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.2016年5月；139（第5部分）：1417-32。
doi:10.1093/brain/aww028。 Epub 2016年3月1日。

热休克反应在TDP-43清除中起重要作用：肌萎缩侧索硬化症功能障碍的证据

Han-Jou Chen先生 1, 杰奎琳·米切尔 1, 谢尔盖·诺沃塞洛夫 2, 杰克·米勒 1, 阿格尼斯·西村 1, 艾玛·L·斯科特 三, 卡罗琳·万斯 1, 迈克尔·E·契特姆 2, 克里斯托弗·E·肖 4
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热休克反应在TDP-43清除中起重要作用：肌萎缩侧索硬化症功能障碍的证据

Han-Jou Chen先生等人。 大脑. 2016年5月.

摘要

耐洗涤剂、泛素化和高磷酸化的Tar DNA结合蛋白43（TDP-43，由TARDBP编码）神经元细胞质内含物是约95%肌萎缩侧索硬化和约60%额叶变性病例的病理特征。我们试图探索热休克反应在疾病细胞模型中清除不溶性TDP-43的作用，并在转基因小鼠和人类肌萎缩侧索硬化组织中验证我们的发现。热休克反应是一种由转录因子热休克因子1（HSF1）调节的应激反应保护机制，它可以增加伴侣蛋白的表达，从而使受损的错误折叠蛋白重新折叠或促进其降解。在这里，我们表明，通过表达显性活性HSF1来操纵热休克反应，导致不溶性和过度磷酸化的TDP-43显著减少，从而提高细胞存活率，而显性阴性HSF1的表达则导致TDP-43聚集和过度磷酸化度增加。为了确定哪些伴侣介导TDP-43清除，我们过度表达了一系列热休克蛋白（HSPs），并将DNAJB2a（由DNAJB2编码，也称为HSJ1a）鉴定为TDP-43的有效抗聚集伴侣。DNAJB2a具有J结构域，允许其与HSP70相互作用，泛素相互作用基序使其能够参与其客户蛋白的降解。使用功能缺失的DNAJB2a构建物，我们证明TDP-43的清除是J结构域依赖性的，不受泛素相互作用基序缺失或蛋白酶体抑制的影响。这表明，DNAJB2a将TDP-43保持在可溶状态，使TDP-43的总水平保持不变。此外，我们已经证明，在肌萎缩侧索硬化TDP-43转基因小鼠模型和散发性肌萎缩侧索性硬化患者的受影响神经组织中，HSF1和热休克蛋白的水平显著降低。这意味着肌萎缩侧索硬化症患者HSF1介导的DNAJB2a/HSP70热休克反应途径受损。据预测，TDP-43的折叠缺陷会加重TDP-43蛋白病。HSF1/HSP通路的激活可以减少不溶性TDP-43的病理积累，这一发现为新疗法的开发提供了一个激动人心的机会。

关键词：ALS；HSF1；TDP-43蛋白病；热冲击响应；分子伴侣。

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数字

无
不溶性TDP-43内含物是ALS和tau阴性额颞叶变性的病理特征。陈等。表明在ALS小鼠模型和患者中调节伴侣蛋白表达的热休克反应（HSR）受到损害。激活HSR可清除不溶性TDP-43并提高细胞存活率。
图1
图1
HSF1（+）的表达降低了不溶性TDP-43的水平。(A类)人类HSF1蛋白的蛋白质结构和本研究中使用的HSF1变体。(B类)HEK293T细胞共表达GFP-TDP-43和V5-HSF1结构体48小时，然后分馏。内源性HSP40和HSP70水平显示为HSR激活的指标。对三个独立转染的GFP-TDP-43水平进行量化，归一化为肌动蛋白，并显示与GFP-WT-TDP-43和仅载体对照的关系。显示了不溶性部分的平均值和SEM(C)和可溶部分(D类)双向方差分析表明，TDP-43溶解度的差异不是由TDP-43基因型或TDP-43和HSF1之间的相互作用引起的，而是由HSF1单独引起的(P（P）<0.001). 与仅载体对照组相比，HSF1（+）和HSF1（−）与GFP-TDP-43联合转染时，导致不溶性TDP-43水平发生显著变化(P（P）<0.001，Bonferroni后测试）。
图2
图2
HSF1（+）的表达拯救了TDP-43磷酸化。(A类)共表达GFP-TDP-43和V5-HSF1构建物的HEK293T细胞48小时后分馏。对来自三个独立转染的磷酸化TDP-43水平进行量化，归一化为肌动蛋白，并显示与GFP-野生型TDP-43和仅载体对照的关系。平均值和SEM如所示(B类). 双向方差分析表明，TDP-43磷酸化的差异不是由TDP-43基因型或TDP-43和HSF1之间的相互作用引起的，而是由HSF1单独引起的(P（P）<0.001). 当用GFP-TDP-43共转染时，与仅用载体的对照相比，HSF1（+）和HSF1（−）都显著改变了磷酸化TDP-43的水平(P（P）=0.02和P（P）<分别为0.001，Bonferroni后测试）。(C–F类)转染V5-HSF1和GFP-TDP-43载体48小时的HEK293T细胞中的磷酸-TDP-43染色(C)，GFP-WT-TDP-43型(D类)，GFP-M337V TDP-43(E类)和GFP-dNLS TDP-43(F类). 比例尺=20μm inC对三个独立的转染进行细胞计数，每个条件下300个细胞。同样磷酸化-TDP-43染色阳性的表达GFP-TDP-43的细胞的频率的平均值和SEM(G公司)和GFP-TDP-43转染效率(H（H）)如图所示。(我)GFP-WT-TDP-43和HSF1（−）转染的HEK293T细胞经磷酸化-TDP-42（红色）和泛素（洋红）染色。比例尺=5μm。
图3
图3
HSF1对初级神经元TDP-43细胞分布和磷酸化的影响。(A类)将GFP-WT-TDP-43（绿色）和V5-HSF1（红色）转染大鼠初级皮层神经元。βIII-管蛋白（品红色）用作神经元标记物。(B类和C)GFP载体(B类)或带有V5-HSF1的GFP-野生型TDP-43(C)转染到大鼠初级皮层神经元。转染6天后固定细胞，并对其进行V5（品红色）、磷酸化-TDP-43（红色）和细胞核（DAPI，蓝色）染色。比例尺=10μm。
图4
图4
HSF1（+）的表达可缓解TDP-43的毒性。(A类)对用GFP-TDP-43转染的SH-SY5Y进行48小时的细胞死亡分析。在该图中绘制了GFP阳性细胞，其中死亡细胞显示具有降低的煅烧AM荧光强度（如门控的）。GFP载体表达细胞以阴影线表示，而彩色线表示GFP-TDP-43表达细胞的不同基因型。(B类)显示三个独立转染SEM的GFP阳性细胞的平均死亡数量。与GFP载体控制相比，野生型和突变型TDP-43均会导致显著的细胞死亡（单向方差分析，然后是Bonferroni后验，P（P）<0.001). (C)一个有代表性的实验表明，HSF1（+）（蓝线）的存在降低了表达GFP-TDP-43的死亡细胞（红线）的水平。三次转染的平均细胞死亡如所示(D类).T型-该试验用于确定HSF1（+）是否能显著拯救TDP-43诱导的细胞死亡*P（P）<0.05;**P（P）<0.01;***P（P）<0.001.
图5
图5
筛选介导HSF1（+）诱导TDP-43清除的HSPs。(A类)HEK293T细胞共表达GFP-TDP-43和V5-HSP结构48小时，然后进行分馏。来自三个独立转染的不溶性TDP-43水平被量化，归一化为肌动蛋白，并显示为相对于对照的水平。平均值和SEM如所示(B类).
图6
图6
DNAJB2a通过将TDP-43引入HSP70介导TDP-43的复性。(A类)DNAJB2a的域结构，显示J（和H31）、客户端绑定（CBD）和UIM域的位置。(B类)共表达GFP-野生型TDP-43和myc-DNAJB2a的HEK293T细胞构建48小时后分馏。GFP抗体显示不溶性TDP-43的水平，磷酸化TDP-43通过磷酸化TDP-43特异性抗体检测。(C)用泛素蛋白酶体系统抑制剂MG-132（0.5μM，40 h）处理共表达GFP-WT-TDP-43和仅载体（vec）、HSF1（+）或myc-DNAJB2a的细胞，然后进行分馏。(D类)GFP-TDP-43和myc-DNAJB2a的共免疫纯化。Myc-DNAJB2a被Myc抗体拉下，GFP-TDP-43被TDP-43抗体检测到。(E类)GFP-TDP-43和V5-HSFP70的共离子纯化。V5-HSP70和V5-HSP 90被V5抗体拉下，GFP-TDP-43被GFP抗体检测。
图7
图7
TDP-43小鼠模型和散发性ALS受影响组织中的HSR下调。(A类)全脊髓裂解物由8周龄非转基因（Ntg）、野生型TDP-43单转基因（WT）、Q331K-TDP-43单转基因（Q）和WTxQ331K-TDP-43双转基因（WTxQ）小鼠制备。TDP-43印迹显示内源性和转基因TDP-43蛋白水平；HSR的组成部分用HSF1、HSP70、HSP40和HSP90表示；神经元标记物βIII微管蛋白和ChAT也可作为神经元缺失的指示物。Actin用作加载控件。(B类)8周龄非转基因和双转基因动物脊髓切片中HSF1的免疫组织化学染色。箭头和插图所示的选择性运动神经元。比例尺=50μm。HSF1水平(C)，热休克蛋白70(D类)和HSP40(E类)显示了对照组和散发的ALS脊髓裂解物。本研究使用了15个对照组和15个散发性ALS（SALS）样本，显示了具有代表性的western blot，所有样本均为t吨-测试比较*P（P）<0.05;**P（P）<0.01.
图8
图8
提出了HSR参与TDP-43蛋白折叠和蛋白病的模型。在HSR功能正常的健康状态下，HSF1激活HSPs的表达，如HSP70和DNAJB2a。DNAJB2a识别细胞液中错误折叠的TDP-43并将其带到伴侣蛋白HSP70。HSP70对TDP-43的重折叠进行催化，使其恢复到天然可溶状态，从而使TDP-43穿梭回细胞核。在疾病状态下，HSR因蛋白质水平降低或HSF1活性降低而受损。无论在哪种情况下，这都会导致热休克蛋白减少，而热休克蛋白随后无法有效接合错误折叠的TDP-43。因此，不溶性和磷酸化的TDP-43蛋白在受疾病影响的细胞中积累并形成细胞溶质聚集体。
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