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分子生物学杂志。作者手稿；PMC 2018年1月6日发布。
以最终编辑形式发布为：
分子生物学杂志。2017年1月6日；429(1): 128–141.
2016年11月21日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.jmb.2016.11.013
预防性维修识别码：下午518607
美国国立卫生研究院：NIHMS831359
PMID：27884606

BAG3是一种模块化的支架蛋白，它将热休克蛋白70（Hsp70）与小的热休克蛋白物理连接起来

詹妮弗·劳赫，1 Eric Tse（埃里克·谢），2 丽贝卡·弗里奇，1 素安木（Sue-Ann Mok），1 Leah N.Makley（利亚·马克利），1 丹尼尔·索斯沃思，2和杰森·E·盖斯特威基1,*
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关联数据

补充资料

摘要

小热休克蛋白（sHsps）是一个ATP非依赖性分子伴侣家族，对结合和稳定未折叠蛋白很重要。在这项任务中，sHsps被提议与ATP依赖性伴侣协调，包括热休克蛋白70（Hsp70）。然而，尚不清楚伴侣网络的这两个重要组成部分是如何联系在一起的。我们报告Hsp70共同伴侣BAG3是一个模块化的支架因子，将sHsps和Hsp70结合在一起。利用结构域缺失和点突变，我们证实BAG3利用其IPV基序与sHsps相互作用，包括Hsp27（HspB1）、αB-crystallin（HspB5）、Hsp22（HspB8）和Hsp20（HspB 6）。BAG3似乎不是一个被动脚手架因素；相反，它的结合促进了Hsp27的去低聚化，可能是通过竞争通常稳定大寡聚体的自我作用。BAG3与Hsp22、Hsp27或αB-crystallin同时结合到Hsp70，这表明它可能在物理上将伴侣家族结合成一个复合物。事实上，BAG3的加入协调了Hsp22和Hsp70重折叠变性荧光素酶的能力在体外总之，这些结果表明BAG3在物理和功能上连接Hsp70和sHsps。

图形摘要

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介绍

哺乳动物基因组包含多类分子伴侣，这些分子伴侣根据其大致大小命名，包括热休克蛋白90（Hsp90）、热休克蛋白70（Hsp70）、热应激蛋白40（Hsp40）和小热休克蛋白（sHsps）[1]. 每一类伴侣似乎都部分致力于蛋白质质量控制的各个方面[2]. 例如，Hsp70和Hsp90是ATP酶，它们利用核苷酸水解来调节与未折叠或部分折叠蛋白质的可逆结合，稳定许多“客户”并支持其折叠和/或贩运[三；4]. 其他伴侣，如Hsp40，似乎会为Hsp70和Hsp90系统招募特定客户[5]. 拥有多个不重叠类别的伴侣的重要性因其在所有生命王国中令人难以置信的保护而突显出来[6–8].

伴侣共同构成一个网络，维持全球蛋白质折叠和功能[1]. 在伴侣网络中，许多主要伴侣相互进行身体互动。例如，Hsp70和Hsp90的原核同源基因直接相互结合[9；10]Hsp70和Hsp110的正交曲线也是如此[11]. 在哺乳动物中，Hsp70在物理上与Hsp90相连，但通过支架蛋白HOP（Hsc70-Hsp90组织因子）。HOP是Hsp70/Hsp90介导的类固醇激素受体活化所必需的[12–15]可能是通过促进陪同人员之间的客户转移[16；17]. 因此，哺乳动物的伴侣网络似乎是通过伴侣蛋白和支架蛋白之间的蛋白-蛋白质相互作用而结合在一起的。这一特性可能使未折叠的客户受到一系列紧密联系的物理交互因素的保护，可能会限制他们接触旁观者蛋白质。

在伴侣网络中，小分子热休克蛋白（sHsps）是一个庞大而神秘的类别[18]. 在人类中，sHsp家族有十个成员，通过HSPB10表示为HSPB1[19]. 与其他分子伴侣家族（如Hsp70或Hsp90）不同，sHsps不具有酶活性；相反，sHsps的功能是“保持酶”，这是一个术语，指它们结合和稳定变性或非天然蛋白质抵抗聚集的能力[20；21]. 单个sHsps的大小从12到43 kDa不等，它们由保守的α-晶体蛋白结构域的存在定义。在每个sHsp中，α-晶体蛋白结构域，其两侧是可变的无序N-和C-末端结构域，这些结构域包含磷酸化位点并可能与客户结合[22]. Hsp27的α-结晶蛋白结构域的结构已通过NMR求解，其特征是反平行的β片介导稳定的二聚化[23–25]. 此外，α-晶体蛋白结构域包含两个高度保守的β片，称为β4–β8，形成疏水沟槽。在一些sHsps中，如Hsp27和α-晶体蛋白，C末端的IXI基序与该凹槽结合并稳定高阶低聚物[26–29]具体来说，sHsp的一个单元的IXI基序似乎回到了另一个的β4–β8凹槽。这个凹槽甚至可以支持不同sHsp家族成员之间的异聚体[30；31]. 低聚物通常是多分散的，大小范围为约12至40个二聚体亚基[30；32；33].

sHsps绑定和稳定客户端的方法仍在探索中。一个模型表明，sHsp寡聚体在客户面前解离，然后重新形成一种新的寡聚形式，其中包含结合客户[34；35]. 这个想法得到了电子显微镜的支持[20；36]和质谱研究[37–39]. 研究还表明，较小的sHsp低聚物是更有效的保持酶在体外[39；40]即使是sHsps的片段也可以绑定客户端[41]. 这些观察结果表明，较小的低聚物可能更好地结合客户。在细胞中，一些sHsps的磷酸化迫使较大的寡聚物变成较小的寡聚物，可能为细胞应激信号传递提供了一种增加伴侣功能的方法[39；42；43]. 类似地，一些sHsps也可以感知pH值[44；45]调整结构以保护客户。

我们对伴侣网络的理解中的一个主要差距是，sHsps如何与其他主要组成部分联系起来。这个问题很重要，因为sHsps缺乏其他类别伴侣主动重塑或重折叠所需的酶活性。相反，有人建议sHsps与细胞内的其他伴侣系统（包括Hsp70）协同工作[46；47]. 在这个模型中，sHsp寡聚体可能会与客户互动，并使他们处于能够被Hsp70重塑的状态。

Bcl-2相关Anthanogene-3（BAG3）是一种应激诱导的61kDa蛋白，其特征是存在多种蛋白相互作用基序(图1a)被预测的混乱的长区域隔开。BAG3是共伴侣蛋白BAG家族（BAG1–5）的一个成员，其特征是一个保守的BAG结构域。众所周知，BAG结构域与Hsp70家族成员的核苷酸结合域（NBD）结合[48；49]. 这种蛋白质相互作用有助于从伴侣中释放ADP，以促进核苷酸循环。BAG3与Hsp70的结合比BAG1或BAG2紧密[50]它是最有效的核苷酸交换因子（NEF），表明它是Hsp70的重要功能伙伴。在BAG领域之外，BAG家族的成员还拥有许多其他不共享的图案。例如，BAG3包含一个WW结构域，该结构域已被证明对结合PPxY基序蛋白（如RAPGEF6）很重要[51]和SYNPO2[52]. BAG3的PXXP区域与SH3结构域蛋白（包括Src）的相互作用有关[53]和PLC-γ[54]，一种可能将BAG3和Hsp70连接到信号通路的相互作用。最后，也是本研究最重要的一点是，BAG3包含两个IPV基序，在其N末端由~100个氨基酸分开。BAG3被提议通过其IPV基序与sHsps相互作用[55–57]，可能模拟了IXI基序和β4–β8凹槽之间通常发生的分子内相互作用。

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BAG3与小的热休克蛋白结合。（A） BAG3的结构域示意图，以及本研究中使用的缺失和点突变。删除的域用连接线表示。（B） ITC结果证实了BAG3对sHsps的相对亲和力。结果代表了一式三份进行的实验。错误是SEM。

基于这些相互作用，BAG3可能是一种支架蛋白，将sHsps与Hsp70系统物理连接起来。测试此模型在体外，我们生成了一组BAG3构造，其中单个域发生了变异或删除。我们发现BAG3利用其两个IPV基序与sHsp家族的多个成员相互作用。有趣的是，我们发现BAG3结合不是被动的；相反，根据色谱和电子显微镜判断，它破坏了Hsp27低聚物。这一发现表明，BAG3可能会主动重塑sHsps，潜在地激活它们或改变它们与客户的交互。事实上，我们发现BAG3可以协调Hsp22和Hsp70的重折叠变性荧光素酶的能力。最后，我们能够证明BAG3可以同时桥接两个伴侣家族，并且这种物理交互依赖于BAG3的IPV和BAG域。基于这些数据，我们认为BAG3是伴侣网络这两个重要组成部分之间的连接。

结果

BAG3绑定多个sHsps

为了研究与BAG3的相互作用，我们选择了在所有人类组织中普遍表达的sHsp家族的四个成员[19]：Hsp27（HSPB1）、α-晶体蛋白（HSPB5）、Hsp20（HSPB6）和Hsp22（HSPB8）。在这些蛋白中，Hsp20、Hsp22和α-晶体蛋白被报道通过联合免疫沉淀和下拉研究与BAG3相互作用[55；57]; 然而，这些相互作用的亲和力尚不清楚。因此，我们采用等温滴定量热法（ITC）来更好地理解它们(图1b). 有趣的是，BAG3与Hsp22（1.2±0.3µM）和Hsp20（1.2±0.7µM。由于竞争相互作用的可能性和sHsps的结构异质性，报告的KD类值最好用作相对值。无论如何，这些结果支持BAG3使用IPV基序与sHsps相互作用的观点，因为Hsp22和Hsp20缺乏自己的IXI基序，主要以二聚体或四聚体的形式存在于溶液中[56；58]而Hsp27和αB-crystallin具有IXI基序并形成较大的寡聚体。

为了更好地理解BAG3是否可能与IXI基序竞争，我们研究了BAG3与两个Hsp27变异体的相互作用。Hsp27-3D是一种在溶液中形成较小寡聚体的三重类磷酸突变体[39]而Hsp27c是一种截断形式，仅包含核心α-晶体蛋白结构域，且仅为溶液中的二聚体[25]. 我们发现Hsp27c与最紧密的亲和力（KD类约0.49±0.06µM），然后是Hsp27-3D（3.5±1.7µM。这些结果表明，较大的Hsp27寡聚体对BAG3的亲和力最弱，而二聚体结合力最强。我们假设这种差异是因为sHSP中的IXI基序和BAG3中的IPV基序之间的竞争（见下文）。此外，ITC结果表明，每个sHsp:BAG3相互作用的化学计量比约为2:1(图1b). 这是一个有趣的结果，因为BAG3包含两个IPV基序，因此它可能与sHsp二聚体两侧的保守β4–β8凹槽相互作用。

BAG3使用IPV基序与β4–β8区域相互作用

为了更明确地解决这个问题，我们制备了标记的Hsp27c，并通过15N个-1N HSQC核磁共振。我们在β4–β8区域观察到选择性化学位移扰动（CSPs）(补充图S1A)与BAG3与本地IXI图案竞争的想法一致。此外，在含有IPV的短肽中缬氨酸突变为丙氨酸削弱了其表观亲和力(补充图S1B)，表明IPV很重要。接下来，我们生成了BAG3变体，其中单个域被系统删除。这些缺失包括BAG3变体：ΔWW、Δ87-101、Δ200-213、Δ87-101和Δ200-233、ΔPXXP、ΔBAG和BAG3C（参见图1a). 截短Δ87–101、Δ200–213、Δ87-101和Δ200-213分别删除了第一个IPV基序和/或第二个IPV模序，而其他截短则删除了其他蛋白质相互作用的已知域。最后，BAG3C仅由BAG域组成，因此我们可以使用它来了解该区域的作用。我们使用ITC分析截短的蛋白质与Hsp27c的结合(图2)并发现ΔWW、ΔPXXP或ΔBAG蛋白与全长（约0.5至0.7µM）结合的亲和力大致相同。BAG3C构造未按预期绑定到Hsp27c。这些结果与IPV基序在与sHsps结合中的作用一致，并表明其他结构域并不参与。更有趣的是，我们发现单个IPV基序的缺失（Δ87–101，Δ200–213）或第一个IPV基模对GPG的突变（称为IPV1）将亲和力降低了至少2倍（约1至2µM）。单个IPV基序的突变或缺失也将相互作用的化学计量比（N）从2:1降低到约1:1(图2b). 当两个IPV基序都被删除（Δ87–101&Δ200–213）或突变（IPV1和IPV2到GPG）时，结合被废除。对这些结果的最简单解释是，BAG3利用其两个IPV基序与Hsp27c二聚体结合。

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BAG3使用两个IPV基序来绑定sHsps。BAG3中的缺失和点突变表明，IPV基序对于使用ITC结合Hsp27c很重要。实验重复进行，误差条为SEM。参见补充图S2用于绑定到其他sHsps。

为了探讨这种双齿结合模式是否在与其他sHsps的相互作用中保持不变，我们使用流式细胞术蛋白相互作用分析（FCPIA）测量了每个BAG3突变体与Hsp27、αB-crystallin、Hsp22和Hsp20的结合。与使用Hsp27c获得的结果一致，一个IPV基序的缺失或突变削弱了每个全长sHsps的表观结合亲和力（通常约为2倍）(补充图S2). 移除这两个IPV基序会阻止与Hsp27、Hsp27-3D、Hsp20和αB-晶体蛋白（KD类>50µM），Hsp27c和Hsp22的亲和力降低了25倍以上（KD类约10至20µM）。用GPG替换两个IPV基序具有相似的效果；与Hsp27、Hsp27-3D和αB-晶体蛋白的结合是无法测量的（KD类>50µM），Hsp27c、Hsp20和Hsp22的亲和力减弱（KD类约3µM）。总之，这些结果表明BAG3使用其两个IPV基序与sHsps相互作用。这些相互作用不一定涉及两个与单个二聚体结合的IPV基序，尤其是在更复杂、多分散的sHsp低聚物的背景下。

BAG3降低Hsp27低聚物的大小

我们知道BAG3利用其IPV基序与sHsps相互作用，而sHsp也利用其IXI基序来调节其低聚物的大小，因此我们想知道BAG4是否会破坏sHsp-低聚物。为了验证这一假设，我们首先使用了具有多角度光散射的尺寸排阻色谱法（SEC-MALS）。该技术允许根据光散射强度作为角度的函数来测定样品的分子量。在这些实验中，我们将重点放在Hsp27上，因为已知它会形成大的寡聚物，可以通过电子显微镜进行观察（见下文）[44]. 仅注射Hsp27（30µM）即可获得平均质量为425 kDa的SEC-MALS示踪(图3a). 该质量对应约18个单体亚基，这与文献值一致[59]. 此外，Hsp27峰很宽（质量范围为390–470 kDa），表明先前观察到的低聚物的多分散系综[60]. 向该样品中添加BAG3有效地将表观低聚物尺寸从425kDa减小到330kDa(图3a). 这一变化代表了预测的平均亚基大小从约18个单体下降到约14个单体，支持了BAG3可以分解Hsp27低聚物的假设。重要的是，这一估计值是一个保守的上限，因为BAG3也可能有助于表观分子质量。如果根据ITC结果，我们假设化学计量比为2:1，那么低聚物将由~6个单体组成。尽管由于样品的异质性，很难得出明确的结论，但定性结论是BAG3破坏了Hsp27低聚物。

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BAG3结合降低了Hsp27低聚物的大小。（A） Hsp27（30µM）与BAG3浓度增加一起培养，并通过SEC-MALS分析混合物。BAG3降低了Hsp27峰的平均分子量，增加了样品的多分散性。重复进行了两次实验，并用SEM报告了平均分子量。重要的是，对复合物中Hsp27亚基数量的估计不包括结合态BAG3的贡献质量，因为化学计量尚不清楚，因此应将其视为保守上限。（B） 低聚物颗粒的2D类平均值显示出平均颗粒尺寸的适度减小。比例尺为10 nm。（C） 通过负染电子显微镜测量，BAG3减少Hsp27低聚物的数量。比例尺为20 nm。

为了以另一种方式验证这一观点，我们使用了电子显微镜（EM）。我们发现，使用阴性染色EM可以看到Hsp27的低聚物，平均大小为115×140埃(图3b). 重要的是，我们预计较小的低聚物，如二聚体，通过这种方法是“看不见的”，因为它们不容易积聚污渍。事实上，这一特性使我们能够询问BAG3是否可以通过两种方法将Hsp27样本转化为较小的低聚物。首先，我们检查了所有可见粒子，并测量了它们的尺寸，看看BAG3是否有利于较小的结构。事实上，我们发现当用30µM BAG3处理时，Hsp27粒径减小到105×125埃(图3b). 接下来，我们计算网格中可见Hsp27粒子的总数，以估计BAG3是否改变了整个寡聚体的数量。Hsp27的小寡聚体和二聚体预计不会保留染色，因此，通过这种方法无法看到。引人注目的是，我们发现BAG3以剂量依赖的方式强烈减少了可见粒子的总数(图3c). 具体而言，仅在Hsp27显微照片中观察到的低聚物平均数量为505个粒子/场。在恒定浓度的Hsp27（30µM）下，随着BAG3数量的增加，大颗粒的数量急剧增加：在7.5µM BAG3存在下为203个，在15µM BA G3存在时为119个，而在30µM BAG3的存在下只有53个低聚物颗粒。在这一阶段，Hsp27-BAG3络合物的精确化学计量比和处理样品的尺寸分布尚不清楚。然而，这些结果表明，在与BAG3结合的过程中，IXI基序的竞争不是静态的，它会导致Hsp27低聚物的平均尺寸减小。

BAG域对Hsp70 NEF功能至关重要

BAG3与Hsp70（K）的NBD形成紧密相互作用D类~10 nM）刺激ADP释放[50]. 虽然已知该过程需要BAG结构域，但尚不清楚BAG3的其他区域，尤其是IPV基序是否有助于Hsp70结合。为了探索这个想法，我们测量了BAG3缺失突变体与Hsp70的结合。使用FCPIA，我们首先确认ΔBAG不能再与Hsp70结合(图4a)，与文献一致。ITC也证实了这一结果(图4b). 其他缺失或突变对BAG3-Hsp70亲和力的影响较小（通常小于2倍的还原），表明大多数结合能来自BAG结构域。

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BAG3通过其BAG域结合Hsp70并刺激客户端释放。通过（A）FCPIA和（B）ITC将标记的BAG3与固定化的Hsp70结合。结果是一式三份实验的平均值。误差条代表EM。（C）BAG3从Hsp70 NBD释放荧光核苷酸。删除BAG域会阻止此活动。结果是一式三份实验的平均值。错误是SEM。

为了在另一个平台上验证这一发现，我们转向了核苷酸释放测定。在该分析中，Hsp70装载荧光ATP类似物，然后通过荧光偏振（FP）测量BAG3释放示踪剂的能力[50]. 我们发现，所有结构域缺失结构体促进Hsp70核苷酸释放的能力大致相等(图4c)，但ΔBAG构造除外。总之，这些结果指向一个模型，其中BAG域与Hsp70的NBD的相互作用在很大程度上与BAG3的其他部分“绝缘”，包括IPV基序。

Hsp70-BAG3-sHsp形成三元络合物

在表征了BAG3-sHsp和BAG3-Hsp70之间的单个二元相互作用之后，我们开始确定是否可以形成三元Hsp70-BAG3-sHspp络合物。迄今为止的结合研究结果表明，BAG3可能是一种模块化支架蛋白，因此预测与Hsp70的结合不会影响与sHsps和反之亦然为了解决这个问题，我们将Hsp22、α-晶体蛋白或Hsp27固定在链霉亲和素珠上，用恒定浓度的Alexa 647标记的BAG3（50 nM）培养它们，然后添加更多的Alexa488标记的Hsp70下一个工作日(图5a). 不幸的是，我们无法为本研究固定足够水平的Hsp20。如果Hsp70下一个工作日可能与sHsp竞争与BAG3的结合，我们预计滴定时Alexa 647信号会减少。然而，我们观察到Hsp70存在时荧光没有降低下一个工作日(图5a; 顶部）。此外，由于我们标记了BAG3和Hsp70下一个工作日使用具有不同光谱特性的荧光团，我们还能够通过监测Alexa 488信号的增加来确认两种蛋白质同时结合(图5a，底部）。Hsp70的明显亲和力进一步支持了模块化交互的想法下一个工作日-与二元相互作用相比，Hsp22、α-晶体蛋白或Hsp27存在时，BAG3相互作用（~15nM）不变。这些发现表明，sHsps和Hsp70不会干扰（或促进）与另一个伴侣的结合。在重要的对照研究中，我们发现Hsp70下一个工作日在没有BAG3的情况下，不能结合Hsp22、α-晶体蛋白或Hsp27(图5a). 因此，Bag3似乎是两个伴侣家族的模块化支架蛋白。

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BAG3与Hsp70稳定三元络合物。（a） 在存在sHsp（a-crystallin，Hsp27或Hsp22）涂层珠的情况下，使用Alexa Fluor 647标记的BAG3溶液滴定Alexa Fluor 488标记的Hsp70 NBD。使用流式细胞仪检测结合。实验一式三份，误差为SEM。给出了结合实验示意图。请注意，sHsp低聚物大小是异质的。（B） 对Hsp22（6μM）、BAG3（12μM）和Hsp70（6µM）溶液或单个组分溶液进行SEC和SDS-PAGE分析。在所有实验中，添加ATP（1 mM）有利于Hsp70与BAG3紧密结合。

为了证实这一观点，我们通过尺寸排除色谱（SEC）分析了Hsp70、BAG3、Hsp22或三者混合物的溶液。Hsp22因其紧密的亲和力而被选为本实验的研究对象（参见图1b)以及其在SEC上相对均匀的低聚物尺寸分布(图5b). 此外，添加ATP（1 mM）有利于Hsc70的紧密结合下一个工作日至BAG3。该平台中的其他sHsps过于异构，无法得出结论。然而，我们发现当单独注射时，Hsp70、BAG3和Hsp22在SEC迹线上可以清楚区分(图5b). 此外，这些成分的预培养显示出向高阶复合物的转化(图5b). 通过收集组分并对其进行SDS-PAGE分析，所有三种蛋白质都是该复合物的一部分。因此，BAG3似乎是连接Hsp22和其他sHSPs与Hsp70的衔接蛋白。

Hsp22促进BAG3的协同伴侣活性在体外

为了探讨三元复合物的可能功能含义，我们测量了Hsp70的两种伴侣活性：ATP转换和萤火虫荧光素酶重折叠。ATP酶活性通常使用比色孔雀石绿测定法进行测量，而复性活性则通过用伴侣蛋白处理变性萤火虫荧光素酶并监测发光恢复来进行测量。众所周知，BAG3的亚化学计量浓度可以促进Hsp70的核苷酸转换，因为它克服了循环中的速率限制步骤。同样，低水平的BAG3被认为在重折叠测定中平衡了荧光素酶的结合和释放，增加了重折叠酶的产量。然而，在这两种测定中，较高浓度的BAG3似乎会使Hsp70停滞，从而使其从刺激因子转化为明显的抑制剂[50].

使用这些分析，我们改变了BAG3和Hsp22的浓度，保持Hsc70（1µM）的水平不变。重要的是，我们发现在没有BAG3的情况下，Hsp22对ATP酶活性或荧光素酶重折叠没有显著影响(图6A和6B)，因此该sHsp是这些实验的理想选择。在ATP酶测定中，我们观察到Hsp22具有显著的促进BAG3活性的能力(图6A). 例如，当Hsp22浓度为0.5µM时，BAG3成为循环的有力抑制剂。在2µM的浓度下，这种效应更加显著，使得BAG3在其通常不活跃的浓度下成为一种强抑制剂(例如0.125微米；图6A). 我们注意到Hsp22在低浓度（0.125和0.0625µM Hsp22；图6A); 然而，这一趋势没有统计学意义（p值>0.01）。

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Hsp22通过BAG3影响Hsp70的伴侣功能。（A） 用孔雀绿法测定Hsp70的ATP酶活性。添加BAG3抑制ATP酶活性，与之前的报告一致。Hsp22促进这种活性，使BAG3在低浓度下更有效。结果是至少三次独立实验的平均值，共三次。误差线代表SD。重要的是，在没有BAG3的情况下，Hsp22对Hsp70的ATP酶活性没有影响。（B） Hsp22与Hsp70-BAG3协调以折叠变性荧光素酶。将BAG3滴定为Hsp70最初会促进荧光素酶的复性，但在较高浓度下会变得抑制。Hsp22的加入促进了荧光素酶的重折叠。结果是至少三次独立实验的平均值，共三次。误差条代表SD。在A和B中，结果显示为相同数据的二维和三维显示。

使用类似的方法测量BAG3和Hsp22对荧光素酶复性的可能影响。萤火虫荧光素酶的伴侣介导的重折叠需要客户端结合和释放的仔细平衡，这最终有利于折叠的酶活性状态。我们观察到，将Hsp22滴定到Hsc70-BAG3系统中强烈促进荧光素酶的重折叠，当Hsp22高于1µM时，发光增加了2-3倍(图6B). 同样，这种活化高度依赖于与BAG3的协同作用，因为在没有BAG3或BAG3浓度较高的情况下，Hsp22无法促进复性。这些结果表明，BAG3在重折叠受损荧光素酶的背景下调节Hsc70和Hsp22的伴侣功能。

讨论

BAG3利用其两个IPV基序结合sHsps

据报道，使用下拉框，BAG3通过其IPV基序与一些sHsps相互作用[56；57]. 利用核磁共振，我们首先证实BAG3结合核心晶体蛋白结构域的保守β4–β8区域，IXI基序通常位于该区域（参见补充图S1). 此外，删除或突变BAG3的任一IPV基序都会削弱与Hsp27、Hsp20、Hsp22和αB-crystallin的结合，而删除或突变它们都会在很大程度上取消结合（参见图1). 这些结果表明，BAG3利用其两个IPV基序接合两个β4–β8凹槽。在最简单的情况下（例如Hsp27c），这种相互作用可以通过“钳形”机制发生，两个IPV基序在单个二聚体内进行接触。IPV基序之间有足够的距离（~100个氨基酸；参见图1a)允许这样的相互作用，并且从ITC计算的2:1化学计量是支持的。然而，形成较大低聚物的sHsps，例如由全长Hsp27或αB-晶体蛋白形成的sHsp，可能以更复杂的方式与BAG3相互作用。事实上，似乎单个BAG3可能使用两个IPV基序结合低聚物内邻近原聚体中的β4–β8区域，而这些原聚体不一定是单个同二聚体的一部分。

该模型的一个重要含义是，BAG3可能会抑制某些sHsps的齐聚。具体来说，已知一些sHsps的IXI基序在将二聚体连接到高阶低聚物中很重要。这一观点得到了以下事实的支持：Hsp20和Hsp22都缺乏自己的IXI基序，并且据报道在溶液中形成相对较小的低聚物[56；58]. 事实上，我们发现，根据SEC-MALS和EM判断，全长Hsp27与BAG3孵育导致低聚物大小和频率的总体降低。因此，BAG3似乎不是一种“被动”支架蛋白。相反，它与sHsps的相互作用竞争IXI结合并部分破坏四元结构。正如我们在荧光素酶重折叠实验中观察到的那样（见下文），这种结构变化可能具有功能意义。值得注意的是，IXI基序以外的相互作用也有助于形成高阶低聚物，因此BAG3似乎不太可能将低聚物转化为完全二聚状态。

BAG3是伴侣网络两个组成部分的模块化支架蛋白

Hsp70和sHsps构成了一个古老的系统，用于在蛋白质毒性应激条件下保护蛋白质。sHsps能够结合和稳定未折叠/变性的蛋白质，并使其保持复性竞争形式[21]. 由于sHsps缺乏固有的复性能力，因此必须与ATP驱动的复性系统合作，例如Hsp70系统[61]. 事实上，这两方面都得到了证明在体外和体内sHsp底物可以被Hsp70伴侣系统重折叠[62–65]. 然而，对sHsps如何与Hsp70系统通信的机制性理解尚不明确，尤其是对哺乳动物系统而言。

利用FCPIA和SEC，我们发现BAG3可以与Hsp27、Hsp22和αB-crystallin同时结合到Hsp70。多项证据表明，这三元复合物中两种蛋白质相互作用的强度(例如BAG3-Hsp70、BAG3-sHsp）不受其他因素的影响。例如，在Hsp70存在的情况下，BAG3与Hsp27、Hsp22和αB-crystallin相互作用的表观亲和力没有显著差异（参见图5). 此外，从BAG3中删除BAG结构域或IPV基序不会影响与其他伙伴的结合（参见图2和图4). 因此，BAG3似乎是一种将sHsps与Hsp70物理连接的模块化支架蛋白。通过这种方式，BAG3可能起到支架蛋白HOP的作用，HOP协调Hsp70-Hsp90轴[66]. 在这个系统中，HOP被认为是在伴侣之间组织部分折叠客户的“交接”，例如核激素受体。我们推测哺乳动物的伴侣网络可能包含这种支架蛋白的其他例子。

BAG3在变性荧光素酶复性过程中协调Hsp22和Hsp70的功能

因为Hsp27和α-晶体蛋白的较小寡聚体被证明是更有效的伴侣[39；40]我们发现BAG3可以竞争IXI基序，这些基序有助于结合低聚物（参见图3)，我们想知道BAG3是否可能促进sHsp伴侣活性。此外，众所周知，BAG3通过其BAG结构域的相互作用来调节Hsp70的伴侣功能，因此它可能会协调sHsps和Hsp70s的活动。事实上，我们发现BAG3、Hsp22和Hsp70的组合（以适当的比例）是一种有效的复性机器（参见图6). 这个过程的机械细节尚不清楚，这个三元复合物在细胞和动物中是否具有重要的功能尚待观察。然而，这些结果表明BAG3是sHsps和Hsp70之间的物理和功能联系。通过这种方式，BAG3不是一种“被动”支架蛋白，而是一种重塑其伴侣活性的蛋白。

BAG3以~13nM的亲和力与Hsp70结合（参见图4)在ATP状态下，其对sHsps的亲和力在~8700到350 nM之间（参见图1). 尽管关于“客户端”蛋白、表达水平和翻译后修饰如何影响细胞中这些明显的亲和力常数还有很多需要了解的，但有趣的是，BAG3对Hsp70的亲和力比sHsps更紧密。这一观察表明，BAG3和Hsp70形成了相对稳定的对，可能只是暂时与sHsps协调。

BAG3可能是伴侣网络的应激诱导调节因子

BAG3是BAG家族中唯一的应激诱导成员，因此我们认为其独特的支架功能在有利于蛋白质去折叠和聚集的条件下可能特别重要。在这种情况下，BAG3的应激诱导表达可能会将sHsps和Hsp70结合在一起，同时“激活”这两个系统。很明显，其他应激诱导机制，如sHsps的磷酸化[42；43]也有助于适应性蛋白质平衡。然而，BAG3的表达也可能通过其协调伴侣网络两个主要组成部分的能力在这一过程中发挥作用。

方法

克隆与重组蛋白生产

从BAG3 pMCSG7亲本载体亚克隆所有结构域缺失构建物，并通过DNA测序进行确认。使用标准诱变方案构建突变。Hsp27、Hsp27c、Hsp17-3D和α-晶体蛋白的构建物均来自Klevit实验室。Hsp22是Jean-Marc Fontaine赠送的礼物，Hsp20是从Conklin实验室获得的，随后克隆到pMCSG7载体中。将所有构建物转化为BL21（DE3）细胞，并使用单个菌落接种含有氨苄西林（50µg/mL）的TB培养基。培养物在37°C下生长5小时，冷却至20°C，并用200µM IPTG诱导过夜。如前所述纯化BAG3全长和IPV突变体[50]. 将BAG3缺失构建物造粒并重新悬浮在His-binding缓冲液（50 mM Tris，300 mM NaCl，10 mM咪唑，pH 8.0）+3M尿素中。对样品进行超声波处理，然后将其应用于Ni-NTA树脂。在Ni-NTA柱后，所有蛋白质经过过夜TEV裂解，浓缩并应用于BAG缓冲液中的Superdex S200（GE Healthcare）尺寸排除柱（25 mM HEPES，5 mM MgCl2，150 mM KCl pH 7.5）。Hsp72和Hsp72下一个工作日按别处所述进行净化[67]. 含有N-末端His标签的质粒（Hsp27-3D、α-结晶蛋白、Hsp22和Hsp20）中的sHsp均使用His柱进行纯化，随后在BAG缓冲液或PBS中的Superdex S200上进行SEC，如先前报道的那样[33]. Hsp27和Hsp27c是无标记载体，因此使用两步硫酸铵沉淀法纯化它们，然后使用MonoQ和SEC。简单地说，将硫酸铵添加到最终浓度16.9%（w/v），离心，丢弃颗粒，然后再添加16.9%（w/v）将硫酸铵添加到上清液中以从溶液中沉淀蛋白质。提取沉淀蛋白并透析至MonoQ缓冲液A（20 mM Tris，pH 8.0）中过夜，然后使用MonoQ柱（0–1 M NaCl梯度），最后在50 mM磷酸钠、100 mM NaCl-、pH 7.5缓冲液中平衡Superdex S75（Hsp27c）或Superdex-S200（GE Healthcare）上的SEC。在整个手稿中，sHSPs的浓度是根据有效单体浓度而非低聚物浓度报告的。

根据供应商的说明，用Alexa Fluor®488 5-SDP酯或Alexa Fluor®647 NHS酯（Life Technologies）标记蛋白质。根据供应商说明，使用EZ-link NHS-Biotin（Thermo Scientific）对Hsp70和sHsp进行生物素化。标记后，对蛋白质进行凝胶过滤以去除未反应的标记。

等温滴定量热法（ITC）

BAG3构建体，Hsp72下一个工作日隔夜用ITC缓冲液透析sHsps（25 mM HEPES，5 mM MgCl2100 mM KCl pH值7.5）。使用BCA分析（Thermo Scientific）测定浓度，并使用25°C的MicroCal VP-ITC（GE Healthcare）进行实验。热休克蛋白72下一个工作日将注射器中的（100µM）或指示的sHsp（200µM。使用Origin®7.0软件计算热量参数，并使用单位点结合模型进行拟合。

流式细胞术蛋白质相互作用测定（FCPIA）

该分析程序采用了以前的报告[50]. 简单地说，生物素化的Hsp70被固定在链霉亲和素涂层的聚苯乙烯微球（Spherotech）上（室温下1h）。固定化后，清洗珠子以去除任何未结合蛋白，然后与标记的BAG3蛋白在指定浓度下孵育。使用Accuri™C6流式细胞仪检测结合，以测量中值珠相关荧光。用生物胞蛋白封端的珠作为阴性对照，并从信号中减去与珠的非特异性结合。

在三元络合物形成实验中，Hsp27或α-晶体蛋白被固定在恒定浓度（50 nM）的Alexa 647-标记BAG3存在的小球上。根据sHsp-BAG3溶液滴定Alexa 488-标记的Hsp72 NBD浓度的增加，并使用Accuri™C6流式细胞仪测量荧光。再次，用生物细胞素覆盖的珠子作为阴性对照，从信号中减去珠子的非特异性结合。

核苷酸释放试验

如前所述，使用荧光ATP类似物N6-（6-氨基）己基-ATP-5-FAM（ATP-FAM）（Jena Bioscience）测量BAG3诱导的Hsp72核苷酸解离[50]. 在黑色、圆底、低体积384孔板（Corning）中，在室温下将1µM Hsp72和20 nM ATP-FAM与不同浓度的BAG3蛋白在分析缓冲液（100 mM Tris、20 mM KCl、6 mM MgCl）中培养10分钟2pH值7.4）。孵化后，使用SpectraMax M5平板阅读器测量荧光偏振（激发：485 nm发射：535 nm）。

SEC-MALS公司

Hsp27（15µM）和BAG3（15或30µM均可）的溶液预先混合，并通过Ettan LC（GE Healthcare）上的Shodex 804柱上的分析尺寸排除色谱进行解析。分子量通过使用直列DAWN HELEOS探测器和Optilab rEX微分折射率探测器（Wyatt Technology Corporation）的多角度激光散射测定。在分析之前，将色谱柱在BAG缓冲液中平衡过夜。在指示的浓度下运行样品。使用ASTRA软件包（Wyatt Technology Corporation）计算分子量。

尺寸排除色谱法

使用Superdex S200（GE Healthcare）尺寸排除柱检查BAG3（6µM）、Hsp72（6µ）、Hspe22（12µM。收集指示的级分，并使用SDS-PAGE分析进行分析。使用4–15%Tris-Tricine凝胶（Bio-Rad）分离样品，并用考马斯蓝染色。为了清晰起见，图像颜色更改为灰度。

电子显微镜

如前所述，预先培养、稀释Hsp27（30µM）和BAG3（7.5、15或30µM）的溶液，并将其应用于薄的碳涂层铜格栅中，使用甲酸铀酰在pH~6.0的条件下进行阴性染色70在配备120 kV LaB6灯丝的Tecnai T12显微镜（FEI）上采集电子显微照片。在4k×4k CCD相机（Gatan）上以50000倍放大率、2.2º/像素间距和1.0–1.3 a离焦范围采集图像。从显微照片中选择并提取颗粒图像，然后使用EMAN2软件从估计的CTF参数中进行相位校正71然后使用SPIDER软件包进行二维无参考对准和分类72使用一组代表每种BAG3浓度约1500个粒子的15级平均值来测量观察到的最长尺寸以及垂直距离，以获得粒子的平均尺寸。

伴侣分析

如前所述，Hsc70的稳态ATP酶活性用孔雀绿测定，化学变性萤火虫荧光素酶的重折叠用恢复发光测定[50]. 在1µM下使用Hsc70。DnaJA2在0.5µM下使用，ATP在1 mM下使用。在ATP酶实验中，结果被归一化为Hsc70和DnaJA1的信号，其中BAG3为30 nM（100%）。在荧光素酶重折叠实验中，结果被归一化为仅添加Hsc70和DnaJA2（100%）产生的发光信号。在这些浓度和培养时间下，该值仅代表可恢复的总发光信号的约40%。我们选择这些条件使BAG3和Hsp22有可能进一步提高复性活性。

​

集锦

  • BAG3同时结合小的热休克蛋白和Hsp70
  • BAG3减小小分子热休克蛋白低聚物的尺寸
  • BAG3协调sHsp和Hsp70重折叠变性荧光素酶的能力

补充材料

1

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2

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致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院NS059690（致J.E.G.）和美国国立卫生研究院EY017370（致D.R.S.）的支持。我们感谢David Agard、Rachel Klevit、Bruce Conklin和Michael Welch提供质粒和设备。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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