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神经元。作者手稿；PMC 2016年12月2日提供。
以最终编辑形式发布为：
神经元。2015年12月2日；88(5): 902–909.
数字对象标识：2016年10月10日/j.neuron.2015.111.018
预防性维修识别码：下午428340
美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院772318
PMID：26637797

人类的表达C9ORF72型在BAC转基因小鼠中，六核苷酸扩增可复制RNA焦点和二肽重复蛋白，但不会产生神经变性

欧文·M·彼得斯，#1 加布里埃拉·托罗·卡布雷拉，#1,2 海伦·特拉，1 塔尼亚·F·根德隆，三 珍妮·麦基恩，1 杰克·梅特维尔，1 亚历山德拉·韦斯，1 尼古拉斯·威特曼，1 约翰尼·萨拉梅，1 朱云·金，7 孙华明，2 凯文·B·博伊兰，4 丹尼斯·迪克森，三 扎克·肯尼迪，1 林子强，1 张永杰，三 莉莲·多赫蒂（Lillian Daughrity），三 克里斯·荣格，6 汾标高，1 彼得·萨普，1,5 H罗伯特·霍维茨，5 达里尔·博斯科，1 索拉奇P.布朗，7 彼得·德容，6 伦纳德·彼得鲁切利，三 克里斯·米勒，2和小罗伯特·H·布朗。1
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补充资料

总结

非编码己核苷酸重复序列在C9ORF72型基因是家族性肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）最常见的突变。携带这种扩增物的患者会产生几种独特的组织病理学特征，包括由扩增重复序列的正或反义RNA转录物组成的核内病灶，以及由扩增RNA转录物的非标准翻译产生的二肽重复蛋白。为了进一步研究C9ORF72型在这些疾病中，我们培育了一系列携带细菌人工染色体的小鼠，该染色体包含人类外显子1至6C9ORF72型GGGGCC基序约500个重复的基因。这些小鼠没有表现出明显的行为表型，但重述了独特的组织病理学特征，这些特征是C9ORF72型ALS/FTD，包括正、反义核内RNA焦点和多（甘氨酸-脯氨酸）二肽重复蛋白。最后，在C9BAC小鼠原代皮层神经元培养物中，使用靶向人类C9ORF72的合成microRNA，我们减弱了C9BAC-转基因和多（GP）二肽的表达。这个C9ORF72型BAC转基因小鼠将成为研究ALS/FTD病理生物学和治疗的重要工具。

关键词：肌萎缩侧索硬化（ALS）、额颞叶痴呆（FTD）、C9ORF72、转基因小鼠、RNA病灶、RAN翻译、重复扩增、神经变性

介绍

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种神经退行性疾病，主要影响运动皮层、脑干和脊髓中的运动神经元，而额颞叶痴呆症（FTD）是由额颞叶区域的神经元变性引起的；然而，有趣的是，一些人同时经历了这两种疾病。通过在基因9号染色体开放阅读框72中识别一个异常扩增的GGGGCC重复序列基序，我们对这些疾病的理解发生了改变（C9ORF72）[1-三]. 位于的非编码区域C9ORF72型这种突变现在被认为是显性遗传ALS和FTD的最常见原因，称为c9ALS/FTD；在白种人中，它约占家族性ALS的40%，占散发性ALS中的4-8%[1，三，4]20%为遗传性FTD，6%为散发性FTD[5，6]. 在对照个体中，GGGCC重复序列被认为包含4到30个重复序列[7]. 虽然疾病外显率所需的GGGCC重复的精确阈值尚不清楚，但较大的重复与病理学有关；据报道，c9ALS/FTD患者超过2000例[1，三，8]. ALS或FTD表型的扩张大小和外显率之间没有明显的关联[8].

这个C9ORF72型该基因编码三种转录物变体(图S1). 变体2和3（V2，V3）包含内含子扩张并编码两种不同的蛋白质亚型[1]. 目前C9ORF72型该产品未知，但与rab相关的GDP/GTP交换因子蛋白结构同源d日不同地e（电子）在中表达n个法线和n个肿瘤细胞（DENN）在膜转运中起作用[9，10]. 降低了C9ORF72型c9ALS/FTD患者组织和衍生细胞系中的转录物已被描述[1，2，11，12]，表明C9ORF72型单倍体不足可能导致疾病。确实，删除C9ORF72型同系物秀丽隐杆线虫据报道会导致轴突病和运动障碍[13]. 的简化表达式C9ORF72型c9ALS/FTD病例中的mRNA与CpG岛上游的甲基化有关C9ORF72型发起人[14]GGGGCC结合组蛋白的甲基化[11]. 此外，GGGCC重复序列形成高度稳定的DNA G-四链体[15]据报道会影响转录[16].

也有可能是内含子C9ORF72型重复扩张会产生一种或多种毒性，损害神经元的生存能力。突变的双向转录C9ORF72型产生GGGGCC正义和CCCCGG反义重复序列，包含RNA转录物，形成核内RNA焦点[1，17，18]. 这些病灶可能作为特定RNA结合蛋白的新结合位点，这些结合蛋白可能被异常隔离，从而损害其功能[19-22]. 同样，可以想象，扩张的DNA束也可能滴定或以其他方式隔离DNA结合因子。除此之外，现在也很明显，扩增的GGGCC RNA转录物经历了重复相关的非ATG（RAN）翻译，这是一种非标准的蛋白质合成机制，产生二肽重复（DPR）蛋白质（GP、GA、GR代表有义转录物，PA、PR代表反义转录物）[20，23-25]. 这些DPR蛋白在c9ALS/FTD中聚集并形成细胞质内含物，在不同的模型系统中具有不同程度的毒性；富含精氨酸的肽显然是毒性最大的[26-30].

再现突变基因病理生物学的模型系统C9ORF72型基因在探索这种突变如何导致神经退行性变方面特别有帮助体内.几种无脊椎动物[13，27，29，31]，脊椎动物[32]和患者衍生细胞模型[12，33，34]已报告。虽然每一个模型都将提供深入的见解，但可以说，一个信息更丰富的模型将允许对C9ORF72型在完整哺乳动物神经系统中稳定表达的扩大GGGCC重复序列。为此，我们培育出了一种携带扩展型人类的新型转基因小鼠C9ORF72型携带大约500个GGGGCC基序的基因。

结果

BAC转基因小鼠表达人类突变体C9ORF72型基因

我们使用153.2kb的细菌人工染色体产生了SJL/B6转基因小鼠系，该染色体包含人类的外显子1至6C9ORF72型约500个GGGGCC重复基序，包括约140.5kb的上游序列(图1A，图S1A). 半合子C9BAC小鼠是可行的，以预期的孟德尔频率产生后代（数据未显示）。这些动物基因组DNA的Southern blot分析检测到两条不同的带，分别对应约500和300个GGGCC重复序列基序(图1B，图S1B). 该图谱显示了代际稳定性，在远亲F6动物中观察到两条大小一致的条带(图S1B). 同样，多个组织（大脑、脊髓、肝脏、皮肤、肌肉、卵巢）的扩张大小也没有明显变化(图1B). 对所有变体使用人类专用探针（Vall）C9ORF72型检测到C9BAC小鼠所有组织中的mRNA转录物(图S1C). 被截断的人类C9ORF72型该基因产生三种转录变体；V1和V3进行重复扩展(图S1A). 针对人类的人类特异性探针C9ORF72型V1、V2和V3 mRNAs在C9BAC小鼠中检测到所有三种转录物的表达水平与其在人类额叶皮层中的丰度相关(图1C). 此外，转基因人类转录物的总水平与内源性小鼠大致相当C9ORF72型人类对照和c9ALS/FTD病例的表达水平(图1C).

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C9ORF72 BAC转基因小鼠的构建、扩增大小和表达谱

（A） 用于产生C9BAC小鼠的细菌人工染色体片段示意图。153.2kb结构包含（从左到右）140.5kb人类基因组DNA上游C9ORF72型，人类C9ORF72型启动子区域，外显子1到部分外显子6带有a（GGGCC）500重复图案C9ORF72型内含子1。黑条表示B中使用的Southern印迹探针的目标区域。（B）用HindIII、SacI和TaqI消化的各种组织提取的基因组DNA的Souther印迹，并用5'-DIG-（GGGCC）进行探测5-DIG-3'DNA探针。约4.4kb和约6.0kb的两条带在6代后大小稳定，代表300和500个重复序列的扩展（也图S1B). 箭头表示非特定带区。（C） 全人类表达的ddPCR分析C9ORF72型非神经疾病对照组、c9ALS/FTD和SOD fALS患者的人类额叶皮层组织中的变体（Vall）、变体V1、V2和V3以及小鼠C9ORF72直系物，以及C9BAC和Ntg小鼠的全脑匀浆（平均值±SEM，n=4，Kruskal-Wallis检验，Mann-Whitney U检验，*p<0.05，ND=未检测到）。（D） 代表寿命的Kaplan-Meier曲线显示，C9BAC小鼠的存活率与Ntg同窝小鼠相比没有显著差异（Ntg n=17，C9BA n=16，Mandel-Cox Log Rank，P=0.971）。（E） 生理学研究表明，运动单位数估计（MUNE）运动单位大小或复合运动动作电位没有显著变化，但肌电图得分略有增加（平均值±SEM，Ntg n=3，C9BAC n=4非配对t检验）。

携带突变基因的小鼠的生存、运动和认知系统正常C9ORF72型基因

对F1代雄性C9BAC小鼠进行老化，以进行表型特征和生存分析。在所有年龄段，C9BAC和对照小鼠都保持健康。与Ntg同窝小鼠相比，C9BAC小鼠的体重趋向于无显著增加(图S1D，Ntg n=17，C9BAC n=15，双向方差分析，Bonferroni的多重比较试验），寿命超过两年。C9BAC和Ntg窝友的存活率无法区分(图1DNtg n=17，C9BAC n=16，Mantel-Cox对数库，P=0.971）。

C9ORF72型突变与ALS和FTD都相关。因此，我们测试了C9BAC小鼠运动系统内的行为和组织学异常。总的来说，C9BAC小鼠在旋转木马性能和握力测试中没有表现出明显的运动障碍。(图S1E-F，Ntg n=17，C9BAC n=15，双向方差分析，Bonferroni多重比较试验）。来自24个月大的C9BAC和Ntg小鼠的L5腹侧神经运动轴突的半薄切片显示了薄髓鞘形成的非典型形态和退行性轴突的一些证据，这在两个年龄组中是可比较的(图S2A). 在24个月大的动物的感觉背神经根或10个月大动物的坐骨神经中未观察到此类变化（数据未显示）。对C9BAC小鼠轴突数量和直径的量化显示没有显著差异(图S2A，Ntg n=3，C9BAC n=4，双向方差分析，Bonferroni的多重比较）。对腓肠肌神经肌肉接头中的轴突和突触后受体进行免疫染色，发现24个月龄C9BAC小鼠的失神经程度与对照组相当(图S2B，Ntg n=4699个NMJ已评估，C9BAC n=4675个NMJ已经评估；双向方差分析）。24个月龄C9BAC小鼠后肢的运动单位数估计（MUNE）记录未检测到MUNE评分、运动单位大小或复合运动动作电位的变化，尽管根据肌电图检测，失神经评分有适度增加的趋势(图1E，Ntg n=3，C9BAC n=4，未配对t检验）。

我们还评估了ALS常见的运动皮层和脊髓的几种病理特征。微胶质增生症或星形胶质增生症的激活没有明显变化(图S2C、E). TDP-43的细胞质定位错误和聚集，均在大多数ALS患者中发现[7，35]在我们的C9BAC小鼠的运动皮层中未检测到(图S2D)我们也没有看到TDP-43或包涵体相关蛋白p62水平的改变(图S2E). 为了评估脊髓内程序性细胞死亡的激活，我们通过Western blotting观察了裂解capase-3的水平；C9BAC和Ntg小鼠的水平没有显著差异(图S2F). 最近的研究表明，患有C9ORF72型-使用经颅磁刺激的ALS[36]. 因此，我们接下来询问新生（P4-P5）C9BAC小鼠的神经元是否表现出改变的电生理特征，靶向运动皮层第5层（L5）的两个主要兴奋性投射神经元进行分析，即包括皮质脊髓神经元在内的锥体束（PT）型神经元和端脑内投射（IT）型神经元，包括皮质神经元[37]

为了比较非转基因对照和C9BAC神经元的内在电生理特性，在急性制备的脑切片上进行了全细胞膜片钳记录(图S2G-J). 在谷氨酸能和γ-氨基丁酸能突触传递阻断剂（NBQX，5μM，AMPA受体拮抗剂；CPP，5μM，NMDA受体拮抗剂和SR95531，10μM，GABA）存在下测试其电生理特性A类受体拮抗剂）。对于PT型神经元，我们发现对照组和C9BAC神经元的静息膜电位、输入电阻、凹陷幅度或动作电位特性没有显著差异(图S2G，表1). IT型神经元的结果相似(图S2I，表1). 为了比较不同基因型神经元的内在兴奋性，我们用一系列去极化电流步骤诱发动作电位。我们发现两种PT类型(图S2H)非IT型神经元(图S2J)对照组和突变组神经元之间的流变酶或电流脉冲频率关系存在显著差异。这些结果表明，新生C9BAC小鼠运动皮层L5投射神经元的电生理特性没有改变。

接下来，我们调查了FTD中常见的病理学发现。在前额叶皮层（PFC）或海马中未检测到胶质增生激活(图S3A-B). 因为在FTD的啮齿动物模型中描述了社会互动行为的变化[38，39]，我们测试了C9BAC和Ntg小鼠对入侵小鼠的反应。在18-22个月大的C9BAC雄性小鼠与一只不熟悉的幼年雄性小鼠之间的相互作用期间未检测到任何缺陷(图S3C，Ntg n=7，C9BAC n=9，未配对t检验）。高尔基体制剂的定量研究表明，老龄C9BAC小鼠PFC第2-3层锥体神经元顶树突的树突棘密度没有变化(图S3D).

与非转基因同胞相比，C9BAC小鼠PFC的基因表达谱没有变化

据报道，在其他重复性疾病中，多个小的核内RNA病灶的存在干扰了某些RNA结合蛋白的功能及其靶RNA转录物的正确处理[40]. 人类成纤维细胞和诱导多能干细胞（iPSC）衍生的运动神经元中的基因表达发生了改变C9ORF72型ALS患者[12，33，34，41]c9ALS患者小脑中剪接和聚腺苷酸化谱发生改变[42]. 要确定特定C9ORF72型RNA图谱可以在我们的C9BAC转基因小鼠中确定，我们对五只六个月大的不同C9BAC小鼠和三只同窝对照小鼠的额叶皮层提取的总RNA进行了测序。对于每个样本，至少有2500万个读数映射到小鼠基因组的唯一位置（版本mm10）。所有基因表达值的层次聚类未能显示出五只C9BAC小鼠与其同窝对照组相比的独特RNA图谱。对差异表达基因的统计分析没有发现两组之间有任何变化，包括在iPSC-derived运动神经元中鉴定为差异表达的几个基因([12，34],图S3E-H).

C9BAC小鼠再现了人类的组织病理学特征C9ORF72型ALS-FTD公司

尸检时，c9ALS/FTD患者的大脑显示出一些在其他形式的家族性和散发性ALS或FTD中未检测到的组织病理学特征：（i）感觉转录核和偶发细胞质RNA病灶，（ii）反义转录核RNA病灶和（iii）通过正反义转录物的RAN翻译生成DPR蛋白。我们使用了荧光就地杂交（FISH）检测C9ORF72型C9BAC小鼠脑和脊髓的正反义病灶(图2). 3个月大时检测到核内、感觉病灶（数据未显示），10个月和24个月时在整个CNS中大量存在(图2A). 病灶可在c9ALS/FTD相关区域检测到，包括运动皮层内外锥体层核团和腰椎脊髓腹角运动神经元。在整个大脑的神经丝状H阳性神经元中检测到感觉病灶(图2B)，皮层胆碱能神经元(图2C)并激活整个大脑的星形胶质细胞(图2D). 在10个月龄和24个月龄的小鼠中也检测到反义灶。然而，与感觉病灶相比，反感病灶在整个大脑中分布更稀疏(图2A). 外锥体层细胞核内病灶数量的量化(图2E)和脊髓运动神经元(图2F)结果显示，大多数病灶阳性核含有1至5个可检测的感观病灶，但在某些情况下，单个核内的病灶数超过20个。在10到24个月期间，含有病灶的细胞核数量有减少的趋势，在运动皮层外锥体层达到统计学意义（10个月，n=3821个核被评估，55.2%±2.3%；24个月，n=3845个核被评定，43.7%±0.6；双向方差分析，Bonferroni多重比较，p<0.05），但不包括脊髓运动神经元（10个月，n=3，评估124个核，78.5%±4.7%；24个月，n=3，100个核，评估63.9%±9.8%，n=3；双向方差分析）。

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C9BAC小鼠重述了C9ORF72型ALS和FTD患者

（A） 荧光就地使用Cy3标记的DNA探针进行杂交，以对抗感觉和反感异常扩增C9ORF72型转录本（红色=探针，蓝色=DAPI核染色）。这个C9ORF72型在24个月大的C9BAC小鼠的整个大脑，包括运动皮层内锥体层和内颗粒层，以及腰椎运动神经元中，含有感觉或反感觉转录物的重复序列形成核内RNA内含物或病灶。FISH结合细胞类型特异性免疫染色显示神经丝重阳性神经元（B）、胆碱乙酰转移酶（ChAT）阳性锥体神经元（C）和GFAP阳性星形胶质细胞（D）中的有义转录物病灶。10个月龄和24个月龄C9BAC小鼠运动皮层内锥体层（E）和腰椎运动神经元核（F）的每核感觉转录焦点数量均减少（平均值±SEM，双向方差分析，Bonferroni多重比较*p<0.05，**p<0.001）。（G） 通过免疫分析对4个月龄和24个月龄C9BAC小鼠中枢神经系统和肝脏各区域以及C9ALS病例额叶皮层中的可溶性多聚（GP）蛋白进行定量（平均值±SEM，C9BAC-组n=3，C9ALS n=6，双向方差分析，Bonferroni多重比较，*p<0.05，***p<0.001）。（H） C9BAC小鼠皮层多聚（GP）蛋白的免疫染色。染色显示，在10个月大时，整个大脑中都存在小的核周包涵体，在24个月大的小鼠中观察到的数量显著增加。在年龄匹配的Ntg小鼠中未观察到此类内含物。比例尺A-D=10μm，H=20μm。

因为正反义都有C9ORF72型C9BAC小鼠中存在转录物，我们接下来使用夹心免疫分析法检测由正转录物和反义转录物合成的聚甘氨酸脯氨酸（poly（GP）），以寻找RAN翻译产物的证据。将4个月龄和24个月龄Ntg和C9BAC小鼠的组织以及6例c9ALS病例的额叶皮层在含有2%SDS的缓冲液中均质，并分析洗涤剂可溶部分的聚（GP）含量。4个月大时，在C9BAC小鼠的整个大脑中检测到多聚物（GP），其中小脑中的含量最高，脊髓、坐骨神经和肝脏中也检测到了多聚物(图2G). 尽管4个月大的小鼠中poly（GP）水平的平均浓度低于c9ALS额叶皮层中观察到的浓度（4个月龄的C9BAC 55.2±10.9ng/mg蛋白质，n=3；人类c9ALS152.4±43.1ng/mg蛋白，n=6），但4个月的C9BA平均值确实在患者组最低样本的范围内(图2G). 24个月龄C9BAC小鼠的所有组织均显示SDS-soluble poly（GP）水平显著降低（4个月龄皮层55.2±10.9ng/mg蛋白质，n=3；24个月期皮层19.4±4.7ng/mg蛋白，n=3；双向方差分析，Bonferroni多重比较，p<0.05）。可溶多聚物（GP）含量下降的一个假设是，这种DPR蛋白的溶解度随着年龄的增长而降低。对10个月龄和24个月龄C9BAC小鼠的脑组织进行免疫染色，发现存在多聚（GP）染色的小核周包涵体(图2H). 这种包涵体遍布大脑，包括皮层、小脑和纹状体。在24个月大的小鼠中，观察到内含物在受影响的大脑区域中的频率增加，这表明不溶性多聚物（GP）物种的沉积增加。

接下来，我们测试了C9BAC小鼠的神经元是否对细胞应激过敏。在之前的一项研究中，从FTD患者的诱导多能干细胞（iPSCs）分化出来的神经元对自噬抑制所诱导的细胞死亡的敏感性增加在体外[33]. 我们从C9BAC和非转基因同窝胚胎建立了初级皮层神经元培养。10天在体外（DIV）包含正反义的两个核焦点C9ORF72型己核苷酸扩增转录物(图3A)检测到多聚（GP）RAN翻译产物(图3B). 我们用两种自噬抑制剂氯喹处理了来自单个胚胎的15种DIV初级皮层神经元培养物(图3C)和3-甲基腺嘌呤。这两种化合物增加了C9BAC和Ntg神经元的细胞死亡，其程度与LDH测定结果相同（两个独立实验，单个胚胎培养；C9BACn=6，Ntg n=5，双向方差分析，Bonferroni的多重比较）。

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C9BAC小鼠和初级皮层神经元中C9ORF72的沉默

（A） 培养10天的C9BAC胚胎皮层神经元中检测到正反义病灶在体外（DIV）。这些病灶在RNase治疗后不可见，在Ntg神经元中，或通过针对强直性肌营养不良相关的1型（CTG）n或2型（CCTG）n扩张的探针（DM1和DM2，标尺=5μm）未检测到。（B） ●●●●。通过ELISA测定来自单个C9BAC或Ntg同窝胚胎的培养皮层神经元中聚（GP）的浓度（平均值±SEM，未配对t检验，Ntg n=2，C9BACn=6，未配对t检验）。（C） 来自单个C9BAC和Ntg胚胎的培养皮层神经元对自噬抑制剂氯喹或3-甲基腺嘌呤的反应没有显著差异（两个独立实验，单个胚胎培养；C9BACn=6，Ntg n=5，平均值±SEM，双向方差分析，Bonferroni多重比较，*p<0.05）。（D） 所有转录本的ddPCR分析C9ORF72型（Vall）在两个独立实验中相对于HPRT（实验1。单个胚胎n=4，平均值±SEM，单因素方差分析，Bonferroni多重比较试验，*p<0.05，***p<0.0001；实验2。混合胚胎培养，n=3，单因素方差分析，Bonferroni多重比较试验***p<0.001）。（E） rAAV-GFP-miRC9成熟microRNA产物水平（归一化为snoRNA135）与C9ORF72型相对于实验1（黑色）和实验2（蓝色）的rAAV-GFP。（F） 通过ELISA定量两个独立实验（实验1）培养的初级皮层神经元的聚（GP）水平。单个胚胎n=2，平均值±SEM，单因素方差分析；实验2。混合胚胎培养，n=3，单因素方差分析，Bonferroni多重比较试验，**p<0.001）。

沉默C9ORF72转录物和聚（DP）生产在体外

尽管C9BAC小鼠缺乏认知或运动缺陷，但它有力地重述了c9ALS/FTD的分子病理学，三者的表达都很容易量化C9ORF72型转录物、RNA焦点和至少一种聚（DP）RAN翻译产物。这两个读数都依赖于C9ORF72型基因转录本。因此，我们测试了一种基因治疗方法来沉默C9ORF72型在我们的C9BAC小鼠中转基因。我们制备了重组腺相关病毒（rAAV）血清型9，表达靶向人类第三外显子的人工微RNA（miR）C9ORF72型在CB启动子和CMV增强子（rAAV-GFP-miRC9）的转录控制下。对于对照组，使用只表达eGFP报告子的载体（rAAV-GFP）。我们在DIV4初级皮层神经元培养中进行了两组实验(图3D、E、F). 在第一个实验（实验1）中，从同一窝C9BAC小鼠的单独C9BAC-半合子胚胎中产生单个培养物；在第二个实验（实验2）中，将C9BAC窝产的所有转基因胚胎汇集在一起，从多个转基因胚胎中产生混合的皮层神经元。在这两个实验中，GFP控制载体的单独表达和一些细胞死亡共同降低了转基因转录物和多聚（GP）；为了解释这种非特异性沉默，所有沉默结果均归一化为GFP对照。在所有实验中，我们始终观察到C9ORF72型表达microRNA组的产物。相对于rAAV-GFP组，C9ORF72型mRNA转录(图3D)rAAV-GFP-miRC9使单个胚胎培养物（实验1）中的表达减少了35%（n=4，单向方差分析，Bonferroni的多重比较，p<0.05），而实验2的合并胚胎培养物中的表达降低了24%（无统计学意义；n=3，单向方差计算，Bonferoni的多元比较）。我们仅在rAAV-GFP-miRC9处理的培养物中检测到成熟的miRNA，并发现其水平与相应培养物中沉默百分比之间存在相关性(图3E). 在来自单个胚胎的两种培养物（实验1）中，rAAV-GFP-miRC9将聚（GP）水平降低了约60%(图3F). 在混合培养（实验2）中，聚（GP）比GFP减少73%。虽然通过单因素方差分析（n=3，Bonferroni多重比较检验）不显著，但我们注意到，在实验2中，rAAV-GFP与rAAV-GFP-miRC9的统计检验（独立于未治疗组）检测到多聚物（GP）水平的统计显著降低（未配对t检验，p=0.0008）。

讨论

在非编码区发现了一个扩展的GGGCC重复序列C9ORF72克在ALS和FTD共同遗传的家族中，ene定义了共同的分子病理学，是这两种疾病的基础。突变的机制C9ORF72型细胞毒性基因尚不清楚，但可能包括C9ORF72型基因、RNA扩增区产生的毒性以及DPR蛋白的不利影响。了解GGGCC-expanded病理功能的一种方法C9ORF72型是为了研究这种分子缺陷在体外和体内模型系统。据报道，有几个这样的模型系统，包括iPSC[12，33，34，41]，无脊椎动物模型，如蠕虫秀丽隐杆线虫和果蝇[13，27，29，31]，斑马鱼[32]，老鼠缺少C9ORF72型基因同源物[43]或表达GGGGCC重复序列的外源递送通道[44]. 我们在这里报道了一种新的转基因小鼠系，其中含有一部分人类C9ORF72型具有扩增的GGGGCC重复基序的基因。这些大约500和300个图案的重复代表了该模型中的稳定插入；它们在至少六代人中的大小没有变化，也没有显示出代际预期的证据。

尽管小鼠没有出现任何明显的运动表型，但它们概括了c9ALS/FTD患者的独特组织病理学特征，包括有义和反义核内RNA病灶以及RAN翻译的DPR蛋白的存在。这些数据表明，300-500个GGGGCC重复序列基序足以产生和沉积RNA和DPR蛋白的异常束，但不会导致神经退行性变。为什么会出现这种情况尚不清楚。可能这种病理学在分子水平上看得很清楚，不足以损害小鼠寿命内运动神经元的活性。一个推论是，病理性RNA或DPR蛋白的高水平表达可能需要诱导神经退行性表型。支持这一观点的是最近的一份报告C9ORF72型通过产后分娩介导的转录物（GGGCC）60重复与运动神经元功能障碍相关（但不是麻痹表型）[44]. 或者，可能需要模型的其他方面。例如，如果人类的病理学需要通过核内RNA聚集体隔离关键RNA结合蛋白，那么这些蛋白可能在小鼠体内更丰富，因此不太容易因RNA焦点的不足而被滴定。或者，DPR蛋白在小鼠中以某种方式具有更好的耐受性。例如，在患有c9ALS/FTD的人中，有一种观点认为，体内己二核苷酸的扩增会导致功能丧失C9ORF72型可能增强RNA焦点和DPR蛋白引起的病理；在我们的C9BAC转基因小鼠中，由于两种内源性小鼠C9ORF72型正交等位基因是完整的。最后，可能还有其他一些特定于物种的原因，导致GGGCCC在小鼠中的毒性基本上不如人类明显[45].

这些小鼠的组织学发现的两个方面令人感兴趣。首先，含有感观焦点的细胞明显多于反感观RNA焦点的细胞。这与人类大脑皮层的数据大致相似[18]. 也可以想象，反义RNA病灶的相对缺乏反映了我们小鼠中人类BAC的结构，其中包含完整的5'宽的C9ORF72型但该位点仅通过外显子1-6延伸，因此可能缺乏产生反感病灶所必需的3'调控区。C9BAC小鼠还感兴趣的是RNA焦点丰度和可溶性RAN翻译聚（GP）蛋白水平的年龄依赖性变化。我们的数据表明，核内病灶的数量包括C9ORF72型RNA感应转录物在10到24个月之间下降。10个月时，这些病灶广泛分布于整个中枢神经系统的神经元和胶质细胞。10至24个月大的婴儿RNA病灶频率适度但具有统计学意义的下降可能反映了多种因素，包括这些病灶清除率随年龄增长而增加，攻击性转录物随着年龄增长而减少，或含有病灶的细胞丢失。

聚（GP）DPR蛋白的性质也发生了年龄相关的变化。在4个月龄的C9BAC小鼠中，SDS-可溶性多聚物（GP）的浓度与某些c9ALS患者额叶皮层中检测到的浓度相当。24个月龄C9BAC小鼠的可溶性多聚物（GP）水平较低，这一变化与多聚物阳性内含物数量的增加相一致，表明可溶性多聚体（GP。聚（GP）从可溶部分向不可溶部分的年龄相关转变的原因尚不清楚，但可能反映出聚（GP）的积累达到了成核和聚集形成所需的临界阈值。

我们的RNAseq分析并没有定义一个转录组表达谱来区分C9BAC和野生型大脑。这项观察对比了两份iPSC衍生运动神经元基因表达差异模式的报告C9ORF72型六核苷酸扩增[12，34]. 这些数据集的差异可能是因为所分析的组织存在根本差异：我们的研究在6个月大时使用了整个小鼠额叶皮层，而早期的研究基于在体外发育上相当于胚胎运动神经元的运动神经元。或者，通过从C9BAC小鼠翻译核糖体亲和纯化等技术对细胞类型特异性转录组进行详细研究，可能会揭示C9BAC运动神经元中有意义的转录组图谱，而这些图谱在全脑分析中并不明显。

最后，我们注意到，尽管C9BAC小鼠没有出现明显的异常行为表型，但其组织病理学和转录变异表达谱与c9ALS/FTD患者的表现很匹配。In successful（成功）在体外实验[12，34，41]，的C9ORF72型用反义寡核苷酸（ASO）治疗后，表达降低。在本研究中，我们进行了一项原理验证实验，以测试靶向第3外显子的microRNA（miR）是否C9ORF72型重组腺相关病毒（rAAV）可能提供另一种治疗策略。通过这种干预，C9BAC转基因小鼠的初级皮质神经元培养物显示出一种一致的趋势，即C9ORF72型多聚（GP）DPR的转录物和产量降低。这些研究表明，这种策略（AAV介导的合成miR递送）值得进一步研究，并证明这些C9小鼠将有助于评估沉默转录或RAN在扩展的GGGCC重复序列中的翻译，或以其他方式抑制RNA焦点和DPR蛋白形成的治疗方法。结合精确的分析技术来量化异常RNA转录物、RNA焦点和DPR蛋白的水平，C9BAC小鼠将在研究C9ORF72型-介导的神经变性和急需的治疗方法。

实验程序

C9ORF72转基因小鼠的制备

BAC文库是从一名来自C9ORF72链接ALS/FTD谱系。使用携带153.2kb基因组DNA片段的BAC生产转基因动物，该基因组DNA片段包括C9ORF72型，第1外显子到第6外显子C9ORF72型基因，包括短亚型V1的部分3'UTR和外显子1和2之间非编码区的~500个GGGGCC基序。小鼠以SJL/B6为背景。在49只阳性动物中，环形构造注射产生了3只；其中一种（C9BAC）导致了种系传播。使用正向引物5‘TTA ATT TCC TAC CCC TGC CC 3’和反向引物5’AGG CCT TGA CAA ATG TAG CC 3’检测C9BAC转基因的存在，扩增250bp片段。用于纵向生存和行为测试的F1雄性被单独饲养。马萨诸塞大学医学院动物护理和使用委员会批准了所有涉及动物的实验。

电生理记录

小鼠电生理记录如所述[46]. 有关全细胞皮层神经元记录的更多详细信息和描述，请参阅补充实验程序.

滴滴数字PCR（ddPCR）

在使用Trizol（美国生命技术公司）提取总RNA之前，在gentleMACS解离器（美国Miltenyi Biotec）中对冷冻组织样品进行均质化。使用随机六聚体和MultiScribe逆转录酶（Life Technologies公司的高容量RNA-to-cDNA试剂盒）对cDNA进行逆转录。使用ddPCR Supermix对QX100滴滴数字PCR系统进行ddPCR。

RT-qPCR

在使用Trizol（Life Technologies）提取总RNA之前，在gentleMACS解离器（美国Miltenyi Biotec）中对冷冻组织样品进行均质化。使用随机六聚体和MultiScribe逆转录酶（Life Technologies公司的高容量RNA-to-cDNA试剂盒）对cDNA进行逆转录。

聚（GP）免疫测定和免疫染色

聚（GP）二肽的免疫分析已按出版[47]. （详细信息请参阅补充实验程序). 为了进行免疫染色，从福尔马林固定的石蜡包埋块上切下八个微米厚的小鼠半脑矢状切片，并将其安装在玻璃载玻片上。干燥后，将载玻片脱蜡并在二甲苯和酒精洗涤中再水合，然后在1X Tris–EDTA（pH 9）缓冲溶液中蒸30分钟，用于抗原回收。所有载玻片均在Dako Autostainer上用Dako EnVision™+系统和3'3-二氨基联苯胺显色剂进行处理。用抗GP血清（1:10000）染色后[23]，用勒纳苏木精对载玻片进行复染，并用Cytoseal永久性安装介质覆盖玻片。

人体组织

根据健康保险便携性和责任法案指南，通过ELISA分析从佛罗里达州杰克逊维尔梅奥诊所的神经退行性疾病大脑库中获取冰冻额叶皮层组织，以检测多聚物（GP）。梅奥诊所按照梅奥诊所机构审查委员会批准的方案运作。用于ddPCR的冷冻额叶皮层组织从加州大学洛杉矶分校人脑和脊髓液资源中心和马萨诸塞大学获得，并根据UMMS机构审查委员会批准的方案收集。

RNA荧光原位杂交（FISH）

将冰冻切片在55℃下与C9orf72有义（GGCCCC）和无义（GGGCC）转录本的DNA探针杂交过夜，并带有Cy3 5'末端标记。运动皮层外锥体层和腰椎脊髓运动神经元中的感觉焦点被量化。对于FISH结合荧光免疫组织化学，用一级抗体对切片进行免疫染色，然后用Alexa Fluor-488结合的二级抗体进行免疫染色。

RNA序列

对6个月大的C9BAC小鼠及其同窝Ntg小鼠的额叶皮层组织进行RNA测序（参见补充实验程序).

MicroRNA的设计和克隆

基因外显子3中的22-核苷酸人工miRNA（靶向序列AATGCAGAGAGTGGTGCTATA）C9ORF72型该基因被设计并克隆到miR-155主干中。在带有CMV增强子的鸡β肌动蛋白（CB）启动子的控制下，将人工miR克隆到编码AAV前病毒质粒的GFP的3'UTR中。质粒用于包装假型rAAV9载体。质粒和载体可在网址：http://www.umassme.dedu/muellerlab

补充材料

供应商

单击此处查看。（1.0M，pdf格式）

致谢

作者感谢ALS协会，该协会资助了这些C9BAC小鼠的产生，以及ALS/FTD ALS遗传学联合会（Lucie Bruijn、Bob Brown、Jonathan Haines、Chris Shaw、Teepu Siddique、Peggy Vance），该联合会提供了C9ORF72型本研究中使用的BAC。我们感谢Pin-Tsun Lee在行为测试方面的帮助；麻省大学医学院电子显微镜核心设施和麻省大学生物信息学核心提供援助；徐左上和杨春星慷慨提供TDP-43蛋白抗体。

资金来源

这项工作得到了美国国立卫生研究院/美国国家神经疾病和中风研究所的支持[R01NS088689（RHB，LP，CM，OMP），R21NS089979（TFG），RO1 NS057553（F-BG），R11NS084528（LP），R01NS063964（LP）；R01NS077402（LP）、P01NS084974（LP）（LP）和RO1FD004127（RHB），RO1NS079836（RHB，美国国家环境健康服务研究所[R01ES20395（LP）]、国防部[ALSRP AL130125（LP）]梅奥诊所基金会（LP）、梅奥个体化医学诊所中心（LP），ALS协会（RB，LP，TFG），约翰·霍普金斯大学罗伯特·帕卡德ALS研究中心（LP，F-BG），Target ALS（LP，JK，SPB），ALS治疗联盟（F-BG，RHB）、赠款OD018259（CM）、天使基金（RHB）和ALS项目（RHB。HT是由ALS协会资助的Milton Safenowitz博士后研究员。OP由迈克尔·福克斯基金会支持。JK得到了韩国国家研究基金会（NRF-2011-357-E00005）的支持。SPB由神经科学领域的Klingenstein-Simons奖学金资助。PS由霍华德·休斯医学研究所研究员H.Robert Horvitz博士赞助。

脚注

作者贡献

概念化：RHB、OMP、CM、GTC、HRH。方法：RHB、OMP、SPB、GTC、CM、CJ、PdJ、LP、TFG、HT、PCS。调查：OMP、GTC、HT、JEM、SPB、JK、ZK、JM、AW、LP、TFG、LD、Y-JZ、JS、NW。资源：KB，DD。写作–原稿：RHB，OMP。写作-审查和编辑：GTC、CM、HRH、F-BG。监督：RHB、OMP、CM、PCS、TFG。资金收购：RHB、CM、LP、HRH。

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