Functional and pharmacological analysis of cardiomyocytes differentiated from human peripheral blood mononuclear-derived pluripotent stem cells

doi:10.1016/j.stemcr.2014.04.017

.2014年5月29日；3(1):131-41.

doi:10.1016/j.stemcr.2014.04.017。 eCollection 2014年7月8日。

人外周血单核衍生多能干细胞分化心肌细胞的功能和药理分析

迈克尔·里德尔¹, 川洲J Jou², 赖树平¹, 罗伯特·勒克斯^三, 阿隆索·莫雷诺^三, 肯尼思·斯皮策^三, 伊丽莎白·基督教徒¹, 马丁·特里斯坦尼·菲鲁齐², Ivor J本杰明¹

附属公司

¹美国威斯康星州密尔沃基威斯康星医学院心血管中心，邮编53226。
²美国犹他州盐湖城犹他大学医学院儿科心脏科，犹他州83113；Nora Eccles Harrison CVRTI，犹他大学医学院，美国犹他州盐湖城，邮编84112。
^三Nora Eccles Harrison CVRTI，犹他大学医学院，美国犹他州盐湖城84112。

PMID： 25068127
预防性维修识别码：项目经理4110777
内政部： 2016年10月10日/j.stemcr.2014.04.017

人外周血单核衍生多能干细胞分化心肌细胞的功能和药理分析

迈克尔·里德尔等人。干细胞报告. 2014.

.2014年5月29日；3(1):131-41.

doi:10.1016/j.stemcr.2014.04.017。 eCollection 2014年7月8日。

作者

迈克尔·里德尔¹, 川洲J Jou², 赖树平¹, 罗伯特·勒克斯^三, 阿隆索·莫雷诺^三, 肯尼思·斯皮策^三, 伊丽莎白·基督教徒¹, 马丁·特里斯坦尼·菲鲁齐², Ivor J Benjamin（伊沃·J·本杰明）¹

附属公司

¹美国威斯康星州密尔沃基威斯康星医学院心血管中心，邮编53226。
²美国犹他州盐湖城犹他大学医学院儿科心脏科，犹他州83113；Nora Eccles Harrison CVRTI，犹他大学医学院，美国犹他州盐湖城，邮编84112。
^三Nora Eccles Harrison CVRTI，犹他大学医学院，美国犹他州盐湖城，邮编84112。

PMID： 25068127
预防性维修识别码：项目经理4110777
内政部： 2016年10月10日/j.stemcr.2014.04.017

摘要

诱导多能干细胞（iPSC）技术的进步为患者和疾病特异性人iPSC心肌细胞（CM）模型的常规推导奠定了基础，用于临床前药物筛选和个性化药物方法。外周血单个核细胞（PBMC）是体细胞的一个有利来源，因为它们很容易获得并且易于转导。在此，我们报告了PBMC-derived iPSC CM的电生理特性和药理反应通常与来自其他体细胞的iPSC CM相似，使用斑贴灯、钙瞬变和多电极阵列（MEA）分析。来自单个患者的不同iPSC株表现出相似的电生理特征和药理反应。最后，我们证明人类iPSC CM在快速电刺激下发生钙处理特性和基因表达的急性变化，为研究人类快速心律失常的体外靶向模型系统奠定了基础。

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数字

图1
人类外周血单核细胞衍生iPSCs的特征（A）明亮视野中iPSC菌落的代表性图像。比例尺，200μm。（B）多能性标记NANOG、SSEA-4、OCT-4和TRA-1-81免疫染色后iPSC集落的代表性图像。合并的图像还包括DNA的DAPI染色，以显示转录因子和多能性标记NANOG和OCT-4位于细胞核内。比例尺，100μm。（C）实时定量PCR显示的多能性基因表达水平。未分化hiPSC（灰色条）的基因表达水平与未分化人类H9细胞（黑色条）的非常相似。hB53对照组（Co）（未感染的血液单核细胞）几乎没有多能性基因表达水平（白色条）（n=3个独立实验）。误差条，SD。

图2
人PBMC-Derived iPSCs分化为所有三个胚胎生殖层细胞的能力（A）三个胚胎胚层代表基因表达的量化。AFP、GATA4（均为内胚层）、α-MHC、支架（均为中胚层）、β-III微管蛋白和波形蛋白（均为外胚层）的相对表达与来自同一患者的未分化hiPSC有关。误差条，SD（n=4个独立实验）。（B）畸胎瘤，来源于hiPSCs，包括所有三个胚胎胚层的细胞类型。典型图像显示呼吸道纤毛上皮（内胚层）、软骨上皮（中胚层）和色素神经外胚层上皮（外胚层）。比例尺，100μm。

图3
人PBMC-Derived iPSCs产生功能性CMs（A）α-肌动蛋白阳性细胞百分比高。分化后，对细胞进行心脏标记蛋白α-肌动蛋白染色，并用流式细胞仪进行分析。根据hiPSC系，高达87%的细胞α-肌动蛋白阳性（系hB53 hiPS6）。误差条，SD（n=3个独立实验）。（B）肌钙蛋白T-和α-肌动蛋白染色的hiPSC衍生CMs的代表性图像。比例尺，10μm（上面板）和30μm（下面板）。

图4
从CMs中记录的AP与人PBMC-Derived iPSCs分化（A）从显示结、心房和心室样表型的单个心肌细胞中记录的代表性AP。（B）显示三种CM子类型的AP参数的表。CL，循环长度（s）；MDP（毫伏）；Pmax，最大上冲程速度（mV/ms）；APD10、APD50或APD90，APD为复极的10%、50%或90%（ms）。数值为平均值±SEM。^*p<0.05（ANOVA加Bonferroni校正）。除CL外，所有三个亚组的测量参数均不同，其中只有心房和心室样组在统计学上存在差异。表中列出的“n”表示不同于iPSC C1线的CM的独立记录。

图5
使用60电极MEA室（a）测量的hiPSC CM的电生理特性。图左为60电极MEA系统的图像，镀有hiPSC CM单层。叠加在图像上的是在每个电极位置记录的单个电图。左中视图是用于计算ARI的方法学示例。绿色轨迹表示在MEA的一个导联上记录的单次搏动，显示去极化和复极复合物，令人想起QRS波和T波。ARI计算为电压的最小一阶导数（dV/d）之间的时间t吨)去极化波和最大dV/d的时间t吨复极波峰值附近（以黄线为界）。蓝色轨迹表示dV/dt吨复极波曲线，用于确定最大dV/dt吨。中-右视图显示单个MEA站点记录的连续自发搏动的示例轨迹。对每条线索的ARI进行平均，以获得记录期间每个地点的平均ARI值。右视图是在控制条件下以及用10和100 nM多非利特灌注后记录的代表性电图。注意随着多非利特浓度的增加，复极波延长。（B）来自典型MEA室的等时时间图显示了整个阵列的AT（Act）、ARI（APD的替代物）和传导速度（CV）。Act和ARI的报告单位为毫秒。CV的报告单位是厘米/秒。（C）cm从三种不同的iPSC系（C1、C6和C7）分化而来，表现出类似的电生理特性。方框图显示平均值（平方）、SEM（方框）、SD（误差条）和95%置信区间（交叉阴影）。在细胞系内，ARI、周期长度和传导速度无显著差异（n=10-13个独立记录）。

图6
用连续浓度的LIDO、多非他利（DOF）、地尔硫卓（DILT）和胺碘酮（AMIO）灌注不同抗心律失常药物对不同于人PBMC衍生iPSCs的CMs的电生理效应。测量ARI、传导速度和循环长度。^*p<0.05，使用重复测量ANOVA和Bonferroni校正进行计算。CTRL，控制；清洗，冲洗。n=10（LIDO和DOF）和9（DILT和AMIO）独立实验。

图7
快速电刺激降低钙²⁺hiPSC CM（A）代表性Ca的瞬时和Cav1.2表达²⁺使用荧光标记的hiPSC CM（CTRL）记录瞬变，并以1或4 Hz的频率起搏8小时。注意异常的二次钙²⁺衰变阶段释放（插图）。（B）显示钙含量的条形图²⁺瞬态表示为F/F₀和瞬态衰减率（tau，ms）。^*与1 Hz和CTRL相比，p<0.0001。每组10次独立记录。（C）通过RT-qPCR测量的Cav1.2在接受1和4 Hz电刺激的hiPSC CM中的表达。

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