额颞叶痴呆的主要病理特征建模C9ORF72型iPSC-derived人神经元的重复扩增

原代人皮肤成纤维细胞的分离及诱导多能干细胞的产生

皮肤活检被切成小块，放在培养皿上，使成纤维细胞膨胀。细胞保存在补充有10%胎牛血清、1X非必需氨基酸和青霉素/链霉素（100 U/ml）的Dulbecco改良Eagle's培养基中。

如前所述，生成FTD患者特异性iPSC[三，44]. 简而言之，成纤维细胞（8×10⁵每100 mm培养皿）用表达人的逆转录病毒培养物的等体积上清液转导10月3/4日，SOX2标准，KLF4、，和c（c）-MYC公司第二天，取出培养基并用新鲜的病毒上清液替换。首次感染7天后，收集细胞并接种（5×10⁴用丝裂霉素C处理SNL饲养细胞，一天后，用含有4 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的iPSC培养基替换培养基；此后，每隔一天更换一次培养基。病毒转导五周后，收集菌落，转移到涂有Matrigel（BD Biosciences）的12孔板上，并在mTeSR1培养基中培养（StemCell Technologies）。为了进行扩张，细胞在室温下用1:2 accutase/PBS溶液分离1分钟，用PBS洗涤两次，然后用细胞提升器刮到mTeSR1培养基中。较大的菌落通过移液管进一步破碎并转移至6孔板。

神经元分化与免疫细胞化学

人类iPSC细胞系的神经分化和有丝分裂后神经元的免疫细胞化学如下所述[三].

对于神经元分化，iPSC菌落用accutase（Millipore）分离，并在不含碱性成纤维细胞生长因子的iPSC培养基中悬浮培养5-6天，形成类胚体（EB）。EB被允许连接并形成玫瑰花结。收集10天龄的玫瑰花结，作为神经球悬浮生长。3–4周后分离神经球，将细胞放在玻璃盖玻片（BD Biosciences）或涂有聚乙烯的平板上-天-赖氨酸（0.1 mg/ml）和层粘连蛋白（10μg/ml）。培养2-4周后使用神经元。

为了进行体外分化，如上所述生成EB，悬浮培养8天，放置在Matrigel-coated玻璃盖玻片上，并在mTeSR1培养基中进一步分化8天。通过荧光显微镜（Olympus IX-70显微镜）对从附着的EB中移出的细胞进行染色和分析，以获得三个胚层的标记。核型分析在UMASS Memorial细胞遗传学实验室（马萨诸塞州伍斯特市）进行，使用标准的G-分带方案。

对于免疫细胞化学，细胞在4%多聚甲醛（pH 7.4）中固定10分钟，并用0.2%Triton X-100渗透。用3%牛血清白蛋白封闭30分钟后，将细胞与一级抗体在室温下孵育1小时或在4C下过夜。主要抗体为山羊抗Nanog（R&D Systems；1:100）、小鼠抗SSEA4（Abcam；1:100，兔抗VGLUT1（Synaptic Systems；1:500）、兔抗GABA（Sigma；1:100）、兔反酪氨酸羟化酶（Millipore；1:500，兔抗TDP43（蛋白质技术组；1:100）、兔抗FUS（蛋白质技术小组；1:300）、小鼠抗核磷蛋白（Abcam；1:3000）。用PBS清洗三次后，在室温下用Alexa荧光剂结合的二级抗体（Invitrogen；1:300）培养细胞1小时，并用1μg/ml Hoechst或DAPI进行复染。用荧光显微镜检查免疫染色细胞。

电生理学

将贴在盖玻片上的神经元（培养3-4周）安装在直立显微镜（BX51WI，奥林巴斯）上。将神经元浸泡在pH 7.4的含氧细胞外溶液中，该溶液含有：125 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.2 mM NaH₂人事军官₄，1.2 mM氯化镁₂，2.4 mM氯化钙₂，26 mM氯化钠_三，11毫米天-葡萄糖。神经元通过红外（IR）差分干涉对比视频显微镜和IR-CCD相机（奥林巴斯）进行视觉识别。在室温下，分别使用电流或电压灯模式下的多灯700B补丁灯放大器（分子器件）的全细胞配置记录去极化激发动作电位和自发EPSC。贴片移液管和细胞外溶液之间的连接电位在神经元膜上获得密封之前被抵消。内含内吸管溶液：121 mM KCl，4 mM MgCl₂，11 mM EGTA，1 mM CaCl₂、10 mM HEPES、0.2 mM GTP和4 mM ATP。使用放大器的四极低通贝塞尔滤波器以2 kHz的频率对信号进行滤波，通过Axon Digidata 1440 A接口以10 kHz的速度对信号进行数字化，并将其存储在个人计算机上。通过重力灌注将含有或不含CNQX（10μM）或TTX（0.5μM）的细胞外溶液施加到神经元上。

qRT-PCR和northern印迹

按照制造商的说明，使用RNeasy试剂盒（Qiagen）分离总RNA，并使用TaqMan逆转录试剂盒（Applied Biosystems）将500 ng RNA逆转录到cDNA。定量PCR使用SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems）和10μM正向和反向引物或TaqMan基因表达主混合物和TaqMan引物进行(C9ORF72型变体1，应用生物系统）。将每个样本和基因的Ct值标准化为GAPDH公司基因。采用2exp（−ΔΔCt）法测定各基因的相对表达。本研究中使用的引物见表S1。如前所述，对转基因沉默进行分析[三].

对于northern blot分析，将总RNA（2-5μg）装入含有1.8%甲醛的0.8%琼脂糖凝胶中。通过毛细管印迹将RNA转移到带正电荷的尼龙膜（Roche）上，并通过紫外线辐射交联。识别三者的探针C9ORF72型用T7 RNA聚合酶（Roche）从用特异性引物PCR获得的cDNA合成亚型（表S1）。化学合成特异性检测V2和V3亚型的RNA探针，并对其进行5′修饰以添加Dig标记（序列见表S1）。在62°C下过夜进行杂交。

Southern印迹

按照说明进行Southern blot分析[12]稍作修改。简单地说，基因组DNA（10μg）用Xba公司一、 在0.8%琼脂糖凝胶上通过电泳分离，转移到带正电荷的尼龙膜（罗氏应用科学公司），通过紫外线交联，并在47°C下与地高辛标记的PCR探针杂交过夜。使用特定引物（表S1）和PCR DIG探针合成试剂盒（Roche）从基因组DNA中扩增676 bp探针。探针在95°C下变性5分钟，并添加到杂交混合物中（EasyHyb颗粒，罗氏）。按照制造商（Roche）的建议，使用抗地高辛抗体和CDP-Star试剂检测地高辛标记探针。

荧光原位杂交

使用Cy3-共轭（GGCCCC）进行FISH₄或（CAGG）₆寡核苷酸探针。简言之，将玻璃盖玻片上的细胞在4%多聚甲醛中固定20分钟，在4°C下在70%乙醇中渗透，在室温下与40%甲酰胺/2X SSC孵育10分钟，并在37°C下与Cy3-共轭（GGCCCC）杂交2小时₄探针（16 ng/ml）位于杂交缓冲液中，该混合缓冲液由40%甲酰胺、2X SSC、10%硫酸右旋糖酐、酵母tRNA（1 mg/ml）和鲑鱼精子DNA（1 mg/ml）组成。细胞在37°C下用40%甲酰胺/1X SSC洗涤一次30分钟，在室温下用1X SSC洗涤两次30分钟。对于RNase A实验，固定后，细胞在室温下与24μg/ml RNase A孵育20分钟。

应激诱导毒性和caspase-3活性测定

将两周大的神经元暴露于：膜霉素、鱼藤酮、星形孢菌素、氯喹、3-甲基腺嘌呤或二甲基亚砜24小时。如前所述测定细胞活力和caspase-3样活性[三]. 细胞活力值表示为未处理的细胞或用DMSO处理的细胞的百分比（对照），并且胱天蛋白酶样活性计算为高于对照（未处理的细胞）的增加。

蛋白质印迹

用SDS-PAGE分离15微克蛋白质，然后用小鼠抗p62抗体（1:500，BD Biosciences）、小鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，1:3000，Millipore）和HRP-结合的抗小鼠第二抗体（1:5000）进行免疫印迹。免疫印迹由SuperSignal West Pico化学发光底物（Thermo Scientific）开发。

小鼠脑裂解物中GGGGCC结合蛋白的提取

将300μg小鼠大脑核提取物通过体外转录和生物素化（Biotin 11 CTP，Perkin Elmer）（GGGCC）₃₀在20 mM Hepes、300 mM NaCl、2 mM MgCl2、0.01%NP40、1 mM DTT和蛋白酶抑制剂（PIC，Roche）存在下，RNA与链霉亲和素涂层磁珠（Dynabeads M-280链霉亲和素，Invitrogen）结合。在4–12%SDS-PAGE（NuPAGE 4–12%Bis–Tris Gel，Invitrogen）分离和银染色（SilverQuest，Invit罗gen）之前，用结合缓冲液清洗带有固定化RNA及其结合蛋白的磁珠三次，并通过煮沸样品内缓冲液3分钟洗脱结合蛋白。使用NanoESI_Ion Trap（LTQ XL Thermo Fisher Scientific）消解并鉴定蛋白质带。

RAN翻译产品检测

按照Winton等人的描述，连续提取神经元细胞颗粒[48]. 人神经细胞颗粒在冷RIPA缓冲液中溶解，并在冰上超声处理。然后在4°C下以100000 g离心30分钟，清除细胞裂解物。收集上清液，用BCA法测定蛋白质浓度。为了防止携带，将产生的颗粒重新悬浮在RIPA缓冲液中，重新浸泡和离心。然后使用7M尿素缓冲液（缓冲液体积根据RIPA可溶样品的蛋白质浓度调整）提取RIPA不溶性颗粒，在10万g下进行超声处理，并在22°C下离心30分钟。尿素可溶性上清液的蛋白质浓度通过Bradford试验测定。将两微克尿素可溶样品直接点在硝酸纤维素膜上，然后干燥、封闭，最后用抗GP兔多克隆抗体进行检测。通过用C-Ahx-GPGPGPGP酰胺免疫兔子产生抗GP抗体。抗体的特异性通过免疫分析和使用前面描述的方法通过Western blot进行验证[7]. 首先，在Tris缓冲盐水（TBS）中稀释（GP）8肽或（GR）8肽类（阴性对照），并将其添加到96周中尺度发现（MSD）分析板的重复孔（30μl/孔）中。在4°C下培养过夜后，用含有0.2%吐温20（TBSTw）的TBS清洗微孔，并用TBSTw+3%的脱脂奶封闭微孔。然后以25μl/孔的速度添加含有抗GP和SULFO-TAG™兔二级抗体的封闭缓冲液。经过2小时的培养和最终洗涤后，通过添加MSD Read Buffer并使用MSD Sector Imager 2400测量电化学刺激后620 nm处的发光，评估抗GP与固定化肽的结合。

对于Western blotting，使用Lipofectamine TM 2000转染HEK293T细胞，将pEGFP质粒插入GP、GR或GA的5个重复序列的寡核苷酸。细胞裂解物通过10%的三甘氨酸SDS-PAGE（Invitrogen）溶解，转移到硝化纤维素膜上，用抗GP进行探测。剥离印迹物并重新制备GFP（Zymed）。对免疫前血清进行肽抗原测试，确认为阴性。

iPSC重编程期间GGGGCC重复不稳定性的证据

在研究表明GGGGCC重复扩增是VSM-20家族和其他FTD/ALS患者的致病突变后[12，39]，我们首先进行了southern blot分析，以确认这两个VSM-20家族成员的皮肤成纤维细胞中存在重复扩张。与其他VSM-20家族携带者淋巴母细胞的结果一致[12]，两个家族成员的成纤维细胞都有野生型（2.3kb）和扩增等位基因（图2). 而来自5名健康和FTD患者的成纤维细胞没有重复扩增，仅在southern印迹上有野生型等位基因（数据未显示）。因此，我们指定了他们C9ORF72型突变携带者。载体1有一条对应约1000个重复的突变带。载体2有三个突变带，估计包含约1600、730和650个重复序列，这表明成纤维细胞的混合群体含有不同长度的重复序列。在本实验和以下所有实验中，使用了来自健康对照组和零星FTD受试者的iPSCs，这些受试者最近已发表[三]. 共济失调蛋白2的CAG重复扩增与某些患者的ALS相关[17]. 我们发现两个携带者的CAG重复数与对照组相似（数据未显示），排除了这些携带者中不同基因普遍重复扩增的可能性。在对成纤维细胞重新编程后，在我们分析的所有iPSCs系中也发现了扩增的GGGGCC等位基因，但在对照iPSCs中没有发现（图2).

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图2

Southern blot分析C9ORF72型成纤维细胞和两个iPSC系（第24代）中的等位基因来自每个个体。此处显示了一个代表性斑点

为了确定iPSC中的重复长度，我们首先比较了成纤维细胞与每个载体的相应衍生iPSC株。对于携带者1，重新编程似乎不会影响第6行的重复长度，因为与扩张等位基因对应的带与成纤维细胞带的大小相同。载体1成纤维细胞和iPSC株6中存在单一的主要重复大小，表明存在一定程度的内在稳定性。然而，在第5行中，重复长度比成纤维细胞中的长度长约200次（图2). 由于Southern blot只能检测到最丰富的物种，并且每个iPSC系都是从单个成纤维细胞克隆而来的，因此第6系最有可能来自一个重复大小更丰富的成纤维细胞，而第5系可能来自重复大小更稀少的成纤维纤维细胞。然而，也有可能是由于iPSC重编程过程中扩增等位基因的不稳定性导致了第5行重复序列长度的改变。后一种可能性得到了来自载体2的iPSC的观察结果的支持（图2). 载体2的第11行与亲代成纤维细胞具有相同的模式和重复长度，而第1行中多条带的重复长度大大缩短。由于单个成纤维细胞仅包含一个具有一个规定重复长度的突变等位基因，因此，与原始成纤维细胞群体具有相似（第11行）或不同（第1行）等位基因组合的iPSCs群体很可能是由于克隆扩展期间扩展等位基因的调节不稳定性而产生的。

利用GGGCC重复扩增将iPSCs分化为功能神经元

iPSC系的神经元分化方案与我们对人类胚胎干细胞的研究相同[13]和progranulin iPSC[三]. 为了建立FTD模型，我们使用该协议从表达端脑标记物BF1（FOXG1）的神经元前体细胞中生成有丝分裂后神经元[29]. 我们没有观察到重复扩增的iPSC与对照组之间的神经元分化潜能有任何明显差异（图三a） ●●●●。在对照组和重复携带者中，神经元标记物微管相关蛋白2（MAP2，约80%）或胶质标记物胶质纤维酸性蛋白（GFAP，<5%）阳性的细胞百分比相似（图三b、 c）。此外，我们确定GGCCCC重复序列的存在是否会影响通过该方案获得的神经元类型。MAP2的30%以上⁺细胞的谷氨酸标记物VGLUT1也呈阳性（图三d） ，<10%的细胞为GABA⁺抑制神经元或TH⁺多巴胺能神经元（图三e、 f）。由于从对照组和重复载体分化的神经元百分比之间没有显著差异，我们得出结论，重复扩增不会显著干扰这种神经元分化过程。

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图3

GGGGCC重复序列不影响iPSC的神经元分化。使用Almeida等人[三]. 核染色显示在蓝色.比例尺50微米(一). MAP-2阳性神经元百分比(b条)和GFAP阳性星形胶质细胞(c（c）)显示了2周龄的培养物。VGLUT1阳性细胞(天)、GABA(e（电子）)和TH(（f）)（谷氨酸能、γ-氨基丁酸能和多巴胺能标记物）被计算为MAP-2的百分比⁺细胞。每个实验平均分析200个细胞(n个=3种独立文化）。数值为平均值±SEM。显示了基线时和涂抹河豚毒素（0.5μM）2分钟后神经元的典型去极化诱发动作电位。动作电位由电流从+400到0 pA以100 pA的步长注入激发(n个=每条线10–14）(克). 基线检查时和应用CNQX（10μM）2分钟后的典型自发EPSCs。神经元在电压灯下保持在−60 mV(n个=每行10–11）(小时)

类似于我们之前对控制神经元的研究[三]，来自GGGGCC重复载体的神经元显示去极化诱发动作电位，可被河豚毒素（TTX）阻断（图三g） ●●●●。此外，这些细胞能够建立功能性突触连接，如CNQX抑制自发AMPA型谷氨酸受体介导的兴奋性突触后电流（EPSCs）所示（图三h） 以及这些神经元树突上存在PSD95点（图S1a）。重复扩增似乎不会影响PSD95 mRNA水平（图S1b）或PSD95点的数量（图S1c）。TTX和CNQX的作用在洗脱后可以逆转（数据未显示）。这些结果表明，有丝分裂后神经元从iPSC分化为C9ORF72型重复扩展是有效的。

接下来，我们研究了多能干细胞神经元分化期间GGGGCC重复序列的稳定性。虽然在已建立的iPSCs的多次传代（从24代到34代）中观察到重复长度几乎没有变化，但在从载体1的iPSC6系分化的神经元中，重复数显著减少到~900（图4b） ●●●●。此外，与载体2的iPSC第11行分化的神经元中出现了一条对应于400个重复的新带（图4c） ●●●●。在这两种情况下，均使用第24代的iPSCs。尽管其他iPSC系在神经元分化期间表现出这种重复不稳定性的程度还有待检验，但神经元分化期间的重复不稳定性可以部分解释两名患有GGGCC重复扩增的FTD患者大脑中重复长度的镶嵌现象（图4d） ●●●●。

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图4

GGGGCC在多能干细胞的神经元分化过程中重复不稳定性。iPSC对照品系20的Southern blot分析(一)，托架1的第6行(b条)，和托架2的第11行(c（c）)在不同的传代及其分化的神经元上。这个星号指出突变体C9ORF72型神经元中的等位基因。一个对照受试者和两个受试者的大脑C9ORF72型重复扩展载体显示不同长度的重复(天)

iPSC-derived人类神经元中存在RNA焦点和RAN翻译产物

在FTD/ALS患者的脑和脊髓神经元亚群中发现了含有GGGGCC重复序列的核RNA病灶C9ORF72型重复扩张，但其他公司未能做到[12，41]. 为了解决这个有争议的问题，我们通过荧光原位杂交（FISH）检测了iPSC和含有GGGGCC重复扩增的人类神经元。首先，我们确认了C9ORF72型iPSCs和iPSC-derived人类神经元中的RNA变体。这些变体的命名遵循PubMed中最新的命名，其中变体1（V1，NM 145005.5）对应于编码截短的C9ORF72蛋白（亚型b）的mRNA，变体2和3（V2，NM018325.3和V3，NM 001256054.1）分别编码全长C9ORF 72蛋白（异构体a）。六核苷酸重复序列位于V2的5′端和V3的第一内含子。我们发现V2和V3在iPSC中表达（图5a–c，图S2）和iPSC衍生的人类神经元（图S26a–c）。与之前的报告一致[12]，V2在重复扩张载体的神经元中的表达略低于两个非载体的神经元（图6b） ●●●●。我们还发现，在northern blot中，iPSCs中未检测到V1或任何较大的异常mRNA物种（图S2）。

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图5

C9ORF72重复扩增在多能干细胞中形成RNA焦点。的表达式级别C9ORF72型变量1({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_145005.5”，“term_id”：“365906241”，“term_text”：“NM_145005.5.5”}}NM_145005.5，亚型b）(一)，变量2({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_018325.3”，“term_id”：“365906242”，“term_text”：“NM_018325.2”}}NM_018325.3号，亚型a）(b条)和变体3({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_001256054.1”，“term_id”：“365906243”，“term_text”：“NM_001256054.1”}}NM_001256054.1号，亚型a）(c（c）)用qRT-PCR对来自两个非携带者和两个扩大重复携带者的iPSC株进行了评估。在对照iPSC株系20上进行荧光原位杂交（FISH）分析(天)，托架1线路6 iPSC(e（电子）)，托架2线路11 iPSC(（f）)使用cy3-共轭（GGCCCC）₄探查。RNA焦点(红色)在原子核中被发现(蓝色)载流子1和2的数量，但不在对照细胞中。固定后用RNase A治疗iPSC导致病灶丢失(小时)，表明病灶确实由RNA构成。来自载体1（第5行）未经处理的iPSC的代表性图像(克)或用核糖核酸酶A治疗(小时)在室温下保持20分钟。红色含有GGGCC重复序列的RNA焦点；蓝色细胞核（DAPI）。当Cy3-共轭（CAGG）时，细胞没有显示病灶₆探针用作阴性对照探针(我).比例尺10微米。iPSC显示焦点百分比的量化(j个)以及每个细胞的平均焦点数(k个)显示为平均值±SEM

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图6

C9ORF72型在患者iPSCs衍生的神经元中，重复扩增形成RNA病灶。的表达式级别C9ORF72型变量1({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_145005.5”，“term_id”：“365906241”，“term_text”：“NM_145005.5.5”}}NM_145005.5，亚型b）(一)，变量2({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_018325.3”，“term_id”：“365906242”，“term_text”：“NM_018325.2”}}NM_018325.3号，亚型a）(b条)和变体3({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_001256054.1”，“term_id”：“365906243”，“term_text”：“NM_001256054.1”}}NM_001256054.1号，亚型a）(c（c）)用qRT-PCR对来自两个非载体和两个扩增重复载体的iPSC-derived神经元进行评估。数值为平均值±SEM***第页<0.001（学生的t吨测试）。对对照iPSC-derived神经元进行FISH分析(天)，载体1线路6 iPSC-衍生神经元(e（电子）)，载体2线路11 iPSC-衍生神经元(（f）)使用cy3-共轭（GGCCCC）₄探查。绿色地图2。蓝色DAPI公司。比例尺10微米。神经元显示病灶百分比的量化(克)以及每个细胞的平均焦点数(小时)基于对来自三个独立分化实验的神经元的分析，以平均值±SEM表示。通过斑点杂交分析在载体1（iPSC株5和6）和载体2（iPSC系1和11）的神经元中检测到Gly-Pro二肽重复序列(我)

自C9ORF72型RNA转录物在iPSCs和iPSC-derived人类神经元中表达，我们接下来确定是否可以检测到包含GGGGCC重复扩增的RNA病灶。使用Cy3缀合物（GGCCCC）₄寡核苷酸探针，我们在载体1的所有iPSC株中检测到了重复RNA焦点（图5e、 显示了来自第6行的代表性图像）和载体2（图5f、 第11行的代表图像）；但在对照iPSC中未检测到病灶（图5d） ●●●●。类似地，这些病灶也在来自载体1的iPSC线6的神经元中检测到（图6e） 和来自托架2的管路11（图6f） 但不在对照神经元中（图6d） ●●●●。我们确认病灶确实是由RNA构成的，因为在RNase处理后，没有发现病灶（图5g、 h）。确认这些病灶针对（GGCCCC）₄寡核苷酸探针，我们使用（CAG）₈与强直性肌营养不良1型（数据未显示）和a型（CAGG）相关的CTG重复序列的探针特异性₆与强直性肌营养不良2型相关的CCTG重复序列特异性探针。iPSC中未检测到病灶（图5i） 或iPSC衍生的人类神经元（数据未显示）。为了进一步证明这些RNA焦点对GGGCC重复扩增携带者是特异性的，我们检测了5名携带者和5名无疾病或其他FTD突变的受试者的原代成纤维细胞。在所有五个携带者的一些成纤维细胞中都发现含有GGGCC重复序列的RNA病灶，但在对照组或FTD患者中由于基因突变而缺失地图或GRN公司（图S3）。

含有GGGCC重复序列的离散和点状RNA病灶大多位于细胞核中。偶尔可以在细胞核外看到一些病灶，如其他重复性疾病[47]. 这些RNA焦点在大小上与PML核体相似，但它们不重叠（图S4）。由于含GGGCC的RNA病灶并不存在于所有多能干细胞或人类神经元中，并且其大小相对较小，因此在这些培养条件下，人类细胞中的这些病灶不太可能通过隔离足够数量的大量表达的核RNA-结合蛋白而损害RNA代谢。事实上，在我们在小鼠脑提取物中发现的与生物素化（GGGCC）结合的前30种RNA结合蛋白中₃₀RNA在体外，8个是hnRNP蛋白。我们发现H1（图S4）和H2（图S5）没有被隔离到病灶中或在多能干细胞中定位错误，尽管短暂过度表达的GGGCC重复序列可以在非生理条件下人工隔离这些蛋白质（图S6）。其他感兴趣的主要RNA/DNA结合蛋白包括FUS、TDP-43、NONO、FMRP、核仁蛋白和核磷蛋白。后两者相互作用，已知与富含G的RNA和DNA G-四链体结合[1，10]. 有趣的是，最近的研究表明，与FTD/ALS相关的GGGCC重复序列形成RNA G-四链体[18，38]. 然而，在iPSCs（图S4、S5）或来自GGGCC重复扩增载体的人类神经元或初级成纤维细胞（数据未显示）中亚细胞分布看似正常的GGGCC-重复序列包含病灶中，核磷蛋白未被隔离。同样，在iPSCs中，FUS、TDP-43、hnRNPA2/B1、hnRNP F和其他RNA-结合蛋白的亚细胞定位没有变化（图S4、S5）。因此，至少在这里使用的培养条件下，这些病灶可能无法隔离足够数量的这些或其他丰富的核RNA/DNA结合蛋白，从而导致它们在这些患者细胞中的错误定位。

未在所有细胞中发现含有重复RNA的病灶。例如，来自载体1第6行的23%的iPSC和来自载体2第11行的68%的iPSCs含有病灶（图5j） ，在一些iPSC中含量丰富，而在另一些iPSC中含量稀少。类似地，来自第6行的29%MAP2阳性神经元和来自第11行的53%的MAP2阳性神经细胞中存在GGGCC重复RNA病灶（图6g） ●●●●。虽然这些重复的长度不能通过实验来控制，但我们幸运地获得了具有不同重复长度的iPSC线（图2). 第6行的重复长度明显高于第1行（图2)但iPSC或有病灶神经元的平均百分比（图5j中，​j、 6克）6g） 以及每个细胞的平均焦点数（图5k、，​k、 6小时）6h） 都是类似的。此外，第5行中的重复长度仅略高于第6行中的长度（图2)然而，有病灶的细胞百分比（图5j、，​j、 6克）6g） 以及每个细胞的平均焦点数（图5k、，​k、 第6页）6i） 第5行比第6行高得多。由于这些细胞是在相同的条件下培养的，我们的数据表明，含有GGGCC重复序列的RNA焦点的形成不仅取决于重复序列的数量，还取决于亲代成纤维细胞和随后的iPSC克隆中的其他遗传或表观遗传因素。

最近的研究表明，双肽重复序列可以在GGGCC重复序列扩增患者的神经元中特异性产生[7，32]. 为了检测C9FTD/ALS的这一主要病理特征是否也能在iPSC-derived人类神经元中复制，我们对从GGGCC重复扩增的人类神经元获得的RIPA不溶性蛋白裂解物进行了斑点杂交分析。生成了一种新的抗Gly-Pro（GP）抗体，并证明了其特异性（图S7）。事实上，我们检测到GP二肽在从载体1的两个iPSC系分化而来的神经元中有非常强的表达，在载体2的神经元中也有少量表达（图6i） ●●●●。重复长度、RNA焦点数量与RAN翻译水平无直接正相关；因此，这两种主要的神经病理学表型似乎独立于重复长度和彼此。

我们感谢患者及其家人，他们的慷慨使这项研究成为可能。我们也要感谢RV。Farese Jr.与加利福尼亚再生医学研究所（RL1-00650 to FBG and RVF）合作，该研究所发起了该项目，S.Ordway提供编辑协助，Gao实验室成员进行讨论。这项工作主要得到了马萨诸塞大学医学院和ALS治疗联盟（FBG）的启动基金的支持，也得到了美国国立卫生研究院的部分支持（NS057553给FBG；AG019724和AG023501给BLM；AG026251、AG17216、NS063964和NS077402给LP），额颞痴呆研究联合会（FBG）和梅奥诊所基金会（LP）。