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.2018年2月20日12时86分。
doi:10.3389/fnins.2018.00086。 2018年eCollection。

ALS iPSC-Derived运动神经元蛋白质聚集和热休克反应的模型

艾米丽·R神学院 1, 萨曼莎·L·西森 1, 艾利森·德·艾伯特 1
附属公司

ALS iPSC-Derived运动神经元蛋白质聚集和热休克反应的模型

艾米丽·R神学院等人。 前神经科学. .

摘要

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种破坏性的神经退行性疾病，由上下运动神经元选择性丧失引起。在所有病例中，只有10%是由20多种不同的已鉴定基因中的一种突变引起的，而其余90%可能是由尚未鉴定的遗传和环境因素共同引起的。中的突变C9或f72、SOD1，或TDP-43型是家族性肌萎缩侧索硬化症最常见的病因，共同导致了至少60%的此类病例。值得注意的是，尽管存在很大程度的异质性，但所有ALS患者的大脑和脊髓中都有对SOD1、TDP-43、OPTN和/或p62呈免疫阳性的蛋白质聚集体。这些内含物通常被热休克蛋白（Hsps）阻止和清除，这表明ALS运动神经元诱导热休克反应（HSR）的能力受损。因此，有证据表明，与未受影响的对照组相比，ALS小鼠模型和人类尸检样品中Hsps的诱导减少。然而，Hsps在人类运动神经元蛋白质积累中的作用尚未完全阐明。在这里，我们从携带突变的人类诱导多能干细胞（iPSC）系中培养出运动神经元SOD1、TDP-43，或C9或72在本研究中，我们提供证据表明，尽管缺乏明显的运动神经元丢失，但在iPSC衍生的运动神经元培养物中积累了不溶性、聚集性蛋白质，但其含量和水平因遗传背景而异。此外，尽管iPSC-derived运动神经元在暴露于热应激时通常能够诱导HSR，但蛋白质聚集本身不足以诱导HSR或应激颗粒的形成。因此，我们得出结论，ALS iPSC-derived运动神经元重述了该疾病的关键早期病理特征，并且不能内源性上调HSR以应对蛋白质负荷增加。

关键词：BAG3；C9或72；热休克蛋白B1；HspB8；OPTN；SOD1；TDP-43；应力颗粒。

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数字

图1
图1
来自多种ALS基因型的iPSC-derived运动神经元在培养中的存活率没有降低。（A）对Tuj1（绿色）、ChAT（红色）和Islet1（白色）的对照组和ALS运动神经元分化3周时的代表性图像进行免疫染色。Nuclei用Hoechst核染料（蓝色）标记。比例尺=50μm。（B）量化显示分化3周或4周时运动神经元的数量没有差异。n个= 3–4. Tukey的单向方差分析不显著事后的，事后的测试。
图2
图2
改变SOD1在SOD1和C9orf72运动神经元中的溶解度。（A）分化4周时，Hoechst核染色（蓝色）、SOD1（绿色）和Tuj1（白色）的代表性免疫细胞化学图像显示，与对照组相比，ALS运动神经元中带有SOD1+点状突起的神经元数量没有显著差异（ns，对>与Tukey单向方差分析0.05事后的，事后的测试）。与对照组相比，C9orf72和TDP-43运动神经元每个神经元的SOD1+点较少(*对Tukey单向方差分析<0.05事后的，事后的测试）。n个=3，比例尺=10μm（全图像）或2μm（展开）。（B）SOD1的蛋白质印迹显示ALS系与对照系相比没有显著差异。将数据归一化为REVERT总蛋白染色，并表示为对照组的倍数变化（ns，对>与Tukey单向方差分析0.05事后的，事后的测试，n个= 3–6).（C）滤器陷阱分析显示，SOD1和C9orf72运动神经元中的不溶性SOD1水平有增加的趋势，但iPSC集落中的SOD1含量没有增加（ns，对>与Tukey单向方差分析0.05事后的，事后的测试）。数据表示为控件上的折叠变化。n个= 3.
图3
图3
TDP-43运动神经元中TDP-43溶解度的变化。（A）分化4周时的典型图像显示，ALS运动神经元培养物中每个神经元的胞质TDP-43+点的神经元数量或TDP-43+点的数量没有变化（ns，对>单向方差分析0.05）。n个=3，比例尺=10μm（全图像）或2μm（展开）。（B）TDP-43蛋白的Western blot在ALS运动神经元培养物中的蛋白质水平没有显著差异。将数据归一化为REVERT总蛋白染色，并表示为对照组的倍数变化（ns，对>单向方差分析0.05，n个= 3–5).（C）TDP-43的滤器陷阱分析显示TDP-43运动神经元中的不溶性水平有增加的趋势，但iPSC菌落中的不溶解性水平没有增加（ns，对>与Tukey单向方差分析0.05事后的，事后的测试）。数据表示为控件的折叠变化，n个= 3.
图4
图4
OPTN不溶于SOD1和C9orf72运动神经元。（A）分化4周时Hoechst核染色（蓝色）、OPTN（绿色）和Tuj1（白色）的典型免疫细胞化学图像。OPTN+puncta（ns，对>与Tukey单向方差分析0.05事后的，事后的测试）。n个=3，比例尺=10μm（全图像）或2μm（展开）。（B）经Western blot检测，OPTN的总蛋白水平没有变化。数据归一化为REVERT总蛋白，并表示为对照组的倍数变化（ns，对>与Tukey单向方差分析0.05事后的，事后的测试）。n个= 3.（C）OPTN过滤陷阱分析显示SOD1和C9orf72运动神经元（ns，对>与Tukey单向方差分析0.05事后的，事后的测试）。在一个C9orf72 iPSC系的菌落中观察到不溶性OPTN，但在其他系中没有观察到。数据表示为控件的折叠变化，n个= 3.
图5
图5
ALS运动神经元改变了HspB1、HspB8和BAG3的表达。（A）ALS iPSC衍生运动神经元中BAG3、HspB1和HspB8转录水平没有显著增加，n个= 3–6.（B）BAG3的Western blot显示TDP-43运动神经元增加。数据归一化为REVERT总蛋白，并表示为对照组的倍数变化(*对通过Bonferroni的单向方差分析，<0.05事后的，事后的测试，n个=3）。（C）HspB1（绿色）和HspB8（红色）免疫细胞化学强度的定量显示，SOD1运动神经元中HspB八的蛋白水平显著增加(*对Tukey单向方差分析<0.05事后的，事后的测试，n个= 3). 比例尺=50μm。（D）S326磷酸化HSF1的Western blot显示ALS运动神经元中没有明显的HSR诱导。数据归一化为REVERT总蛋白，并表示为对照组的倍数变化（ns，对>与Tukey单向方差分析0.05事后的，事后的测试）。n个= 3.
图6
图6
SOD1和C9orf72运动神经元在急性热应激后诱导HSR。（A）与热休克1小时后未处理的样本相比，SOD1和C9orf72运动神经元的HspB1、HspB8和BAG3转录水平增加。将数据标准化为未经处理的对照(**对< 0.01,*对<0.05学生t吨-测试）。n个= 3–4.（B）S326磷酸化HSF1的Western blot显示，与热休克1小时后未处理的样本相比，对照组和SOD1运动神经元培养物中的HSR显著诱导。图5D中未经处理的western blot再次显示，以便于比较。将数据归一化为REVERT总蛋白染色，并表示为未经处理的对照样品的倍数变化。(**对< 0.01,*对<0.05学生t吨-测试）。n个= 3–4.
图7
图7
肌萎缩侧索硬化运动神经元没有表现出增强的应激颗粒形成。（A）Tuj1（白色）和G3BP（红色）的免疫细胞化学显示至少有一个G3BP+点的神经元数量没有差异，但C9orf72运动神经元每个神经元的G3BP+点较少(*对Tukey单向方差分析<0.05事后的，事后的测试）。n个=3，比例尺=2μm。（B）G3BP的蛋白质印迹显示在未处理或热休克的运动神经元中的蛋白质水平没有差异（ns，对>0.05（学生）t吨-测试）。将数据归一化为REVERT总蛋白染色，并表示为未经处理的对照样品的倍数变化。
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