应激细胞中人热休克因子1磷酸化的分析

LEXA-HSF1的丙氨酸扫描

制备LEXA-HSF1或FLAG-LEXA-HSF1的替代突变体（FLAG-tagged-LEXA-HSF1），其共同覆盖LEXA-HSSF1中HSF1序列的所有92个Ser、Thr和Tyr残基。进行反激活分析以比较突变因子和亲本因子在暴露于44°C/30分钟热处理或未经热处理的细胞中的转录增强能力。值得注意的是，这种热处理只导致最小的细胞死亡。结果表明，大多数突变体保留了各自亲本因子的强热诱导性（表​（表1）。1). 9个突变体（突出显示）的诱导活性比亲本因子低两个以上的平均标准偏差（2×10.3%）。其中5个突变体仅轻度受损，但4个突变体S326A/T328A、T400A/S（403/404）A、S（457/458/461）A和T511A/S513A活性显著降低。突变体S326A/T328A和T511A/S513A表达到正常水平。然而，突变体T400A/S（403/404）A积累到明显较低的水平，并且突变体S（457/458/461）A被蛋白水解切割（蛋白质印迹数据未显示）。这些结果表明，残基326、328、511和/或513的磷酸化可能在热应激激活HSF1中起重要作用。突变株S（303/307）A和S307A分别约为150%和50%，比热处理细胞中的亲本因子更活跃（表​（表11).

热处理细胞分离的HSF1中磷酸化的残基

在第一系列实验中，前一天转染表达结构FLAG-HSF1的培养物与³²人事军官₄然后在44°C下热处理45分钟。使用抗FLAG树脂免疫沉淀外源性HSF1。在染色的高分辨率Tris-Tricine SDS-PAGE凝胶中（图​（图1C），1摄氏度)免疫分离的HSF1表现为两个尖锐的条带和一个迁移较慢的扩散区域，其中包含最高度磷酸化的形式（也有最强烈的放射性标记；数据未显示）。来自后一区域的蛋白质（参见图中的括号​图1C）1摄氏度)进行胰蛋白酶或胰蛋白酶/糜蛋白酶消化。磷酸肽通过HPLC分离，通过质谱（MALDI-MS）初步鉴定，并通过常规和/或放射化学测序确认。在随后的实验中，采用串联质谱法（LC/MS/MS）分析未标记、纯化的FLAG标记HSF1中的肽，这些肽用胰蛋白酶、胰蛋白酶/糜蛋白酶或内蛋白酶Glu-C或AspN消化。这些分析结果明确鉴定了HSF1序列第121、230*、292、303*、307*、314、319、326、344、363*、419和444位的磷丝氨酸（表​（表2；2; *之前报告的站点）。未发现磷酸化的Thr或Tyr残基。该分析涵盖了>90%的HSF1序列。未获得关于残基176–184、202–206、225–227、241–256、270–284和427–432的信息。

HSF1残基Ser的磷酸化³²⁶

基于上述丙氨酸扫描的结果，HSF1残基326、328、511和/或513被认为是调节磷酸化的潜在位点。这些残留物中只有Ser³²⁶在热休克细胞的HSF1中发现磷酸化。在早期的丙氨酸扫描中，并非所有通过质谱和/或测序确定为磷酸化目标的残基都被单独替换。为了排除磷酸化残基的替代作用以某种方式被掩盖或调节的可能性（在Ser³²⁶)利用同一突变体中存在的其他取代基，制备单个取代基，并在反式激活试验中进行检测。除S326A取代外，磷酸化丝氨酸的所有取代都显示出与母体因子相当的热诱导活性（表​（表1，1，底部）。S326A取代的活性仅为亲本因子的40%左右（在单个实验中为35-55%）。测试是否替换Ser³²⁶S326A突变体不仅受到热诱导活性的影响，还受到化学诱导的HSF1活性的影响₂.CdCl诱导₂被发现与热诱导损伤相似（图​（图1D）。一维). 注意，如图所示的抗FLAG蛋白印迹所示，这种活性降低的表型并不是由于突变体积累水平降低所致​图1E。1E级对整个S326A编码序列进行核苷酸测序，证实其不包含任何额外突变。此外，在单独的诱变实验中获得的突变体S326A的第二个拷贝与原始拷贝具有类似的应激诱导活性受损。

HSF1残基Ser的快速磷酸化³²⁶在热应激期间

磷酸肽抗体（以下称为pSer³²⁶抗体）的制备用于特异性监测Ser的磷酸化³²⁶HSF1的整体磷酸化（即所有可用位点的磷酸化）和Ser的特定磷酸化的热诱导率³²⁶在图中所示的实验中，对因子齐聚和因子齐聚进行了比较​图22（面板A和B）。培养物要么未经热处理，要么在44°C下热处理5、10、15或30分钟。HSF1三聚化通过天然抗HSF1印迹进行评估。从单体形式消失后可以看出，大多数HSF1在热处理5分钟内已经或正在变成低聚物（图​（图2A）。2安培). 用于检查整体和序列号³²⁶-特异性磷酸化，使用pSer免疫沉淀HSF1³²⁶抗体。免疫沉淀HSF1（图​（图2B，2B型用抗HSF1 western blot检测提取物（“裂解物”通道）中的HSF1和HSF1。为了更好地解析不同的HSF1物种，继续电泳，直到50 kDa标记迁移到凝胶末端（图中仅显示了包含HSF1形式的区域，即大约70 kD的蛋白质大小​图2B）。2B型). 结果表明，非应激细胞中含有少量HSF1，可以通过pSer免疫沉淀³²⁶抗体（“ip”，第一道）。注意，正如预期的那样，最快速迁移的免疫沉淀HSF1形式比提取物中存在的最快物种慢（比较0分钟“ip”和“裂解物”通道）。细胞热处理后，pSer从提取物中沉淀的HSF1数量³²⁶抗体增加了约3倍（见“ip”通道下方的定量）。仅经过5分钟的热处理，这种增加就基本完成了。从更快迁移到更慢迁移的HSF1物种所揭示的整体磷酸化发生得更慢，并在整个30分钟的热处理过程中持续（“裂解物”通道）。pSer也观察到缓慢迁移物种的类似逐渐转移³²⁶-包含HSF1物种（“ip”车道）。因此，热处理似乎导致Ser的磷酸化水平显著增加³²⁶这种磷酸化的增加与因子寡聚反应发生的速度一样快，并先于大多数其他位点的磷酸化。

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图2

热诱导HSF1寡聚和磷酸化. (A类)天然抗HSF1印迹显示，在印迹顶部指示的时间内，响应于44°C（HS）下的热处理，内源性HSF1的热诱导低聚。T： HSF1三聚体；D： 异二聚体；M： 单体。(B类)本文采用与A中用于HSF1寡聚化分析的培养物平行的培养物来检测全局或序列³²⁶-内源性HSF1的特异性磷酸化。所示的抗HSF1蛋白印迹报告了不同表观大小（反映不同磷酸化水平）的HSF1形式在提取物样品（裂解物）或由pSer从相同提取物中免疫沉淀的蛋白质中的分布³²⁶抗体（ip）。所示的印迹部分仅显示大于约70kD的蛋白质信号。(C)热诱导Ser磷酸化的检测³²⁶使用抗pSer的western blot³²⁶抗体。用少量FLAG-HSF1转染平行培养物。一天后，培养物要么未经处理（C），要么在44°C（HS）下热处理30分钟，然后在热处理后立即进行蛋白质印迹处理。抗pSer³²⁶丝氨酸诱导的blot报告³²⁶热磷酸化和平行抗FLAG印迹表明，抗pSer中FLAG-HSF1的含量相似³²⁶污点。密度测定数据显示在斑点下方。印迹一侧的括号表示扫描区域的长度。在A中，对单体信号进行了定量。

热诱导Ser磷酸化³²⁶第二次实验证实，HSF1在Ser³²⁶被抗pSer检测到³²⁶western印迹。由于抗体的亲和力低，HSF1需要在western blot之前进行富集。用少量表达构建物FLAG-HSF1转染大培养物（100 mm平板中）。一天后，一半培养物在44°C下热处理30分钟，并使用抗FLAG树脂对标记的HSF1进行免疫沉淀。然后使用pSer通过western blot分析免疫隔离材料³²⁶和FLAG抗体（图​（图2C）。2摄氏度). FLAG-HSF1从热处理和未处理的细胞中的回收率是相当的（顶部的抗FLAG印迹）。与pSer反应的热处理细胞中的因子比未经热处理的细胞中的大得多（2.5倍）³²⁶抗体。

细胞培养

Hela-CAT细胞[42]保持在37°C和5%CO₂在含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中。如McMillan等人所述，HSF1阴性小鼠胚胎成纤维细胞在补充的DMEM中生长[31].

表达结构和定点突变

将编码完整（人类）HSF1（残基1-529）、LEXA-HSF1（包含LEXA残基1-87和人类HSF1残基79-529）和氨基末端FLAG标记衍生物的序列亚克隆到pcDNA3.1（+）（Invitrogen）中，将这些序列置于CMV启动子的控制下[7]. 这些结构分别命名为HSF1、LEXA-HSF1、FLAG-HSF1和FLAG-LEXA-HSF1。对于丙氨酸扫描，使用LEXA-HSF1和FLAG-LEXA-HSF1作为QuikChange的模板^R（右）定点突变（Stratagene指导手册）。互补引物对用Ala密码子替换单个或多个Ser、Thr或Tyr密码子。通过限制性分析、兔网织红细胞裂解物转录和翻译系统（T7-Quick TNT系统，Promega）中的表达和核苷酸序列分析，对潜在突变基因进行了表征。使用相同的方法，还将几个突变引入HSF1的构建中。所用的β-半乳糖苷酶表达结构（B-GAL）为pcDNA3.1/His/LacZ（Invitrogen）。

转活化分析

报告器构造LEXA-fLUC如前所述[42]. 报告基因HSP70-fLUC是通过将人类HSP70B基因的启动子和RNA先导序列亚克隆到含有萤火虫荧光素酶基因的质粒中获得的。含有组成型表达的雷尼利亚荧光素酶基因（pRL-TK，pRL-CMV）来自Promega。使用Lipofectamine 2000（Gibco）的快速转染方案转染96周培养板中的培养物。通常，每个井接收到25μl Opti-MEM中0.75–1.0μl Lipofectamine 2000和25μl Ulti-MEM的DNA主混合物（88.25 ng），其中包括80 ng LEXA-fLUC或HSP70-fLUC、0.25 ng pRL-Tk或0.1 ng pRL-CMV、0.1–0.5 ng LEXA-HSF1或HSF1（或突变）随后添加100μl DMEM中的80000个细胞。通常，转染分三次进行。将转染细胞培养16–20小时，在44°C下热处理30分钟（除非另有说明），或不进行热处理，并在6–7小时后收获。为了表达萤火虫荧光素酶和回收萤火虫萤光素酶，优化了热处理和细胞收获之间的时间长度雷尼利亚荧光素酶活性。使用双荧光素酶试剂盒（Promega）和Stratec平板光度计测量荧光素素酶活性。通常，荧光素酶活性测定是一式三份的。

电泳迁移率测定

根据制造商的说明，用Lipofectamine PLUS、25 ng HSF1或突变HSF1表达构建体和2.975μg B-GAL在100 mm直径的细胞中转染，培养24小时，然后进行热处理或不处理。PBS洗涤的细胞再次悬浮在缓冲液C中（20 mM Hepes，pH7.9，0.42 M NaCl，1.5 mM MgCl₂，0.2 mM EDTA，0.5 mM二硫苏糖醇，“完全”蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏），25%甘油）。提取物通过三个快速冷冻和解冻循环以及离心澄清制备。同样的方案也用于制备天然凝胶电泳用提取物。立即使用提取物或将提取物储存在-70°C下。电泳迁移率变化测定基本上如前所述进行[7]. 使用分子动力学荧光成像仪检测和量化信号。

亚细胞分离

如前一节所述转染细胞。根据制造商的协议，使用来自皮尔斯的NE-PER核和细胞质提取试剂进行分馏。通过以下内源性HSF1（其定位已事先确定）验证了方案的正确操作。

HSF1磷酸肽的分析及磷酸化残基的鉴定

9.0 × 10⁶将32μg FLAG-HSF1表达构建物转染150 mm培养皿中的Hela-CAT细胞。对于涉及放射性标记磷酸肽分析的实验，转染20小时后，用含5%FCS的25 ml无磷DMEM清洗每个培养物一次，并在相同培养基中培养1小时。培养基被进一步含有2 mCi³²正磷酸盐（NEX011，NEN）和细胞在37°C下培养3小时。在44°C下热处理45分钟后，用冰镇PBS清洗细胞，并在室温下在添加0.5 mM NaV的3 ml Mper缓冲液（Pierce）中孵育15分钟以进行裂解_三、5 mM NaF、150 mM NaCl、1μM ocadaic acid和“完整”蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏）。去除碎片后，将提取物与80μl FLAG M2树脂在4°C下培养过夜。用含有150 mM NaCl的Mper缓冲液和仅用Mper缓冲溶液对树脂进行广泛清洗，用120μl 6X SDS-PAGE样品缓冲液洗脱FLAG-HSF1。Tris-Tricine高分辨率SDS-PAGE凝胶电泳后[43]FLAG-HSF1经考马斯染色，含有磷酸化程度最高的物种的凝胶块由耶鲁大学凯克基金会生物技术资源实验室（Kenneth Williams）处理，用于蛋白质水解消化、质谱分析、放射化学和正常肽序列测定。在其他实验中，使用类似的方案制备未标记的纯化FLAG-HSF1。使用Finnigan LCQ DECA四极离子阱质谱仪上的微柱反相高效液相色谱-纳米电喷雾串联质谱法，在哈佛微化学设施中对这些制剂进行序列分析。