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大脑。2016年5月；139(5): 1417–1432.
2016年3月1日在线发布。 数字对象标识：10.1093/brain/aww028
预防性维修识别码：项目经理4845254
PMID：26936937

热休克反应在TDP-43清除中起重要作用：肌萎缩侧索硬化症功能障碍的证据

Han-Jou Chen先生，1 杰奎琳·米切尔，1 谢尔盖·诺沃塞洛夫，2 杰克·米勒，1 阿格尼斯·西村，1 艾玛·L·斯科特，三 卡罗琳·万斯，1 迈克尔·切萨姆（Michael E.Cheetham），2和克里斯托弗·肖通讯作者1
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关联数据

补充资料

不溶性TDP-43内含物是ALS和tau阴性额颞叶变性的病理特征。陈等。表明调节伴侣表达的热休克反应（HSR）在ALS小鼠模型和患者中受到损害。激活HSR可清除不溶性TDP-43并提高细胞存活率。

关键词：TDP-43蛋白病、ALS、热休克反应、HSF1、分子伴侣

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不溶性TDP-43内含物是ALS和tau阴性额颞叶变性的病理特征。陈等。表明在ALS小鼠模型和患者中调节伴侣蛋白表达的热休克反应（HSR）受到损害。激活HSR可清除不溶性TDP-43并提高细胞存活率。

关键词：TDP-43蛋白病、ALS、热休克反应、HSF1、分子伴侣

摘要

耐洗涤剂、泛素化和超磷酸化的焦油DNA结合蛋白43（TDP-43，由TARDBP公司)神经元细胞质内含物是约95%的肌萎缩侧索硬化症和约60%的额颞叶变性病例的病理标志。我们试图探索热休克反应在疾病细胞模型中清除不溶性TDP-43的作用，并在转基因小鼠和人类肌萎缩侧索硬化组织中验证我们的发现。热休克反应是一种由转录因子热休克因子1（HSF1）调节的应激反应保护机制，它可以增加伴侣蛋白的表达，从而使受损的错误折叠蛋白重新折叠或促进其降解。在这里，我们表明，通过表达显性活性HSF1来操纵热休克反应，导致不溶性和过度磷酸化的TDP-43显著减少，从而提高细胞存活率，而显性阴性HSF1的表达则导致TDP-43聚集和过度磷酸化度增加。为了确定哪些伴侣介导TDP-43清除，我们过度表达了一系列热休克蛋白（HSPs）并鉴定了DNAJB2a（由DNAJB2公司，也称为HSJ1a）作为TDP-43的有效抗聚集伴侣。DNAJB2a具有J结构域，允许其与HSP70相互作用，泛素相互作用基序使其能够参与其客户蛋白的降解。使用功能缺失的DNAJB2a构建物，我们证明TDP-43的清除是J结构域依赖性的，不受泛素相互作用基序缺失或蛋白酶体抑制的影响。这表明，DNAJB2a将TDP-43保持在可溶状态，使TDP-43的总水平保持不变。此外，我们已经证明，在肌萎缩侧索硬化TDP-43转基因小鼠模型和散发性肌萎缩侧索性硬化患者的受影响神经组织中，HSF1和热休克蛋白的水平显著降低。这意味着肌萎缩侧索硬化症患者HSF1介导的DNAJB2a/HSP70热休克反应途径受损。据预测，TDP-43的折叠缺陷会加重TDP-43蛋白病。HSF1/HSP通路的激活可以减少不溶性TDP-43的病理积累，这一发现为新疗法的开发提供了一个激动人心的机会。

介绍

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是最常见的成人期运动神经元变性疾病，其特征是脊髓、脑干和运动皮层的运动神经元进行性丢失，导致肌肉无力，最终导致呼吸衰竭。平均发病年龄为55岁，患者通常在确诊后3-5年内死亡。没有有效的治疗方法，因此对新的治疗发展有很高的未满足需求（综述见戈亚尔和莫扎法尔，2014年). 大约10%的ALS病例为家族性，其余90%为散发性（散发性ALS）。无论病因如何，～95%的患者都有共同的分子病理学，包括细胞质中泛素化、过度磷酸化和不溶性TDP-43蛋白聚集体的积聚，以及细胞核中TDP-43水平的降低(诺依曼等。, 2006；麦肯齐等。, 2007；棕褐色等。, 2007；盖瑟等。, 2008；布雷特施奈德等。, 2013).

TDP-43是一种DNA和RNA结合蛋白，在调节RNA转录、编辑、运输和翻译中起关键作用。它是一种主要的核蛋白，其水平通过自动调节系统严格控制(阿亚拉等。, 2011；波利曼尼杜等。, 2011). 敲除TDP-43对胚胎小鼠是致命的，这表明它在发育和生存中起着至关重要的作用(克雷默等。, 2010). 虽然TDP-43主要是一种核蛋白，但已知它在细胞核和细胞质之间穿梭，并已被确定为应激颗粒的组成部分，应激颗粒是细胞应激反应形成的(腹部等。, 2005；卢瑟福等。, 2008；科隆布里塔等。, 2009；迪翁等。, 2009；野中弥弥等。, 2009). 在TARDBP公司TDP-43的基因编码促进TDP-43向胞浆的移位，稳定并促进突变蛋白的聚集(约翰逊等。, 2009；巴尔马达等。, 2010；玲等。, 2010). TDP-43易聚集，细胞质中突变蛋白的积累与毒性相关(巴尔马达等。, 2010；比利坎等。, 2012). 此外，野生型TDP-43在哺乳动物细胞或转基因动物模型中的过度表达会导致TDP-43积累、细胞毒性和运动障碍(灰烬等。, 2010；巴尔马达等。, 2010；失速等。, 2010；威尔斯等。, 2010). 由于在95%的ALS和tau阴性的额颞叶变性病例中观察到TDP-43细胞质聚集，TDP-43蛋白水平的失调是疾病发病的共同特征。因此，靶向清除聚集的TDP-43是治疗干预的关键策略。

蛋白质合成、折叠和降解的平衡是维持蛋白质稳态（蛋白质稳态）所必需的，而这一过程是由分子伴侣促进的。当细胞受到影响蛋白质平衡的损伤（如热休克）的剧烈应激时，它们会诱导由转录因子热休克因子1（HSF1）调控的转录程序上调选定的伴侣，即热休克蛋白（HSPs），保护它们免受异常蛋白质积累的影响。根据功能和大小，热休克蛋白可分为几个家族（有关审查，请参阅斯泰特勒等。, 2010). HSP90和HSP70是典型的丰富伴侣蛋白家族，在大多数亚细胞器中普遍表达。它们通过以依赖ATP的方式促进客户蛋白的折叠来执行伴侣功能。人类DnaJ（HSP40）家族包含～50个蛋白质，作为HSP70的共同伴侣，通过刺激HSP70 ATP水解促进客户-伴侣相互作用，产生客户蛋白重折叠的高亲和力结合状态。HSP40家族的一些成员具有HSP70独立的功能，可以促进客户蛋白自身折叠或直接靶向降解(坎平加和克雷格，2010年).

异常蛋白聚集是几乎所有神经退行性疾病的病理特征，增加单个HSP表达对几种神经退行性病模型的有益影响已被证明。例如，共伴侣DNAJB6b和DNAJB8的过度表达抑制了多Q蛋白的聚集和毒性(哈格曼等。, 2010); 小HSP HSPB8的过度表达促进了突变SOD1的自噬清除(克里帕等。, 2010); HSP70过表达抑制α-突触核蛋白原纤维的形成(德蒙等。, 2005); 突变SOD1转基因小鼠HSPB1的过度表达提高了疾病发展早期而非晚期的神经元存活率(夏普等。, 2008); 并且DNAJB2a在SOD1转基因小鼠中的过表达减少了SOD1的聚集(诺沃肖洛夫等。, 2013).

在本研究中，我们探讨了热休克蛋白清除病理性TDP-43聚集物的潜力，以及这些伴侣蛋白在TDP-43蛋白病动物模型和ALS患者中是否存在缺陷。我们建立了一个细胞模型，该模型概括了人类TDP-43蛋白病的关键特征，并证明显性活性HSF1或共同伴侣DNAJB2a的过度表达可以显著清除不溶性TDP-43聚集体，并在不改变可溶性TDP-43水平的情况下提高细胞存活率。我们证明，DNAJB2a通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）非依赖性、HSP70依赖性机制介导病理性TDP-43清除。这表明HSF1-DNAJB2a途径重新折叠TDP-43并使其恢复自然生理状态，而不是促进其降解。我们还证明，转基因TDP-43小鼠模型和散发性ALS患者脊髓组织中HSF1和HSPs的水平均显著降低。这些结果突出了HSF1和HSP激活作为TDP-43蛋白病重要治疗策略的潜力。

材料和方法

质粒和抗体

绿色荧光蛋白（GFP）-TDP-43构建物是在先前的研究中生成和使用的(西村等。, 2010). HSF1（+）和HSF1（−）(图1A） 由Richard Voellmy教授善意地提供的HSF1结构改造而成(夏等。, 1999). 将V5标签与N末端融合，克隆到pcDNA5/FRT/to表达载体中（生命科技）。V5-chiperone构造由Harm Kampinga教授提供(Hageman和Kampinga，2009年)和Myc-DNAJB2a构建体，并在先前的研究中使用(Chapple和Cheetham，2003年；韦斯特霍夫等。, 2005). 所有质粒序列均经DNA测序验证。

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HSF1（+）的表达降低了不溶性TDP-43的水平。(A类)人类HSF1蛋白的蛋白质结构和本研究中使用的HSF1变体。(B类)HEK293T细胞共表达GFP-TDP-43和V5-HSF1结构体48小时，然后分馏。内源性HSP40和HSP70水平显示为HSR激活的指标。对三个独立转染的GFP-TDP-43水平进行量化，归一化为肌动蛋白，并显示与GFP-WT-TDP-43和仅载体对照的关系。显示了不溶性部分的平均值和SEM(C类)和可溶部分(D类)双向方差分析表明，TDP-43溶解度的差异不是由TDP-43基因型或TDP-43和HSF1之间的相互作用引起的，而是由HSF1单独引起的(P（P）<0.001). 与仅载体对照组相比，HSF1（+）和HSF1（−）与GFP-TDP-43联合转染时，导致不溶性TDP-43水平发生显著变化(P（P）<0.001，Bonferroni后测试）。

本研究中使用的主要抗体包括：兔抗泛素，K48特异性（1:2000，密理博）；小鼠抗磷TDP-43（1:3000，Cosmo Bio）；兔抗鼠TDP-43（0.1μg/ml，弗吉尼亚·李教授赠送；伊加兹等。, 2011); 小鼠抗Myc（9B11；免疫印迹1:1000，免疫纯化1:100，细胞信号传递）；兔抗HSP40（C64B4；1:1000，细胞信号）；兔抗HSP70（1:1000，细胞信号）；兔抗-HSF1（1:1000，细胞信号传导）；小鼠抗肌动蛋白（1:4000，Sigma）；兔抗V5抗体（免疫印迹1:2000，免疫纯化1:1000，Sigma）；小鼠抗GFP（1:1000，圣克鲁斯）；兔抗TDP-43（1:2000，ProteinTech）；和兔抗p62（1:10 000，Abcam）。二级抗体包括DyLight®680山羊抗兔IgG（1:10 000，Thermo Scientific）；DyLight®800山羊抗鼠IgG（1:10 000，Thermo Scientific）；HRP相关抗兔IgG（1:2000，细胞信号）；和DyLight®488/550/650抗兔或小鼠IgG（1:500，Thermo Scientific）。

细胞培养和DNA转染

HEK293T和SH-SY5Y细胞使用Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）和补充10%胎牛血清（Life Technologies）的DMEM/F12（Life Technologies）培养，并保持在37°C、5%CO2。转染前一天对细胞进行电镀，并在使用Lipofectamine®2000（生命技术）转染质粒DNA之前刷新培养基。除非另有说明，否则转染后将细胞保留48小时以进行分析。

动物

所有实验都是根据1986年《英国动物（科学程序）法案》的条款进行的，并得到伦敦国王学院伦理审查小组的批准。通过杂交TDP-43产生复合转基因小鼠重量和TDP-43Q331K问题如前所述的小鼠(米切尔等。, 2015).

小鼠和人脊髓裂解物制剂

8周龄TDP-43的全脊髓重量x Q331K动物及其单胎和非转基因同胞(n个=3–4）或50 mg来自对照组或散发性ALS患者的脊髓死后组织在适量的RIPA缓冲液（50 mM Tris pH8.0、150 mM NaCl、1%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠及蛋白酶和磷酸酶抑制剂）中均质、超声处理并储存在−80°C。使用DC™蛋白质检测试剂盒（Bio-Rad）测定蛋白质浓度。用10μg蛋白裂解物进行蛋白质印迹。

免疫组织化学

八周，末端TDP-43重量x Q331K对小鼠和年龄匹配的同窝鼠进行麻醉，并用磷酸盐缓冲液（PBS）经心灌注，然后在磷酸盐缓冲液中灌注4%多聚甲醛（PFA）。脊髓在4%PFA和15%蔗糖中固定5小时，在30%蔗糖中冷冻24小时，并在低温恒温器上切割成30µm的切片。切片在兔抗HSF1抗体（1:250；细胞信号）中孵育，清洗并与生物素化抗兔抗体（1:1000；载体）孵育然后在ABC试剂盒（载体）中孵化。使用蔡司光学显微镜和Axiovision软件对切片进行成像。

免疫净化

在免疫纯化缓冲液中收集细胞（50 mM Tris pH7.4，150 mM NaCl，1%Triton™X-100，含蛋白酶和磷酸酶抑制剂）。离心（4°C下14000 rpm，30 s）后，收集上清液，并与免疫纯化抗体和Dynabead蛋白A（Life Technologies）在4°C孵育过夜。使用磁性分离纯化Dynabead®蛋白A-抗体-蛋白复合物，并用免疫纯化缓冲液洗涤，然后在加载缓冲液中洗脱。

溶解度分级

蛋白质溶解度的分级使用下述方案进行：温顿等。(2008)做了一些小修改。在RIPA缓冲液中收集细胞，进行超声处理并在12000℃下离心克在4°C下保持20分钟。离心后，收集上清液作为RIPA溶解度分数。用RIPA缓冲液清洗一次后，将颗粒悬浮在20%的原始溶解体积中，并用尿素缓冲液（7 M尿素、2 M硫脲、4%CHAPS和30 mM Tris pH8.5），作为不溶性耐洗涤剂部分收集。

蛋白质印迹和密度分析

如前所述进行蛋白质定量和蛋白质印迹(西村等。, 2010). 装载来自RIPA馏分的5微克细胞裂解物和来自尿素馏分的等效液体体积。使用图像分析软件ImageJ进行Western blot定量(http://imagej.nih.gov/ij/). 积分带强度归一化为加载控制或RIPA分数。

免疫荧光

用于免疫荧光分析的细胞在4%PFA（VWR）中固定20分钟，并用PBS清洗三次5分钟。细胞在室温下在含有0.5%Triton™X-100（Sigma）的PBS中培养15分钟，然后在室温下用含有1%驴血清的PBS封闭1小时，从而使细胞渗透。将细胞与在封闭溶液中稀释的初级抗体在4°C下孵育过夜。在PBS中清洗后，细胞随后在室温下与在封闭溶液中稀释的荧光二级抗体孵育1小时。然后使用DAPI（Sigma）染色细胞核，然后使用FluroSave（Calbiochem）将其安装在盖玻片上。

细胞存活分析

对于细胞存活分析，将SH-SY5Y细胞进行胰蛋白酶化，并在室温下用钙黄绿450 AM活性染料（500 nM，eBioscience）染色30 min。用PBS洗涤两次后，将细胞重新悬浮在PBS中，并用BD FACSCanto II（BD Biosciences）进行分析。

结果

HSF1（+）的共同表达降低了不溶性TDP-43蛋白的水平

本研究使用HSF1的显性活性和阴性形式来研究HSR和HSP上调对细胞模型中TDP-43蛋白病变的影响。HSF1是一种转录因子，在应激反应中上调HSPs。在非应激状态下，HSF1通过其调节域与HSP90结合，并保持非活性状态。在细胞应激过程中，HSF1与HSP70分离，三聚，易位到细胞核，并通过其DNA结合域（DBD）与热休克元件（HSE）结合，其中，它通过其交易域（TAD）促进下游基因的转录(Voellmy，2005年；维利奇科等。, 2013). 为了激活HSR，我们使用了显性阳性HSF1，即HSF1（+），其中的调控域被删除(图1A） ●●●●。因此，这种修饰的HSF1不能被HSP90结合所灭活。相反，为了进行比较，我们使用了一个显性负结构HSF1（−），删除了TAD结构域(图1A） ●●●●。尽管HSF1（−）在应激期间仍能与内源性野生型HSF1形成三聚体，但它不能诱导其靶基因的转录。HSF1（+）的表达增加了内源性HSP40（DNAJB1）和HSP70（HSPA1A）的水平，表明HSF1（＋）如预期的那样激活了HSR(图1B） ●●●●。另一方面，HSF1（−）表达细胞中HSP40和HSP70的水平没有变化，或略有下降，表明HSF1（–）过度表达并没有诱导HSR，甚至可能通过显性负性抑制内源性HSF1来抑制基础HSR激活。

我们细胞中内源性TDP-43的表达水平不足以引起任何类似于疾病组织中所见的蛋白病表型，并且在不溶性部分中未发现(补充图1A和B）。野生型或突变型TDP-43在HEK293细胞中的过度表达导致TDP-43大量积聚在耐洗涤剂部分(图1B和C）。这一结果与之前的报告一致，该报告显示，细胞内高水平的TDP-43导致蛋白质聚集，导致蛋白质溶解度降低。然而，TDP-43与HSF1（+）的共同表达导致不溶性TDP-43水平显著降低至～25%(图1B和C，P（P）<0.001). 相反，HSF1（−）显著增加了不溶性TDP-43的水平～250%(图1B和C，P（P）<0.001). 与HSF1联合转染时，TDP-43的突变状态没有显著改变TDP-43蛋白的溶解度，单独转染时TDP-43也没有突变(图1C） ●●●●。HSF1（+）对可溶性TDP-43水平无明显影响(图1B和D）。然而，当与HSF1（−）共同表达时，发现可溶性GFP-TDP-43略有减少，尤其是细胞溶质TDP-43、GFP-dNLS TDP-43(图1B和D，P（P）<dNLS-TDP-43为0.01），表明HSF1（−）的表达导致过表达的细胞溶质TDP-43从可溶性单体转变为不溶性聚集体的趋势增加。

总之，这些结果表明，HSF1（+）对HSR的激活增加，显著增强了不溶性TDP-43的清除，而通过HSF1（−）表达抑制HSR，导致不溶性的TDP-43增加，这可能是内源性基础HSR抑制所致。

HSF（+）拯救TDP-43过度磷酸化

除了溶解度降低外，TDP-43相关的病理学特征还表现为存在过度磷酸化的TDP-43，可通过磷酸化TDP-43特异性抗体检测到。磷-TDP-43仅在不溶性尿素部分中检测到，这证实了我们模型中病理性TDP-43既不溶又过度磷酸化(图2A） ●●●●。在HSF1（+）共表达细胞中，不溶性磷酸化TDP-43的积累被完全抑制(图2A和B，P（P）<0.01）并通过HSF1（−）增强(图2A和B，P（P）<0.001). 仅在GFP载体转染的细胞中未发现磷酸化TDP-43染色(图2C） 表明TDP-43磷酸化不是由瞬时转染应激引起的，而是由聚集的TDP-43的积累引起的，其中含有内源性TDP-43(补充图1C） ●●●●。细胞内磷酸化-TDP-43的染色证实了western blot的发现，有证据表明约10%的GFP-TDP-43表达细胞中存在TDP-43磷酸化。HSF1（+）显著降低野生型和突变型TDP-43表达细胞中的TDP-43磷酸化水平，而不改变TDP-43转染效率(图2D–H）。另一方面，HSF1（−）增加了TDP-43磷酸化，这与GFP-dNLS TDP-43表达细胞的频率略有下降相一致(图2H、，P（P）=0.012). 过表达TDP-43的基因型对TDP-43磷酸化没有显著影响就其本身而言(图2B和G）。我们还观察到，在该模型中，TDP-43蛋白的亚细胞定位发生了轻微变化，因为共表达GFP-TDP-43和HSF1（+）的细胞往往具有较高比例的核TDP-43，而共表达GFP-TDP-43与HSF1（−）的细胞显示出较高比例的胞浆TDP-43(补充图2). 在TDP-43与HSF1（−）共同表达的加重情况下，不仅在细胞核和细胞质中鉴定出磷酸化的TDP-43，而且～30%的胞浆磷酸化TDP-43内含物也呈泛素阳性(图2一） ●●●●。

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HSF1（+）的表达拯救了TDP-43磷酸化。(A类)共表达GFP-TDP-43和V5-HSF1构建物的HEK293T细胞48小时后分馏。对来自三个独立转染的磷酸化TDP-43水平进行量化，归一化为肌动蛋白，并显示与GFP-野生型TDP-43和仅载体对照的关系。平均值和SEM如所示(B类). 双向方差分析表明，TDP-43磷酸化的差异不是由TDP-43基因型或TDP-43和HSF1之间的相互作用引起的，而是由HSF1单独引起的(P（P）<0.001). 当用GFP-TDP-43共转染时，与仅用载体的对照相比，HSF1（+）和HSF1（−）都显著改变了磷酸化TDP-43的水平(P（P）=0.02和P（P）<分别为0.001，Bonferroni后测试）。(C类–如果)转染V5-HSF1和GFP-TDP-43载体48小时的HEK293T细胞中的磷酸-TDP-43染色(C类)，GFP-WT-TDP-43型(D类)，GFP-M337V TDP-43(E类)和GFP-dNLS TDP-43(如果). 比例尺=20μm inC类对三个独立的转染进行细胞计数，每个条件下300个细胞。同样磷酸化-TDP-43染色阳性的表达GFP-TDP-43的细胞的频率的平均值和SEM(G公司)和GFP-TDP-43转染效率(小时)如图所示。(我)GFP-WT-TDP-43和HSF1（−）转染的HEK293T细胞经磷酸化-TDP-42（红色）和泛素（洋红）染色。比例尺=5μm。

为了在神经元模型中进一步验证这些发现，我们在大鼠初级皮层神经元中用HSF1过度表达GFP-TDP-43(图3). GFP载体的过度表达不会在转染神经元中诱导TDP-43磷酸化(图3B） 这再次证明外源蛋白表达不是TDP-43过度磷酸化的原因。当用GFP-TDP-43单独转染原代神经元时，表达主要局限于细胞核（65.9±1.48%），但在显著少数细胞中也观察到磷酸化TDP-43的细胞质定位（31.2±0.54%）(图3C、 顶部）。在HSF1（+）/GFP-TDP-43表达细胞中，所有TDP-43都显示出核定位，没有磷酸化的证据(图3C、 中间）。然而，在同时表达HSF1（−）和GFP-TDP-43的细胞中，细胞核TDP-43显著减少，细胞质中过度磷酸化的TDP-43积聚(图3C、 底部）。核TDP-43在含有大量细胞质聚集物的细胞中的清除与ALS患者组织中病理TDP-43的观察结果一致(诺依曼等。, 2006). 值得注意的是，共表达HSF1（−）的GFP阳性细胞非常罕见，许多细胞已经失去了神经元样形态(图3A和C），表明当HSR被抑制时，TDP-43细胞毒性增强。

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HSF1对初级神经元TDP-43细胞分布和磷酸化的影响。(A类)将GFP-WT-TDP-43（绿色）和V5-HSF1（红色）转染大鼠初级皮层神经元。βIII-管蛋白（品红色）用作神经元标记物。(B类和C类)GFP载体(B类)或带有V5-HSF1的GFP-野生型TDP-43(C类)转染到大鼠初级皮层神经元。转染6天后固定细胞，并对其进行V5（品红色）、磷酸化-TDP-43（红色）和细胞核（DAPI，蓝色）染色。比例尺=10μm。

我们的TDP-43蛋白病细胞模型复制了人类疾病的几个特征，即不溶性磷酸化和泛素化TDP-43在细胞质中积累。我们还表明，激活HSR可以挽救TDP-43病理学，而阻断这种反应会加剧TDP-43的积聚。

HSF1（+）拯救TDP-43诱导的细胞死亡

正如在其他细胞和转基因动物研究中所报道的那样，TDP-43的过表达可能对一些细胞，特别是神经元具有细胞毒性(灰烬等。, 2010；巴尔马达等。, 2010；失速等。, 2010；威尔斯等。, 2010). 当野生型或ALS相关突变体TDP-43在SH-SY5Y神经元细胞系中过度表达时，从那些表达GFP-TDP-43的细胞中观察到细胞存活率显著降低(图4A和B以及补充图3)表明TDP-43的过度表达确实对神经细胞有毒性。然而，HSF1（+）的存在可以部分但显著地挽救这种细胞毒性(图4C和D）。在过表达ALS连接的突变体TDP-43的细胞中也获得了类似的发现。相反，尽管GFP-dNLS TDP-43的过度表达导致了与其他GFP-TDP-43结构相似的细胞死亡水平，但HSF1（+）的表达只能诱导非显著性的细胞死亡(P（P）=0.246）减少细胞死亡。HEK293细胞中TDP-43的过度表达没有显示细胞毒性（数据未显示），支持ALS研究中的观察，即神经元细胞对TDP-43细胞毒性特别敏感。

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HSF1（+）的表达可缓解TDP-43的毒性。(A类)对用GFP-TDP-43转染的SH-SY5Y进行48小时的细胞死亡分析。在该图中绘制了GFP阳性细胞，其中死亡细胞显示具有降低的煅烧AM荧光强度（如门控的）。GFP载体表达细胞以阴影线表示，而彩色线表示GFP-TDP-43表达细胞的不同基因型。(B类)显示三个独立转染SEM的GFP阳性细胞的平均死亡数量。与GFP载体控制相比，野生型和突变型TDP-43均会导致显著的细胞死亡（单向方差分析，然后是Bonferroni后验，P（P）<0.001). (C类)一个有代表性的实验表明，HSF1（+）（蓝线）的存在降低了表达GFP-TDP-43的死亡细胞（红线）的水平。三次转染的平均细胞死亡如所示(D类).T型-该试验用于确定HSF1（+）是否能显著拯救TDP-43诱导的细胞死亡*P（P）<0.05;**P（P）<0.01;***P（P）<0.001.

总之，我们已经证明，细胞中TDP-43的过度表达再现了TDP-43蛋白病的病理特征，并且这些特征的存在导致细胞死亡的增加。通过HSF1（+）的表达操纵热休克反应（HSR）可以减少这种病理性TDP-43，并提高细胞存活率。相反，当细胞因HSF1（−）的表达而丧失其基本的热休克反应活性时，TDP-43蛋白病的程度会加剧。

DNAJB2a作为HSF1诱导TDP-43聚集抑制的潜在介质

HSF1是一种转录因子，在激活时负责诱导广泛的HSPs和其他应激反应蛋白(维利奇科等。, 2013；维赫瓦拉等。, 2013). 由于HSF1（+）的过度表达增加了HSP40和HSP70的内源性水平，这表明HSF1（＋）正如期触发热休克反应(图1B） ●●●●。为了确定哪些伴侣蛋白可能参与TDP-43的清除，我们筛选了一系列HSPs，包括HSP90、HSP70、Hsc70、HSP27以及之前筛选的DNAJA和DNAJB家族中的大多数HSP40，这些家族具有抑制polyQ聚集的能力(哈格曼等。, 2010). 大多数测试的热休克蛋白对TDP-43的溶解度几乎没有影响，然而，两个热休克蛋白（DNAJB2a和DNAJB8a）导致不溶性TDP-43减少，与HSF1（+）的结果相似(图5). 由于DNAJB8a的表达模式非常有限，只能在睾丸组织中发现，因此我们没有进一步测试。DNAJB2a显示神经元富集的表达谱(契萨姆等。, 1992；Chapple和Cheetham，2003年；Hageman和Kampinga，2009年)，并被选中进行进一步调查。

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筛选介导HSF1（+）诱导TDP-43清除的HSPs。(A类)HEK293T细胞共表达GFP-TDP-43和V5-HSP结构48小时，然后进行分馏。来自三个独立转染的不溶性TDP-43水平被量化，归一化为肌动蛋白，并显示为相对于对照的水平。平均值和SEM如所示(B类).

DNAJB2a通过与HSP70相互作用维持TDP-43的溶解度

DNAJB2a，编码人DNAJB2公司也被称为HSJ1a，是HSF1的目标(维赫瓦拉等。, 2013)并通过其J结构域作为HSP70相互作用的共同伴侣发挥作用(图6A；契萨姆等。, 1994). 除了与HSP70协同工作外，DNAJB2a还可以独立结合客户蛋白，并通过泛素相互作用基序（UIM）将其靶向蛋白酶体进行降解(图6A；韦斯特霍夫等。, 2005). 为了研究HSF1-DNAJB2a介导的TDP-43聚集清除的性质，我们用野生型或DNAJB2a的选定突变体表达GFP-野生型TDP-43。DNAJB2a中的H31Q突变破坏了DNAJB2a和HSP70之间的相互作用，从而阻碍了DNAJ2a的协同伴侣活性。DNAJB2a-dUIM在UIM中有四个点突变，这阻止了DNAJB2a将客户蛋白传递给蛋白酶体进行降解(韦斯特霍夫等。, 2005). 有趣的是，DNAJB2a介导的不溶性/磷酸化TDP-43的减少并没有因dUIM突变的存在而改变，而H31Q突变的存在完全破坏了这种活性(图6B） ●●●●。这些发现表明，DNAJB2a通过与HSP70合作以增强复性并保持溶解性，而不是通过导致不溶性蛋白质降解，从而降低不溶性TDP-43的水平。为了支持这一假设，用蛋白酶体抑制剂MG-132处理表达GFP-WT-TDP-43的细胞，导致不溶性TDP-43的积累(图6C） ，对HSF1（+）/DNAJB2a-介导的TDP-43聚集抑制影响最小(图6C） ●●●●。DNAJB2a功能突变研究和MG-132对泛素-蛋白酶体系统抑制的研究均表明，蛋白质降解在HSF1-DNAJB2a介导的TDP-43聚集清除中不起主要作用。我们的观察进一步支持了这一点，即巴非霉素治疗对HSF1（+）/DNAJB2a-介导的TDP-43聚集清除的自噬抑制作用最小(补充图4).

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DNAJB2a通过将TDP-43引入HSP70介导TDP-43的复性。(A类)DNAJB2a的域结构，显示J（和H31）、客户端绑定（CBD）和UIM域的位置。(B类)共表达GFP-野生型TDP-43和myc-DNAJB2a的HEK293T细胞构建48小时后分馏。GFP抗体显示不溶性TDP-43的水平，磷酸化TDP-43通过磷酸化TDP-43特异性抗体检测。(C类)用泛素蛋白酶体系统抑制剂MG-132（0.5μM，40 h）处理共表达GFP-WT-TDP-43和仅载体（vec）、HSF1（+）或myc-DNAJB2a的细胞，然后进行分馏。(D类)GFP-TDP-43和myc-DNAJB2a的共免疫纯化。Myc-DNAJB2a被Myc抗体拉下，GFP-TDP-43被TDP-43抗体检测到。(E类)GFP-TDP-43和V5-HSFP70的共离子纯化。V5-HSP70和V5-HSP 90被V5抗体拉下，GFP-TDP-43被GFP抗体检测。

一项免疫纯化研究提供了进一步的证据支持DNAJB2a-HSP70-TDP43复性复合物的存在，因为TDP-43被证明与DNAJB2a和HSP70相互作用(图6D和E）。虽然共同伴侣与客户蛋白的结合通常是暂时的和动态的，但我们能够检测到TDP-43与所有三种形式的DNAJB2a的结合。与H31Q-DNAJB2a的结合比其他蛋白更强，可能是因为它不能将客户蛋白转移到HSP70，因此延长了结合时间(图6D） ●●●●。

这些结果表明，HSF1诱导的共伴侣蛋白DNAJB2a不是通过降解这些聚集的磷酸化蛋白质，而是通过将其引导至HSP70进行重折叠来降低不溶性TDP-43的水平(图6和补充图5). 由于TDP-43被严格控制以维持其细胞水平，并且众所周知，尤其在压力下，TDP-43具有聚集性，因此我们的发现表明了一种很有前景的治疗策略，即利用热休克反应机制恢复中性TDP-43蛋白的内稳态。

ALS小鼠模型和受影响的患者组织中HSF1/热休克蛋白减少

HSR是应对细胞应激的强大机制，我们在本研究中表明，HSR可以有效地折叠不溶性TDP-43并溶解TDP-43蛋白病的特征；然而，在一些神经退行性疾病中，它已被证明受到损害(海伊等。, 2004；马赫什瓦里等。, 2014). 为了进一步明确HSF1/HSPs在ALS患者TDP-43蛋白病变中的作用，研究了ALS小鼠模型和患者组织中HSF1和HSPs蛋白的水平。

为了研究TDP-43在ALS发展和进展中的作用，建立了表达野生型TDP-43和/或Q331K-TDP-43的转基因小鼠系(米切尔等。, 2015). TDP-43蛋白水平与表型严重程度之间存在相关性，其中表达最高水平TDP-43（TDP-43）的菌株重量Q331K双转基因小鼠）患有最严重的运动障碍和TDP-43病理学，与单转基因和非转基因小鼠相比寿命大大缩短(米切尔等。, 2015).

有趣的是，TDP-43中HSF1减少Q331K问题后期表现出轻度非致命性运动缺陷的单转基因小鼠(图7A和米切尔等。, 2015)，但在患病的TDP-43中损失最为显著重量x Q331K老鼠(图7A） ●●●●。由于HSF1的丢失，TDP-43中HSP70和HSP40的水平也显著降低重量x Q331K小鼠，而HSP90未受影响。免疫组织化学染色还显示，终末期病变小鼠脊髓切片中剩余运动神经元中HSF1水平降低(图7B） 表明HSF1蛋白的减少不仅仅是运动神经元丢失的结果。

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TDP-43小鼠模型和散发性ALS受影响组织中的HSR下调。(A类)全脊髓裂解物由8周龄非转基因（Ntg）、野生型TDP-43单转基因（WT）、Q331K-TDP-43单转基因（Q）和WTxQ331K-TDP-43双转基因（WTxQ）小鼠制备。TDP-43印迹显示内源性和转基因TDP-43蛋白水平；HSR的组成部分用HSF1、HSP70、HSP40和HSP90表示；神经元标记物βIII微管蛋白和ChAT也可作为神经元缺失的指示物。Actin用作加载控件。(B类)8周龄非转基因和双转基因动物脊髓切片中HSF1的免疫组织化学染色。箭头和插图所示的选择性运动神经元。比例尺=50μm。HSF1水平(C类)，热休克蛋白70(D类)和HSP40(E类)显示了对照组和散发的ALS脊髓裂解物。本研究使用了15个对照组和15个散发性ALS（SALS）样本，显示了具有代表性的western blot，所有样本均为t吨-测试比较*P（P）<0.05;**P（P）<0.01.

对人体组织中HSF1和HSPs的检测发现HSP70显著降低(图7D） 和HSP40(图7E） 尽管散发性ALS和对照组织之间HSF1水平没有显著变化(图7C） ●●●●。众所周知，HSF1的总水平并不总是与其活性水平相关，相反，需要某些翻译后修饰才能激活蛋白质(韦斯特海德等。, 2009；卡尔德伍德等。, 2010；耶等。, 2012). HSF1活性的这种调节可能是我们在ALS受影响组织中看到的差异的原因，尽管HSF1总水平没有明显变化，但HSP40和70减少。因此，我们认为HSF1活性的降低会导致HSPs的减少，而HSPs又会促进ALS患者TDP-43的积累和聚集。

综上所述，我们的结果表明，在TDP-43转基因ALS小鼠模型和患者组织中，HSR受到损害，这可能是由长期TDP-43蛋白过度表达直接或间接引发的。此外，这些结果表明，HSR的降低导致TDP-43重折叠效率降低，促进磷酸化的不溶性TDP-43的积累。

讨论

在本研究中，我们建立了人类TDP-43蛋白病的细胞模型，该模型产生了耐洗涤剂、高磷酸化的胞质不溶性TDP-43聚集物，具有细胞毒性。热休克反应主调节因子HSF1的显性阳性表达诱导了不溶性TDP-43聚集体的显著清除，而不影响可溶性TDP-43的水平。相反，HSF1的显性阴性版本导致不溶性和过度磷酸化TDP-43聚集体的大量积累，证实了HSF1-HSP轴在生理TDP-43蛋白质平衡中的重要作用。我们已经证明HSF1诱导的TDP-43清除部分由HSP70及其共同伴侣DNAJB2a以蛋白酶体和自噬独立的方式介导。我们建议DNAJB2a识别并结合不溶性TDP-43，将其带到伴侣蛋白HSP70，然后再折叠该蛋白。一旦TDP-43恢复到可溶、适当折叠的状态，TDP-43就会释放出来，发挥其生物功能(图8). 因为DNAJB2a在不涉及蛋白酶体或自噬的情况下介导TDP-43重折叠，所以它能够降低TDP-43毒性，而不会改变可溶性TDP-43的水平。

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提出了HSR参与TDP-43蛋白折叠和蛋白病的模型。在HSR功能正常的健康状态下，HSF1激活HSPs的表达，如HSP70和DNAJB2a。DNAJB2a识别细胞液中错误折叠的TDP-43并将其带到伴侣蛋白HSP70。HSP70对TDP-43的重折叠进行催化，使其恢复到天然可溶状态，从而使TDP-43穿梭回细胞核。在疾病状态下，HSR因蛋白质水平降低或HSF1活性降低而受损。无论在哪种情况下，这都会导致热休克蛋白减少，而热休克蛋白随后无法有效接合错误折叠的TDP-43。因此，不溶性和磷酸化的TDP-43蛋白在受疾病影响的细胞中积累并形成细胞溶质聚集体。

我们还发现，转基因小鼠和散发性ALS组织中几种HSR蛋白水平降低，这意味着HSF1–HSP轴可能因疾病过程而受损。Q331K TDP-43转基因小鼠出现缓慢进展的运动表型，HSF1和HSP-40水平适度降低，而受严重影响的双转基因小鼠HSF1、HSP40和HSP70水平显著降低。在人类脊髓组织中，HSP70和HSP40水平显著降低，但HSF1水平没有降低。

我们的细胞、动物和人体组织研究的数据表明，HSF1/HSP70/DNAJB2a通路在TDP-43蛋白质平衡的生理维持中起着至关重要的作用。然而，在疾病状态下，HSR似乎受到损害，可能导致不溶性TDP-43蛋白聚集体的积累，并加剧缺陷蛋白质平衡(图8).

热休克蛋白在神经退行性疾病中的作用

分子伴侣对维持蛋白稳定至关重要(史密斯等。, 2015). 神经退行性疾病的特点是受影响的神经组织中存在聚集的异常蛋白，因此HSR蛋白的作用和治疗机会是非常有趣的。亨廷顿病患者受损神经组织中HSR成分水平降低(马赫什瓦里等。, 2014)和ALS(阿纳格诺斯托等。, 2010)压力反应失败与衰老和神经退行性疾病有关(布雷梅等。, 2014). 在疾病的细胞和转基因动物模型中，单个HSPs的过度表达已显示出不同程度的成功。在某些情况下，单个HSP的过度表达足以减少蛋白质聚集并提高生存率，例如：α-突触核蛋白的HSP70(奥勒克等。, 2002；德蒙等。, 2005)poly-Q的DNAJB6b和DNAJB8(哈格曼等。, 2010)，HSP27用于tau和SOD1(四村等。, 2004；锋利等。, 2008)和HSPB8用于SOD1(克里帕等。, 2010). 在其他情况下，需要HSP70和HSP40来清除异常的蛋白质聚集体(Krobitsch和Lindquist，2000年；洛茨等。, 2010). 差异可能是由于底物特异性和研究中使用的特定模型造成的。我们研究中使用的HEK293T细胞在基础条件下HSP70水平较高，但HSP40水平相对较低(图1B） ●●●●。由于HSP40的水平是我们细胞模型中的一个限制因素，这可能解释了为什么我们没有观察到TDP-43病理学对HSP70过度表达的单独反应(图5A） 尽管有证据表明HSP70和DNAJB2a之间的相互作用对不溶性TDP-43的清除至关重要(图6B） ●●●●。与HSP70不同，DNAJB2a的表达在神经元组织中特别丰富(Chapple和Cheetham，2003年；Hageman和Kampinga，2009年)DNAJB2的突变与罕见的隐性远端遗传性运动神经病和Charcot–Marie–Tooth疾病2型有关(布鲁门等。, 2012；盖斯等。, 2014)这意味着迫切需要这种共同伴侣。DNAJB2a在G93A-SOD1小鼠ALS模型中的过度表达具有保护作用(诺沃肖洛夫等。, 2013)和R6/2转基因小鼠中突变的亨廷顿蛋白(拉巴迪亚等。, 2012). 这些结果，结合我们自己关于TDP-43的数据，提供了令人信服的证据，证明DNAJB2a在神经元存活和神经元应对异常蛋白聚集的能力方面发挥着重要作用。有趣的是，DNAJB2a的重折叠（J）和蛋白酶体（UIM）结构域都是突变SOD1和亨廷顿蛋白清除所必需的，而我们证明TDP-43清除是通过HSP70/DNAJB2a介导的重折叠而非蛋白酶体清除实现的。TDP-43 C-末端磷酸化的显著降低表明该蛋白处于接近天然的可能功能状态。观察到类似的结果，其中DNAJB2a以J结构域依赖性和UIM非依赖性的方式抑制突变parkin的聚集并增强线粒体自噬(玫瑰色等。, 2011). 这一结果表明，DNAJB2a通过重折叠或降解调节蛋白质清除的不同功能取决于蛋白质客户的性质和结构。

HSPs和TDP-43之间的相互作用已在之前记录。弗赖巴姆等。(2010)进行蛋白质组筛选，确定一组与TDP-43相互作用的热休克蛋白，包括热休克蛋白70和热休克蛋白40。这些发现后来在细胞模型中得到验证(张等。, 2013；乌丹-约翰等。, 2014). 这两项研究都表明HSP-TDP-43相互作用在应激诱导的TDP-43聚集中起作用。然而，由于HSP表达模式是细胞类型特异性的，因此HSP-TDP-43相互作用在神经退行性变中的确切作用仍有待充分探讨。

细胞应激和TDP-43聚集：热休克反应的激活足以起作用吗？

TDP-43是一种聚集蛋白，在细胞应激（如热休克）条件下可形成耐洗涤剂聚集物或应激颗粒(补充图6；乌丹-约翰等。, 2014)渗透和氧化应激(杜威等。, 2011；麦当劳等。, 2011；张等。, 2013). 细胞模型的研究表明，尽管TDP-43聚集体在应力作用下迅速形成，但当应力消除时，这些聚集体很容易被分解(补充图6；苏格兰人等。, 2014). 一些细胞机制已经进化到参与解决潜在有害的蛋白质聚集体。已经发现泛素-蛋白酶体系统负责大多数TDP-43蛋白的降解，而自噬途径需要清除更大的聚集物(苏格兰人等。, 2014). 事实上，当蛋白酶体被MG132抑制时，我们观察到TDP-43聚集增加(图6B） ；然而，蛋白酶体和自噬抑制均未降低HSF1或DNAJB2a过度表达的有效性，进一步证实它们似乎并不以TDP-43为降解靶点。在这些途径的上游，伴侣系统促进蛋白质折叠并指导错误折叠蛋白质的降解。然而，由于其高度特定的结构，神经元对这些伴侣蛋白和蛋白质降解系统有更高的需求，以维持蛋白质的内环境稳定，这在衰老和疾病中似乎是失败的(布雷梅等。, 2014). 此外，运动神经元比大多数其他细胞具有更高的HSR激活阈值(巴图兰等。, 2003). 因此，在应激反应中，伴侣系统的激活可能会延迟，从而产生级联效应，蛋白质质量和降解系统开始失效，形成异常的蛋白质聚集体。如果HSR最终发挥作用，那么可能为时已晚。事实上，迄今为止没有证据表明HSR在病变组织中被激活并可能被抑制(图7) (阿纳格诺斯托等。, 2010；马赫什瓦里等。, 2014). 我们的数据表明，强制激活HSR，特别是神经元特异性协同伴侣DNAJB2a，可以通过将聚集的TDP-43恢复到其天然状态，有效地挽救TDP-43蛋白病。

HSP90通过阻止HSF1进入细胞核并诱导HSR而与HSF1结合并使其失活。因此，在神经退行性变的细胞和动物模型中测试了HSP90抑制剂，如17-AAG，并取得了一些成功(瓦扎等。, 2005；藤悬等。, 2008；鲁斯米尼等。, 2011；格雷戈里等。, 2012). 然而，由于HSP90参与细胞周期和细胞生存途径(Taipale公司等。, 2010)HSP90抑制剂的毒性副作用风险限制了其作为潜在治疗手段的吸引力。我们已经表明，HSF1/HSP70/DNAJB2a通路的激活导致TDP-43聚集体的显著清除，并且直接靶向这些HSR成分是ALS的重要治疗机会。

补充材料

补充数据

致谢

我们要感谢Richard Voellmy教授为本研究提供了初始HSF1（+）和HSF1（−）结构，以及Harm Kampinga教授提供了V5伴侣结构，以及伦敦神经退行性疾病大脑库和痴呆症大脑研究中心，为对照组和ALS患者提供死后脊髓组织。

基金

本研究主要由医学研究委员会和Wellcome信托基金会向C.E.S.颁发的战略拨款奖（拨款参考号089701/Z/09/2）和Wellcom信托基金会（092621）向M.E.C.提供的资助，此外还有运动神经元疾病协会、Heaton Ellis信托基金会、，精神病学研究信托基金会和美国肌萎缩侧索硬化协会。

补充材料

补充材料可在大脑在线。

词汇表

缩写

肌萎缩性脊髓侧索硬化症肌萎缩侧索硬化；
GFP公司绿色荧光蛋白；
热休克蛋白热休克蛋白；
高速反应器热冲击响应；
UIM卡泛素相互作用基序

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文章来自大脑由以下人员提供牛津大学出版社