累，但不同基因型的蛋白质负荷不同。此外，随着时间的推移，由于HSR的最小内源性激活而非异常过度表达，不溶性蛋白可能在ALS运动神经元中积聚。因此，这些数据进一步支持了HSR激动剂作为ALS潜在治疗策略的使用。然而，由于不同ALS iPSC株系中HSR组分的表达也存在差异，需要进行更多研究来分析单个突变蛋白如何影响ALS蛋白质质量控制系统的整体功能。

作者贡献

ES和AE设计了实验。ES进行了实验，分析了数据，并撰写了手稿。SS协助进行数据分析和iPSC维护。AE协助数据分析并撰写了手稿。所有作者审查并批准了最终文件。

利益冲突声明

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

致谢

我们感谢Matt Scaglione博士为过滤捕集试验提供建议，并诚挚地提供醋酸纤维素膜和斑点印迹仪。我们还感谢Clive Svendsen博士和In-Hun Park博士分别提供C9orf72和TDP-43 iPSC线路。

脚注

基金。资金由Advanced a Healthier Wisconsin（AE）提供。ES部分由Quadracci Memorial Fellowship提供支持。

工具书类

  • Almeida S.、Gascon E.、Tran H.、Chou H.J.、Gendron T.F.、Degreoot S.等人（2013年）。用iPSC-derived人类神经元C9ORF72重复扩增模拟额颞叶痴呆的主要病理特征.神经病理学学报。 126, 385–399. 10.1007/s00401-013-1149年[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Ananthan J.、Goldberg A.、Voellmy R.（1986年）。异常蛋白质作为真核应激信号并触发热休克基因的激活.科学类 232, 522–524. 10.1126/科学3083508[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Baler R.、Welch W.J.、Voellmy R.（1992年）。新生多肽和变性蛋白对热休克基因的调控：hsp70是一种潜在的自身调节因子.《细胞生物学杂志》。 117, 1151–1159. 10.1083/jcb.117.6.1151号[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Bhinge A.、Nambouri S.C.、Zhang X.、VanDongen A.M.J.、Stanton L.W.（2017）。SOD1突变型iPSCs的遗传校正揭示ERK和JNK激活的AP1是肌萎缩侧索硬化症神经变性的驱动因素.干细胞代表。 8，856–869页。2016年10月10日/j.stemcr.2017.02.019[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Bilican B.、Serio A.、Barmada S.J.、Nishimura A.L.、Sullivan G.J.和Carrasco M.等人（2012年）。突变诱导的多能干细胞系再现了TDP-43蛋白病的各个方面，并揭示了细胞特异性脆弱性.程序。国家。阿卡德。科学。美国。 109, 5803–5808. 10.1073/pnas.1202922109[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Boya P.、Andreau K.、Poncet D.、Zamzami N.、Perfettini J.L.、Metivier D.等人（2003年）。溶酶体膜通透性以线粒体依赖的方式诱导细胞死亡.实验医学学报 197, 1323–1334. 10.1084/jem.20021952[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Brehme M.、Voisine C.、Rolland T.、Wachi S.、Soper J.H.、Zhu Y.等人（2014）。伴侣子网络在衰老和神经退行性疾病中保护蛋白质平衡.单元格代表。 9, 1135–1150. 2016年10月10日/j.celrep.2014.09.042[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Chen H.J.、Mitchell J.C.、Novoselov S.、Miller J.、Nishimura A.L.、Scotter E.L.等人（2016）。热休克反应在TDP-43清除中起重要作用：肌萎缩侧索硬化症功能障碍的证据.大脑 139(第5部分), 1417–1432. 10.1093/brain/aww028[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • 陈海、钱凯、杜忠、曹杰、彼得森A.、刘海等（2014）。用iPSCs模拟ALS显示突变SOD1错误调节运动神经元的神经丝平衡.细胞干细胞 14, 796–809. 10.1016/j.stem.2014.02.004[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Ciryam P.、Lambert-Smith I.A.、Bean D.M.、Freer R.、Cid F.、Tartaglia G.等（2017年）。脊髓运动神经元蛋白过饱和模式与ALS包涵体形成相关.程序。国家。阿卡德。科学。美国。 114，E3935–E3943。10.1073/pnas.1613854114[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Crippa V.、Cicardi M.E.、Ramesh N.、Seguin S.J.、Ganassi M.、Bigi I.等人（2016年）。伴侣蛋白HSPB8减少截短的TDP-43物种在细胞中的积累，并保护其免受TDP-43介导的毒性.嗯，分子遗传学。 25, 3908–3924. 10.1093/hmg/ddw232[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Crippa V.、Sau D.、Rusmini P.、Boncoraglio A.、Onesto E.、Bolzoni E.等人（2010年）。小分子热休克蛋白B8（HspB8）促进与肌萎缩侧索硬化（ALS）相关的错误折叠蛋白的自噬清除.嗯，分子遗传学。 19, 3440–3456. 10.1093/hmg/ddq257[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Dafinca R.、Scaber J.、Ababneh N.、Lalic T.、Weir G.、Christian H.等人（2016年）。C9orf72六核苷酸扩增与肌萎缩侧索硬化和额颞叶痴呆患者诱导的多能干细胞源神经元内质网钙稳态改变和应激颗粒形成相关.干细胞 34, 2063–2078. 2002年10月10日/第288条[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • DeJesus-Hernandez M.、Mackenzie I.R.、Boeve B.F.、Boxer A.L.、Baker M.、Rutherford N.J.等人（2011年）。C9ORF72非编码区的扩增GGGGCC六核苷酸重复序列导致染色体9p连锁FTD和ALS.神经元 72, 245–256. 2016年10月10日/j.neuron.2011.09.011[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • De Kimpe L.、van Haastert E.S.、Kaminari A.、Zwart R.、Rutjes H.、Hoozemans J.M.等人（2013年）。聚集焦谷氨酸淀粉样β的细胞内积累：溶酶体处老化和AB病理学的会聚.年龄 35, 673–687. 2007年10月17日/11357-012-9403-0[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Devlin A.C.、Burr K.、Borooah S.、Foster J.D.、Cleary E.M.、Geti I.等人（2015）。携带TARDBP或C9ORF72 ALS突变的人iPSC-derived运动神经元尽管保持了生存能力，但仍存在功能失调.国家公社。 6：5999.10.1038/ncomms6999[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Dimos J.T.、Rodolfa K.T.、Niakan K.K.、Weisenthal L.M.、Mitsumoto H.、Chung W.等人（2008年）。ALS患者产生的诱导多能干细胞可分化为运动神经元.科学类 321, 1218–1221. 10.1126/科学1158799[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Ebert A.D.、Yu J.、Rose F.F.、Jr.、Mattis V.B.、Lorson C.L.、Thomson J.A.等人（2009年）。脊髓性肌萎缩症患者诱导的多能干细胞.自然 457, 277–280. 10.1038/性质07677[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Echaniz-Laguna A.、Geuens T.、Petiot P.、Péréon Y.、Adriaenssens E.、Haidar M.等人（2017年）。小热休克蛋白突变导致的轴突神经病变：对新突变的临床、遗传和功能见解.嗯，变种人。 38, 556–568. 10.1002/humu.23189[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Egawa N.、Kitaoka S.、Tsukita K.、Naitoh M.、Takahashi K.、Yamamoto T.等人（2012年）。利用患者特异性诱导多能干细胞筛选ALS药物.科学。Transl.公司。医学。 4：145ra104.10.126/scitranslmed.3004052[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Ganassi M.、Mateju D.、Bigi I.、Mediani L.、Poser I.、Lee H.O.等人（2016年）。HSPB8-BAG3-HSP70伴侣复合体的监测功能确保应激颗粒的完整性和动态性.分子电池 63, 796–810. 2016年10月10日/j.molcel.2016.07.021[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Guettouche T.、Boellmann F.、Lane W.S.、Voellmy R.（2005）。应激细胞中人热休克因子1磷酸化的分析.BMC生物化学。 6:4. 10.1186/1471-2091-6-4[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Higelin J.、Demestre M.、Putz S.、Delling J.P.、Jacob C.、Lutz A.K.等人（2016年）。ALS患者hiPSC和老化运动神经元的FUS定位错误和DNA损伤易感性.前面。单元格。神经科学。 10：290.10.3389/分钟.2016.00290[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Hosoyama T.、McGivern J.V.、Van Dyke J.M.、Ebert A.D.、Suzuki M.（2014）。利用球状培养直接从人多能干细胞中衍生肌源性祖细胞.干细胞移植。医学。 三, 564–574. 10.5966/季度2013-0143[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Kalmar B.、Lu C.H.和Greensmith L.（2014）。热休克蛋白在肌萎缩侧索硬化症中的作用：阿立莫洛尔的治疗潜力.药理学。疗法。 141, 40–54. 10.1016/j.pharmthera.2013.08.003[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Kalmar B.、Novoselov S.、Gray A.、Cheetham M.E.、Margulis B.、Greensmith L.（2008）。晚期阿立莫洛尔治疗可延缓疾病进展并防止SOD1小鼠ALS模型中的蛋白质聚集.神经化学杂志。 107, 339–350. 10.1111/j.1471-4159.2008.05595.x[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Kedersha N.L.、Gupta M.、Li W.、Miller I.和Anderson P.（1999）。RNA结合蛋白TIA-1和TIAR将eIF-2α的磷酸化与哺乳动物应激颗粒的组装联系起来.《细胞生物学杂志》。 147：1431.10.1083/jcb.147.7.1431[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Khosravi B.、Hartmann H.、May S.、Möhl C.、Ederle H.、Michaelsen M.等人（2017年）。细胞质poly-GA聚集体损害C9orf72 ALS/FTLD中TDP-43的核输入.嗯，分子遗传学。 26, 790–800. 10.1093/hmg/ddw432[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Kieran D.、Kalmar B.、Dick J.R.、Riddoch-Contreras J.、Burnstock G.、Greensmith L.（2004）。阿立莫氯莫尔（一种热休克蛋白的共转导者）治疗可延缓ALS小鼠的疾病进展.自然医学。 10, 402–405. 10.1038/nm1021[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • 李川、常毅、李毅、陈S.、陈毅、叶恩等（2017）。晚期糖基化终产物通过上调BAG3促进原代大鼠血管平滑肌细胞的增殖和迁移.国际分子医学杂志。 39, 1242–1254. 10.3892/ijmm.2017.2938[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Lin P.、Simon S.M.、Koh W.K.、Folorunso O.、Umbaugh C.S.、Pierce A.（2013）。在肌萎缩侧索硬化小鼠模型中，热休克因子1过度表达可防止突变SOD1上的疏水残基暴露和早期死亡.摩尔神经变性剂。 8:43. 10.1186/1750-1326-8-43[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Lin P.Y.、Folorunso O.、Taglialatela G.、Pierce A.（2016）。热休克因子1的过度表达通过诱导培养细胞中的热休克蛋白70维持TAR DNA结合蛋白43的溶解度.《神经科学杂志》。物件。 94, 671–682. 10.1002/约23725[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Liu Y.、Patamatta A.、Zu T.、Reid T.、Bardhi O.、Borchelt D.R.等（2016）。具有运动缺陷和ALS/FTD神经退行性特征的C9orf72 BAC小鼠模型.神经元 90, 521–534. 2016年10月10日/j.neuron.2016.04.05[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Liu-Yesucevitz L.、Bilgutay A.、Zhang Y.J.、Vanderweyde T.、Citro A.、Mehta T.等（2010）。焦油DNA结合蛋白-43（TDP-43）与应激颗粒相关：培养细胞和病理脑组织的分析.公共科学图书馆 5：e13250.10.1371/journal.pone.0013250[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Mackenzie I.R.、Bigio E.H.、Ince P.G.、Geser F.、Neumann M.、Cairns N.J.等人（2007年）。病理TDP-43区分散发性肌萎缩侧索硬化症和SOD1突变的肌萎缩侧索性硬化症.安。神经。 61, 427–434. 10.1002/ana.21147[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Mackenzie I.R.、Nicholson A.M.、Sarkar M.、Messing J.、Purice M.D.、Pottier C.等人（2017年）。肌萎缩侧索硬化和额颞叶痴呆的TIA1突变促进相分离并改变应激颗粒动力学.神经元 95，808–816 e809。10.1016/j.neuron.2017.07.025[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Maruyama H.、Morino H.、Ito H.、Isumi Y.、Kato H.和Watanabe Y.等人（2010年）。肌萎缩侧索硬化症患者视神经蛋白的突变.自然 465，223–226。10.1038/自然08971[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Mateju D.、Franzmann T.M.、Patel A.、Kopach A.、Boczek E.、Maharana S.等人（2017年）。错误折叠蛋白触发的应激颗粒异常相变及伴侣功能的预防.EMBO J。 36, 1669–1687. 10.15252/embj.201695957[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Maury Y.、Corme J.、Piskorowski R.A.、Salah-Mohellibi N.、Chevaleyre V.、Peschanski M.等人（2015）。对发育线索的组合分析有效地将人类多能干细胞转化为多种神经元亚型.自然生物技术。 33, 89–96. 10.1038/nbt.3049[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • McGivern J.V.、Patitucci T.N.、Nord J.A.、Barabas M.E.、Stucky C.L.、Ebert A.D.（2013）。脊髓肌萎缩星形胶质细胞表现出异常的钙调节和生长因子生成减少.格利亚 61, 1418–1428. 10.1002/glia.22522[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Miyazaki D.、Nakamura A.、Hineno A.、Kobayashi C.、Kinoshita T.、Yoshida K.等人（2016）。肌萎缩侧索硬化症患者血清热休克蛋白水平升高.神经醇。科学。 37, 1277–1281. 2007年10月10日/10072-016-2582-1[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Mizuno Y.、Amari M.、Takatama M.、Aizawa H.、Mihara B.、Okamoto K.（2006）。肌萎缩侧索硬化患者脊髓前角细胞中泛素结合蛋白p62的免疫反应性.神经药理学杂志。科学。 249, 13–18. 2016年10月10日/j.jns.2006.05.060[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Morimoto R.I.（1998）。热休克转录反应的调节：热休克因子家族、分子伴侣和负调控因子之间的相互对话.基因发育。 12, 3788–7396. 10.1101/gad.12.24.3788[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • O'Rourke J.G.、Bogdanik L.、Muhammad A.K.、Gendron T.F.、Kim K.J.、Austin A.等人（2015）。C9orf72 BAC转基因小鼠表现出典型的ALS/FTD病理特征.神经元 88, 892–901. 2016年10月10日/j.neuron.2015.1027[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • O'Rourke J.G.、Bogdanik L.、Yanez A.、Lall D.、Wolf A.J.、Muhammad A.K.M.G.等人（2016年）。C9orf72是小鼠正常巨噬细胞和小胶质细胞功能所必需的.科学类 351, 1324–1329. 10.1126/science.aaf1064[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Ospelt C.、Camici G.G.、Engler A.、Kolling C.、Vogetseder A.、Gay R.E.等人（2014）。吸烟诱导关节中热休克蛋白系统的转录.大黄年鉴。数字化信息系统。 73, 1423–1426. 10.1136/annrheumdis-2013-204486年[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Patitucci T.N.，Ebert A.D.（2016年）。SMN缺乏不会在SMA iPSC衍生的星形胶质细胞或运动神经元中诱导氧化应激.嗯，分子遗传学。 25, 514–523. 10.1093/hmg/ddv489[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Peters O.M.、Cabrera G.T.、Tran H.、Gendron T.F.、McKeon J.E.、Metterville J.等人（2015年）。人C9ORF72六核苷酸扩增在BAC转基因小鼠中复制RNA焦点和二肽重复蛋白，但不产生神经变性.神经元 88, 902–909. 2016年10月10日/j.neuron.2015.111.018[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • 劳赫·J.N.、谢恩·E、弗雷利奇·R、莫克·S·A、马克利·L·N、索斯沃思·D·R等人（2017年）。BAG3是一种模块化的支架蛋白，它将热休克蛋白70（Hsp70）与小的热休克蛋白物理连接起来.分子生物学杂志。 429, 128–141. 2016年10月10日/j.jmb.2016.11.013[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Riedel M.、Jou C.J.、Lai S.、Lux R.L.、Moreno A.P.、Spitzer K.W.等人（2014）。人外周血单核衍生多能干细胞分化心肌细胞的功能和药理分析.干细胞代表。 三, 131–141. 2016年10月10日/j.stemcr.2014.04.017[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Roth D.M.、Hutt D.M.，Tong J.、Bouchecareilh M.、Wang N.、Seeley T.等（2014）。调节不适应应激反应以治疗蛋白质折叠疾病.《公共科学图书馆·生物》。 12：e1001998。10.1371/日志.pbio.1001998[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Santoro M.G.（2000）。热冲击因素与应力响应控制.生物化学。帕尔马科尔。 59, 55–63. 10.1016/S0006-2952（99）00299-3[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Sareen D.、O'Rourke J.G.、Meera P.、Muhammad A.K.M.G.和Grant S.、Simpkinson M.等人（2013年）。以C9ORF72重复扩增的ALS患者iPSC-derived运动神经元为靶点的RNA焦点.科学。Transl.公司。医学。 5：208ra149.10.1126/scitranslmed.3007529[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Shi Y.、Mosser D.D.、Morimoto R.I.（1998）。HSF1特异性转录阻遏物的分子伴侣.基因发育。 12, 654–66. 10.1101/gad.12.5.654[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • 王洪川、蒋伟富、黄洪海、黄世凯、蒋洪川（2013）。口腔鳞癌细胞热休克蛋白B1基因启动子高甲基化.口腔外科。口腔医学。口腔病理学。口腔放射。 115, 376–384. 2016年10月10日/j.oooo.2012.12.011[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Westerheide S.D.、Raynes R.、Powell C.、Xue B.、Uversky V.N.（2012）。HSF转录因子家族、热休克反应和蛋白质内在紊乱.货币。蛋白质肽科学。 13, 86–103. 10.2174/138920312799277956 [公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Yu A.、Shibata Y.、Shah B.、Calamini B.、Lo D.C.、Morimoto R.I.（2014）。蛋白质聚集通过伴侣竞争抑制氯氰菊酯介导的内吞作用.程序。国家。阿卡德。科学。美国。 111，E1481–E1490。10.1073/pnas.1321811111[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Zufiría M.、Gil-Bea F.J.、Fernández-Torrón R.、Poza J.J.、Muñoz-Blanco J.L.、Rojas-Garcia R.等人（2016年）。ALS：一桶基因、环境、新陈代谢和未知成分.掠夺。神经生物学。 142，104–129。10.1016/j.神经生物学2016.05.004[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
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