干细胞。2016年8月；34（8）：2063–2078。
C9或72肌萎缩性侧索硬化和额颞叶痴呆患者诱导的多能干细胞衍生神经元内六核苷酸扩张与内质网钙稳态改变和应激颗粒形成相关
,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,2 ,三 ,2 ,1 ,三 ,4 ,1 ,2 ,
三和1 Ruxandra Dafinca公司
1纳菲尔德临床神经科学系
简·福尔斯
三英国牛津大学威廉·邓恩爵士病理学院詹姆斯·马丁干细胞研究所
凯西·布朗
三英国牛津大学威廉·邓恩爵士病理学院詹姆斯·马丁干细胞研究所
Mahito Nakanishi先生
4日本茨城筑波国家先进工业科学技术研究所干细胞工程研究中心
萨利·考利
三英国牛津大学威廉·邓恩爵士病理学院詹姆斯·马丁干细胞研究所
1纳菲尔德临床神经科学系
2生理、解剖和遗传学系
三英国牛津大学威廉·邓恩爵士病理学院詹姆斯·马丁干细胞研究所
4日本茨城筑波国家先进工业科学技术研究所干细胞工程研究中心
通讯作者。 *通讯员：Kevin Talbot，DPhil，英国牛津OX3 9DU，Headley Way，West Wing Level 6，John Radcliffe Hospital，Nuffield临床神经科学部。电话：1865‐223380；传真：+44（0）1865 231534；电子邮件：ku.ca.xo.ncdn@toblat.nivek; 或Sally A.Cowley博士，James Martin干细胞设施，William Dunn爵士病理学院，牛津大学，South Parks Road，OX1 3RE，United Kingdom。电话：1865‐275600；传真：+44‐1865‐275515；电子邮件：ku.ca.xo.htap@yelwoc.yllas公司 2015年10月20日收到；2016年2月26日修订；2016年3月19日接受。
版权所有©2016 The Authors STEM CELLS由Wiley期刊公司代表AlphaMed出版社出版 这是一篇根据知识共享属性许可证，允许在任何媒体上使用、分发和复制，前提是正确引用了原始作品。 - 补充资料
补充信息图。
指南：6B49F0FD-DE48-4859-A904-648C0D2CD0B1
摘要
非编码区的一个扩展的六核苷酸重复序列C9或72该基因是肌萎缩侧索硬化症（ALS）的主要病因，在欧洲人群中，该基因占家族性病例的40%，占散发性ALS的7%。我们已经从携带C9或72六核苷酸扩增，将其分化为功能性运动神经元和皮层神经元，并表现出广泛的表型特征。在C9或72iPSC衍生的运动神经元，细胞存活率降低与钙的功能障碍相关2+体内平衡、抗凋亡蛋白Bcl-2水平降低、内质网应激增加和线粒体膜电位降低。此外，C9或72运动神经元和皮层神经元显示异常蛋白质聚集和应激颗粒形成。本研究对iPSC衍生的运动神经元作为携带ALS的细胞模型进行了广泛表征C9或72六核苷酸重复序列，描述了C9或72突变、钙信号的失调和蛋白质组的改变，为治疗ALS和相关神经退行性疾病额颞叶痴呆提供了潜在的药理靶点。S公司电子显微镜C厄尔斯
2016;34:2063–2078
关键词：肌萎缩侧索硬化、额颞痴呆、诱导多能干细胞、，C9或72、钙调节障碍、运动神经元
重要性声明
中的更改C9或72基因已被确定为额颞叶痴呆（FTD）和肌萎缩侧索硬化（ALS）患者中最常见的潜在遗传异常，约占家族病例的40%，并在这两种疾病之间提供了明确的联系。这项研究代表了对细胞过程的广泛表征，这些过程受C9或72使用来自ALS/FTD患者的iPS衍生运动神经元和皮层神经元。我们的研究表明C9或72突变导致细胞内钙动力学的疾病特异性改变、基本细胞隔室形态的改变，以及两种受影响细胞类型中高水平的蛋白质聚集。我们的观察代表了iPS衍生运动神经元和大脑皮层神经元之间的首次直接比较C9或72为进一步研究致病突变的机制和探索疾病修饰疗法奠定了基础。
我介绍
六核苷酸（GGGCC）在第一内含子中的扩增C9或72基因约占家族性肌萎缩侧索硬化症（ALS）病例的40%，高达7%的散发性ALS，约20%的家族性额颞叶变性，在ALS和额颞痴呆（FTD）之间建立了牢固的遗传联系1,2,三扩张位于基因上游的内含子或启动子区域C9或72编码顺序和编号（GGGCC）n个患者体内的六核苷酸重复序列在100到4000之间1,2,4.C9或72相关病例表现出独特的神经病理学变化，其特征是大量细胞质和核内包涵体对泛素和固位体-1/p62呈免疫阳性，表明蛋白质降解受到干扰5,6,7.
虽然C9或72六核苷酸扩增的基因和致病机制目前尚不清楚，已经提出了几个假设。由（GGGCC）的积累介导的功能机制的毒性增益n个在患者的额叶皮层和脊髓中观察到的核灶内富含RNA转录物，可能导致RNA结合蛋白的螯合和不同信使核糖核酸的翻译中断1或核仁应力增加8或者，减少C9或72可能通过干扰蛋白质的组成功能而导致神经退行性变1,9最后，在没有起始ATG密码子的情况下发生的重复相关非ATG（RAN）翻译，经过GGGCC重复序列扩展，已经证明产生易于聚集的同聚蛋白10,11.
从患有神经退行性疾病如ALS的患者的皮肤成纤维细胞重编程的诱导多能干细胞（iPSC）在培养物中产生人运动神经元（MNs），为研究MN变性的关键病理过程和筛选具有潜在疗效的药物提供了一个潜在的强大工具。先前的研究表明，在ALS/FTD患者的iPSC衍生MN中可以检测到RNA焦点和RAN翻译产物C9或72六核苷酸扩增12,13,14自噬缺陷、RNA结合蛋白被扩增重复序列隔离、基因转录改变和神经元兴奋性改变的证据表明，这些模型可以显示与疾病相关的表型，这些表型可以通过用反义寡核苷酸靶向扩增RNA进行纠正13,14.
钙（Ca2+)调节障碍被认为在ALS的病理生理学中起着重要作用15和Ca2+神经元胞浆中的超载是一种潜在的机制，可能将兴奋性毒性与神经元死亡联系起来16内质网（ER）是最大的细胞内钙2+储存和高ER Ca2+浓度在蛋白质合成和加工活动中起着至关重要的作用。ER Ca中的干扰2+体内平衡与内质网应激反应的慢性激活和保护细胞的下游代偿机制有关，如未折叠蛋白反应（UPR）和自噬17ER‐应激诱导的细胞死亡可以在两种钙中进行2+依赖性和钙2+独立方式。抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL是钙的基本调节剂2+细胞内的信号传导，介导钙的减少和释放2+从而保护线粒体免受钙2+超载18,19.
为了探索钙是否发生变化2+稳态和内质网应激是与C9或72与ALS/FTD相关，我们从携带C9或72六核苷酸扩增并将其分化为MN和皮层神经元（CN）。我们在这里展示一下C9或72iPSC衍生MNs Ca损失2+体内平衡与线粒体电位降低和内质网应激增加有关。细胞死亡敏感性的增加伴随着抗凋亡Bcl-2和Bcl-X水平的降低L（左）蛋白和促凋亡蛋白BAK的上调。此外，两者都是C9或72MNs和CNs的SQST-1/p62水平升高，并形成聚A结合蛋白（PABP）阳性应激颗粒。我们的结果表明，携带C9或72重复扩张并揭示了两者之间新的致病联系C9或72，加利福尼亚州2+调节失调、内质网应激和蛋白质平衡丧失。
米材料和米方法论
道德声明
本研究中使用的人类iPSC系来源于人类皮肤活检成纤维细胞，经签署知情同意书，并获得东南威尔士研究伦理委员会（REC参考号12/WA/0186）和英国伯克郡中南部研究伦理委员会（REC 10/H0505/71）的批准。
iPSC系的产生和培养
在本研究中，我们使用了来自四个健康对照的六个iPSC衍生系：NHDF-1；氧3‐9；OX1克隆19和61；AH017（克隆3和13）和来自3C9或72患者：C9‐T2（克隆6和7）；C9‐7245（克隆1和克隆3）；C9‐02（克隆2和克隆10）。所有iPSC系均来源于牛津大学詹姆斯·马丁干细胞设施的皮肤活检成纤维细胞，采用标准化方案，以尽量减少因实验室差异和/或处理引起的任何潜在变化。使用MycoAlert检测成纤维细胞支原体阴性（英国伦萨，网址：www.lonza.com/)而衍生的iPSC线也使用相同的测试进行了阴性测试。控制iPSC线iPS‐NHDF‐1[44岁女性]20和iPS‐OX1‐19[36M]21由山中逆转录病毒衍生而来，之前已经发表过。C9-T2-6、C9-T2-7[62M]、7245-1、7245-3[48F]和控制线iPS‐OX3-9[49M]和iPS AH017-13[67F]（之前发布22)使用SeVdp（KOSM）302L仙台病毒系统衍生23,24它包含所有四个重编程转录因子（Klf4、Oct4、Sox2、c‐Myc）的基因，这些转录因子由单个转录物表达，包装成单个仙台病毒，确保基因剂量比的一致性。仙台病毒是一种保留在细胞质中的负链RNA病毒。因此，将遗传物质插入基因组的可能性可以忽略不计。此版本的系统还包含mir302的目标；mir302在多能性细胞中表达，但在原始成纤维细胞中不表达，因此，一旦细胞重新编程为多能性，病毒RNA就会被检测到并降解，从而确保在几代内完全去除外源遗传物质。AH017‐13[67F]、OX1‐61[36M]、C902‐02、C902-10[62F]是使用商用仙台病毒重组系统Cytune衍生而来的，该系统包含重组基因Klf4、Oct4、Sox2、c‐Myc，封装成单个病毒（马里兰州Rockville，Life Technologies，http://www.lifetech.com网站，根据制造商的说明使用）。
将转导的成纤维细胞转移到有丝分裂失活的小鼠胚胎饲养细胞（MEFs）上；MEFs来源于牛津病理学系建立和维护的瑞士长白小鼠25,26或从纽约白宫站默克公司购买的MEF，网址：http://www.merck.com（来源于CF1小鼠）于第2天在0.1%明胶涂层板上培养，并在由敲除的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）组成的iPS培养基中培养（Invitrogen，Carlsbad，CA，http://www.invitrogen.com网站)，10%敲除血清置换（Invitrogen），2 mM谷氨酰胺-I（Gibco，Grand Island，NY，http://www.invitrogen.com网站)、100 U/mL青霉素（Invitrogen）、100µg/mL链霉素（Invirogen）、1%非必需氨基酸（Invitro）、0.5 mMβ-巯基乙醇（Invitogen），10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（研发部，明尼阿波利斯，http://www.rndsystems.com). 每天更换培养基（50%），并从第10天起用MEF条件培养基替换。在第21-28天采集显示iPSC形态的菌落，每5-7天通过手工解剖转移到MEF上。在mTeSR1中的Matrigel涂层板（BD-Matrigel hESC合格矩阵）上对iPSC线进行调整，以适应无馈线条件（100%每日介质变化，StemCell Technologies，加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华，网址：http://www.stemcell.com). 通过0.5 mM EDTA进行批量和常规传代27制作大规模、质量可控、低温保存的主库存（p10到20之间）。最初的主种群进行了所有描述的QC测试，随后的所有子种群进行了单核苷酸多态性（SNP）分析，以进行追踪和基因组完整性。将无饲养层传代的数量保持在最低水平，以确保分化实验在狭窄的传代数量窗口内进行。如果特定应用需要单细胞解离，则在培养基中补充岩石抑制剂Y27632（10µM；加州圣地亚哥Calbiochem，http://www.emdbiosciences.com)在通过的那天。
仙台清除试验
通过聚合酶链反应（PCR）确认仙台病毒从重组细胞系中清除。使用RNeasy试剂盒提取RNA，网址：http://www1.qiagen.com)来自iPSC，来自成纤维细胞（阴性对照），以及来自5天前感染仙台重编程病毒的成纤维细胞。使用RetroScript试剂盒（Ambion，Austin，TX，http://www.ambion.com网站)，使用20µL反应体积中的2µg模板RNA。在25µL PCR反应中使用2µL 1:10稀释的cDNA产物。对于用SeVdp（KOSM）302L重新编程的株系，在Applied Biosystems StepOne Plus Real-Time PCR机器上使用StepOne软件，使用Applied biosystems2×SYBR绿色PCR混合物+ROX和60摄氏度退火进行定量反转录酶PCR（qRT-PCR）。将靶基因转录水平与肌动蛋白β对照（肌动蛋白？引物，Eurogentec）和阳性对照进行比较28仙台特异性引物为5′-AGACCTAAGAGAGAGACAGACAGA‐3′和5′-ACTCCATGGCGTAACTCCATAAG‐3’。对于使用Cytotune Sendai重编程系统重编程的株系，根据制造商的说明进行PCR，四种重编程病毒中的每一种都有一对引物，主干也有一对，使用肌动蛋白β作为每个株系的阳性对照（肌动蛋白？引物，Eurogentec），通过在1.5%的琼脂糖凝胶上运行溴化乙锭，以及2对数阶梯或100 bp阶梯（新英格兰生物实验室），对产品进行可视化。引物对为：SeV F:GGA TCA CTA GGT GAT ATC GAG C；R： ACC AGA CAA GAG TTT AAG AGA TAT GTA TC；SOX2 F:ATG CAC CGC TAC GAC GTG AGC GC；R： AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA；KLF4 F:TTC CTG CAT GCC AGA GGA GCC C；R： AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA；c‐MYC F:TAA CTG ACT AGG CTT GTC G；R： TCC ACA TAC AGT CCT GGA TGA TGA TG；OCT4F:CCC GAA AGA AGC GAA CCA G；R： AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA。
流式细胞术
通过流式细胞术评估iPSC系的多能性标记的表达。细胞用TrypLE（生命科技）提起，用4%多聚甲醛（PFA）在磷酸盐缓冲盐（PBS）中固定10分钟，然后在−20°C的甲醇中渗透。0.5–1 × 106然后在由PBS、人IgG（10µg/mL Sigma）、胎牛血清（FCS）（1%Hyclone、Logan、UT、，http://www.hyclone.com网站)和叠氮化钠（0.01%），与抗体或同型匹配对照品（使用相同的荧光团，来自同一制造商，每百万个细胞中有1µg抗体）混合30分钟。主要染色后，将细胞清洗三次，并使用FACS Calibur（Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ，网址：http://www.bd.com)-使用FlowJo软件收集并分析了10000个细胞的数据，绘制了前向散射面散射（FSC‐SSC）点图并绘制为直方图(年轴规格化为模式）。使用了以下抗体（克隆、同型对照、供应商）：TRA‐1‐60（B119983，IgM‐488，Biolegend）、NANOG（D73G4，IgG‐647，Cell Signaling Technology，Beverly，MA，http://www.cellsignal.com网站).
iPSC与MN的区别
使用三种不同的先前发布的协议将MN与iPSC区分开来，并进行了一些修改29,30在其中一种分化方案中，分化过程是由胚状体的神经诱导启动的，随后是神经祖细胞阶段和神经成熟。在神经诱导培养基中培养4天后，将EB镀到Geltrex涂层板上，并通过向神经分化培养基中添加浓度为0.1μM的维甲酸（RA）来实现神经祖细胞的尾化。10天后，在浓度为100 ng/mL的腹侧化生长因子声波刺猬存在下，分离出显示神经玫瑰花结结构的菌落，并将其以神经球的形式悬浮扩展。在这一步中，通过添加Rock抑制剂Y27632、，它可以防止细胞脱落，是干细胞培养中广泛使用的补充物31,32将细胞作为神经球培养2周后，将其置于盖瑞涂布的盖玻片上，通过添加脑源性神经营养因子（BDNF 10 ng/mL）、胶质源性神经生长因子（GDNF，10 ng/mL）、胰岛素样生长因子（IGF‐1，10 ng/mL）、环腺苷酸（cAMP）、，抗坏血酸0.5μM，西格玛抗坏血酸钠。分化后的MN再培养3-4周，然后进行功能检测。
使用第二种区分方案30，iPSCs作为单层培养，通过添加化合物c（1μM）Tocris Bioscience（英国布里斯托尔）开始神经诱导，网址：https://www.tocris.com/在DMEM/F12和神经基底培养基中，补充N2、B27、肝素0.2%。3天后，向培养基中添加RA（1µM），再过3天后，添加平滑的阿古斯丁（SAG）和普吗啡胺（1μM），并去除化合物c。培养9天后，以低密度替换神经前体进行分化，并在培养基中添加生长因子BDNF、GDNF和IGF-1（10 ng/mL）、抗坏血酸和cAMP。20天后，移植MN进行实验，并在功能实验前再成熟3-4周。
使用第三种分化方案对MN进行分化33，进行了大量修改。在补充N2、B27、抗坏血酸（0.5μM）、2-巯基乙醇（1×）、化合物C（3μM）的DMEM/F12/Neurobasic中诱导iPSCs单层。和Chir99021（3µM）持续4天。在培养4天后，将RA（1µM）和SAG（500 nM）加入培养基中。第二天，从培养基中取出Chir99021和化合物C，然后再培养4-5天。然后将神经前体解离并以低密度铺板7天。培养基中添加了生长因子BDNF（10 ng/mL）、GDNF（10ng/mL）、N‐[N‐（3,5‐二氟苯乙酰基）‐L‐丙氨酸]‐S‐苯甘氨酸t‐丁酯（DAPT）（10µM）和层粘连蛋白（0.5µg/mL）。7天后，从培养基中去除DAPT和层粘连蛋白，并让神经元在功能实验前再成熟2-4周。
iPSC与CN的区别
根据先前制定的方案将iPSCs分化为CNs34简单地说，iPSCs在Matrigel上作为单层生长，通过将培养基改为基本神经培养基DMEM/F12:神经基础1:1，1×N2，1 x B27，胰岛素5µg/mL（Sigma），非必需氨基酸100µM（Life Technologies），2-巯基乙醇100µM，抗生素-抗真菌（Life Technologies）诱导神经分化并补充500 ng/mL诺金（PeproTech，Rocky Hill，NJ，http://www.peprotech.com网站)和10µM SB431542（酶生命科学）。每24小时更换一次培养基，直到观察到神经玫瑰花结（12-16天）。使用Dispase（Life Technologies）提升神经上皮层，并在培养基中添加20 ng/mL成纤维细胞生长因子2（FGF2）（PeproTech），持续4-6天。使用Accutase（生命技术）在低密度下分离神经前体。然后向培养基中添加10 ng/mL BDNF和10 ng/mL GDNF，同时提取FGF2。在进行功能分析之前，允许神经元延长过程并成熟60-70天。
免疫印迹
用PBS清洗细胞，然后在PBS中刮除。细胞在RIPA缓冲液（0.5%脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠、1%诺奈特P40和1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma））中溶解，超声处理，并在冰上孵育30分钟。5000离心后克将上清液保留10分钟，并根据制造商的说明（Sigma）使用BCA分析定量蛋白质浓度。蛋白质在95°C的Laemmli缓冲液中煮沸5分钟，并将10μg蛋白质加载到凝胶上。对于Western blot分析，使用Novex X‐Cell电泳系统（Life Technologies）在恒定电流（125 mA持续1小时）下在SDS‐PAGE（10%或12%三甘氨酸凝胶）上解析裂解产物，并转移到甲醇活化的聚偏二氟乙烯膜（Immobilon‐P）上在恒定电压下使用Novex Blot系统（100 mA持续90分钟）。将印迹在封闭缓冲液（PBS，1%吐温-20，5%脱脂乳）中在室温下封闭1小时，然后在PBS+1%吐温-20中孵育 + 含一级抗体的1%牛奶在4°C下过夜。使用的主要抗体是小鼠抗-Bcl-2（Dako，Glostrup，Denmark，网址：http://www.dako.com，1:200），小鼠抗-SQST1/p62（Abcam，1:1000），兔抗-GRP78/BiP（Abcam1:1000）和小鼠抗β-actin（Sigma，1:5000）。辣根过氧化物酶（HRP）偶联的抗小鼠IgG或抗兔IgG（BioRad，Hercules，CA，http://www.bio-rad.com)作为二级抗体，使用ECL或ECL Plus检测系统（Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ，http://www.amersham.com网站). 在ImageJ中测量每个带的积分光密度，并将表达归一化为相同印迹中的肌动蛋白水平，以进行比较表达评估。
对于斑点印迹分析，使用一条硝化纤维素膜，并将含有10µg蛋白质的10µL作为斑点加载。让斑点干燥，并在5%脱脂牛奶0.1%吐温/PBS中封闭1小时。去除封闭缓冲液，并将初级抗体添加到每个点（1:1000），并在室温下培养1小时。将膜清洗三次，持续10分钟，并在室温下添加HRP偶联的抗兔二级抗体1小时。在0.1%吐温/PBS中清洗膜三次，每次10分钟，信号由ECL（Amersham Pharmacia Biotech）检测。
碘化丙锭染色
根据制造商的说明（Sigma）进行碘化丙锭（PI）染色。简单地说，将神经元与1µg/mL PI储备液和RNase A在37°C下孵育10分钟。然后用PBS清洗溶液，并将细胞固定在4%PFA中。然后按照上述方法进行免疫细胞化学。
线粒体染色
分化MN的培养物与100 nM的电位染料MitoTracker Red CMXRos（Thermo Fisher）在37°C下培养45分钟。然后用PBS清洗神经元，将其固定在4%PFA中，并根据上述免疫细胞化学方案对Islet1和SMI‐32进行免疫染色。
ER钙成像
将10μM Fluo‐4 AM溶解于0.2%二甲基亚砜（Sigma‐Aldrich，St.Louis，网址：http://www.sigmaaldrich.com)在汉克平衡盐溶液（HBSS）中添加0.04%的Pluronic acid，并添加CaCl2和氯化镁2.为图像Ca2+信号，我们使用尼康TE 2000倒置显微镜和EMCCD相机（Evolve 128，Photometrics），使用宽场荧光显微镜以300秒的帧速率对荧光发射（510–600 nm）进行成像−1。在25°C下，从18 mm盖玻片内12×12µm（128×128像素）区域的荧光成像，在盖玻片上培养MN。ER钙2+在缺乏CaCl的HBSS中使用1µM thapsigargin（生命技术）后，通过荧光测量评估浓度水平2和氯化镁2荧光测量值表示为比率（ΔF类/F类
0)荧光平均变化（ΔF类)相对于刺激前该像素处静止荧光的像素处(F类
0). 使用MetaMorph和ImageJ软件进行图像分析。
RNA荧光原位杂交（FISH）
在24孔板中的12 mm无RNase盖玻片上生长的细胞使用4%PFA固定20分钟，在PBS中洗涤，并使用PBS中的0.2%Triton X-100（Sigma）透化30分钟。然后，细胞在一系列分级的醇中脱水，风干，并在PBS中再水化，在2×标准柠檬酸钠（SSC）中短暂洗涤，然后在预混合溶液和杂交溶液中培养，如前所述，使用Cy3共轭2′O（运行）甲基RNA探针（集成DNA技术）35探针序列为（CCCCGG）4或（CAGG）6。渗透后，在37°C下使用RNase（0.1 mg/mL；Life Technologies）或DNase（150 U/mL，Qiagen）进行1小时的可选治疗。杂交洗涤后，如上所述用Tuj1（1:2000，Covance）和Islet1（1:200，DSHB）进行染色。
电生理学
将含有iPSC衍生MN的盖玻片放在安装在直立显微镜台上的记录室中，并使用IR‐DIC光学对躯体进行记录。用含氧人工脑脊液aCSF（95%O2/5%一氧化碳2)含130 mM NaCl，25 mM NaHCO三，2.5 mM KCl，1.25 mM NaH2人事军官4，2 mM氯化钙2，2 mM氯化镁2和10 mM葡萄糖。膜片钳电极（4–7 MΩ）填充含有120 mM葡萄糖酸钾、10 mM KCl、10 mM-HEPES、4 mM MgATP、0.3 mM NaGTP和10 mM磷酸钠的细胞内溶液。使用Multicamp 700B放大器获得记录，并使用Digidata 1550采集板以10-20 kHz的频率进行数字化。
南方印迹法
用2µL FastDigest DdeI和FastDidget AluI（Thermo Scientific）分别在37°C下消化5µg DNA 2小时。消化后的DNA在0.8%琼脂糖凝胶中的×1三乙酸-EDTA（TAE）中进行电泳，并转移到带正电荷的尼龙膜上（瑞士巴塞尔罗氏，http://www.roche-applied-science.com)通过毛细管印迹法。罗氏地高辛（DIG）标记的DNA分子量标记II用作阶梯。DNA通过紫外线辐射交联到膜上。在53°C的20 mL DIG Easy Hyb溶液（罗氏）中进行预杂交2小时。10 ng DIG标签（GGGCC）5探针（由Integrated DNA Technologies定制合成）在95°C下培养5分钟，在冰上快速冷却30秒，然后立即添加到预热到60°C的7 mL DIG Easy Hyb溶液中。杂交在53°C的温度下过夜。在64°C下进行严格清洗，如下所示：2×SSC，0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）5分钟，2×SSS，0.1%SDS 10分钟，1×SSC、0.1%SDS15分钟，三次，0.5×SSC和0.1%SDS15分钟，两次。
使用DIG洗涤和封闭缓冲装置（罗氏）制备膜以进行检测。用洗涤缓冲液清洗膜2分钟，然后用封闭溶液培养1-2小时。将抗-DIG-AP Fab片段（Roche）与膜在室温下以10000分之一的稀释度在封闭溶液中培养20–25分钟。在5、15和15分钟内进行三次清洗，然后使用提供的检测缓冲液进行5分钟的平衡步骤。将CDP‐Star（Roche）添加到膜中至少5分钟，并通过暴露于x射线胶片检测信号。通过插值对数图估计重复次数10碱基对中的条带大小与印迹上传播的距离的关系，从估计的碱基对数中减去199 bp，以解释Beck等人执行的野生型等位基因。36.
qRT‐PCR
根据制造商的说明，使用Qiagen RNeasy试剂盒从iPSC衍生的MN中分离出RNA。使用SuperScript III逆转录酶（Life Technologies）将500µg总RNA用于逆转录反应。使用100µg反向转录到cDNA和SYBR Green qPCR Supermix（Roche）的RNA进行定量实时PCR。用于qPCR的引物如下表所示.
表1
| 低聚物 | 顺序 |
|---|
| BAK_fwd（包_前进） | 5′-ggggtctatgttccccaggat‐3′ |
| BAK_版本 | 5′-gcgggtagagttgagca‐3′ |
| Bcl‐XL_fwd公司 | 5′-ATGAACTCTTCCGGGATGG‐3′ |
| Bcl‐XL_版本 | 5′‐TGGACTCAAGGCTCTAGGTG‐3′ |
| BIM_fwd公司 | 5′‐GGTCCACAGTGTGTATTCTCTT‐3′ |
| BIM_版本 | 5′‐ACTGAGATGTTGAAGGCCTGG-3′ |
| HPRT转发 | 5′‐GCTATAATTCTTGCTGACCTGCTG‐3′ |
| HPRT版本 | 5′‐AATTACTTTATGTCCCTGTTGACTGG‐3′ |
重复引物PCR
重复引物PCR（RP‐PCR）检测如前所述1反应体积为15μL，包含100 ng基因组DNA、8μL Extensor mastermix（Thermo Scientific）、6μL 5 M甜菜碱、20μM正向和重复特异性引物以及2μM反向引物。将反应进行触地PCR程序，然后将每个PCR产物的1μL与8μL甲酰胺和0.5μL GeneScan大小标准品（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统，http://www.appliedbiosystems.com). 然后在ABI3730 DNA分析仪上分析样本，并使用GeneMapper软件进行可视化。使用的引物序列：RP1‐F FAM‐TGTAAAACGACGGCCAGTCAAGGAAACACCAGCC；RP1‐R CAGGAAACAGCTATGACC；RP1‐重复：CAGGAAACAGCTATGACGCCCCCCGACGCCCCGGCCCCCGCCCCGCGGCCCCGG。
电子显微镜
在聚酯过滤器上生长的细胞在室温下用2.5%戊二醛在0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）中浸泡固定10分钟，并用标准方法制备用于电子显微镜（EM）。简单地说，用四氧化锇（0.1M磷酸盐缓冲液中的1%v/v）和乙酸铀酰（蒸馏水中的2%w/v）对过滤器进行染色，通过增加乙醇（70%–100%）和丙酮的浓度进行脱水，并将其嵌入Spurr树脂中（英国雷丁琼脂科学公司）。使用Reichart‐Jung超切切片机制备超薄切片（50–80 nm），并安装在镍网格上（英国埃塞克斯斯坦斯特德Agar Scientific）。切片用柠檬酸铅和醋酸铀酰复染，并在JOEL 1010透射电子显微镜上进行检查（JOEL USA，Peabody，MA）。
统计分析
使用GraphPad Prism分析所有定量数据。对三组或三组以上样本进行单向方差分析，并与Bonferroni或Dunnett进行事后比较。所有ANOVA和事后测试的Alpha设置为0.05。
R（右）结果
对患者成纤维细胞进行重新编程以生成iPSC
从三名患者（C9‐T2、C9‐的7245、C902）中各生成两条线，以及来自对照供体的线。图显示了为本研究生成的其中一个患者iPSC株系iPSC C9‐T2‐7的代表性特征数据（之前未发布的其他iPSC株的数据，包括对照株，如支持信息图S1所示）。SNP分析证实了iPSC与其亲代成纤维细胞的相关性，并且他们没有获得大范围的拷贝数变化，尽管发现了少量小范围的indels（远低于G带检测到的水平），特别是在C9‐7245品系中（图。A；支持信息图S1A）。这些线路的SNP数据集已保存在GEO中，编号为{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE64582”，“term_id”：“64582“}}GSE64582标准iPSC系的多能性标记阳性（TRA‐1‐60和Nanog，图。B类；也支持信息图S1B），并显示了人类多能干细胞样形态（细胞-细胞接触依赖性簇，具有高核质比，图。C类；支持信息图S1C）。PluriTest是一种基于iPSC转录组数据的多能性定量评估，与来自多种细胞和组织类型的基因组全基因组图谱的大型参考集进行比较。它测量“多能性得分”（多能性基因的表达，高得分与高多能性相关，年轴）和“新颖性”评分（非多能性干细胞基因的表达，因此该评分与多能性呈负相关，x个轴）。通过该分析，所有患者iPSC细胞系均被视为完全重新编程且具有多潜能（图。D） ●●●●。Illumina HT12v4转录组阵列结果已以登录号保存在GEO中{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE64583”，“term_id”：“64583“}}第64583页最后，通过qRT‐PCR（图。E；支持信息图S1D）。
iPSC线特征。iPS C9 T2 7系列的特性数据。（A）：显示iPSC基因组完整性的Karyogram（使用Karyostudio分析的Illumina SNP阵列数据）。常染色体检测到的偏离参考数据的区域用绿色（扩增）或橙色带（删除）标注；左侧面板显示亲代成纤维细胞作为参考。（B）：iPSC多能性标记Tra‐1‐60和Nanog的FACS分析（黑线）；灰色填充图，同型控制。（C）：通过相位显微镜观察，人iPSC显示多能干细胞样形态（细胞-细胞接触依赖簇，具有高核质比）；比例尺 = 100微米。（D）：对Illumina HT12v4转录组阵列数据的PluriTest分析表明，所有iPSC系都使用多能干细胞（红云）聚集，而不是部分或分化细胞（蓝云）。每个圆圈代表一条iPSC线，之前发布的线OX1‐19和NHDF‐1包含在参考点中[1 = AH017‐13；2 = OX3-9；三 = OX1‐61；4 = C902‐10；5 = AH017‐3；6 = OX1‐19；7 = NHDF‐1；8 = 7245‐1; 9 = 7245‐3; 10 = T2-7；11 = C902‐02；12 = T2‐6]；年轴多能性评分，x个轴新奇度得分。（E）：通过qRT‐PCR相对于阳性对照评估用SeVdp（KOSM）302L重新编程的iPSC株对仙台的清除率。缩写：iPSC，诱导多能干细胞；定量聚合酶链反应
C9或72iPSC区别于功能性MN
体外细胞分化协议概述了胚胎发生期间发生的信号事件。iPSC向脊髓MN的分化是一个涉及神经化、尾状化和腹侧化的三阶段过程。根据三个先前发布的协议，iPSC线被区分为MN，但进行了一些修改29,30,33（支持信息图S2A–S2C）。
通过使用MN标记物HB9和神经元标记物β‐III微管蛋白（Tuj1）进行免疫染色来鉴定完全分化的MN，这表明iPSCs成功分化为MN（支持信息图S2D）。iPSC衍生的MN表现出突触素的表达，突触素是形成突触所必需的突触囊泡蛋白，以及胆碱乙酰转移酶的表达，表明胆碱能神经元成熟程度较高（支持信息图S2D，S2E）。
从每个患者的成纤维细胞中重新编程两个iPSC系，并将其分化为MN以进行表征。为了评估分化效率，在对照系AH017‐13、OX3‐9、OX1‐19和C9或72患者线路C9‐T2‐6、C9‐的T2‐的7、C97245‐1、C9‑72453、C902‐2和C90210（图。A） ●●●●。神经培养8周后评估分化效率，所有细胞系中Tuj1阳性细胞平均数为82%，表明神经化程度较高（图。B） ●●●●。这些培养物中大约一半的Tuj1阳性神经细胞也对有丝分裂后的MN标记Islet1阳性（占总细胞的42.7%–46.4%）（图。C） ●●●●。CNs并行分化，在培养70–100天后进行功能实验34（支持信息图S2E）。通过Southern印迹在成熟MNs中确定扩增的大小，估计C9‐T2‐6为510–690个重复，C9‐T2‐7为420–640个重复，C9‐7245‐1为1210个重复，C9‐7245‐3为1380个重复，C902为1000个重复（支持信息图S3A）。通过RP‐PCR也证实了C9‐02‐2和C9‐）7245‐3 MNs中存在重复序列，并证实了对照系OX1‐19和AH017‐13中没有重复序列（支持信息图S3B）。
的功能特性C9或72诱导多能干细胞（iPSC）衍生的MN。（A）：对照品系（OX1‐19、OX3‐9、AH017）和六个患者品系（C9‐T2‐6、C9‐）中Islet1和Tuj1的免疫染色。（B）：Tuj1阳性细胞的量化显示80%–95%的细胞是神经元和（C）Islet1阳性细胞的定量显示23%-40%的细胞是运动神经元，基因型之间无显著差异（*，第页 > .05，单向方差分析）。（D）：全细胞记录显示，在控制MN和（E）
C9或72MN。代表性电压钳数据显示了控制OX3-9阶跃膜去极化期间记录的内向和外向电流（F）和C9‐7245‐3（G）神经元。（H）：用Fluo‐4 AM孵育后，从神经元中记录到自发的钙振荡，用（一）KCl和（H）红藻氨酸（控制神经元如图所示）。n个 = 3个独立的差异；米=每行记录10-15个神经元；每行5个神经元用于离子电流测量。数据表示为平均值 ± SEM.比例尺 = 20微米。缩写：DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；MN，运动神经元。
为了评估iPSC衍生MN的功能成熟度，我们进行了全细胞膜片钳记录，以确定其电生理特性。在电流钳记录中，对去极化电流注入作出反应，在对照组和患者MN中诱发动作电位序列（图。D、，E） ●●●●。通过电压钳记录对照组和患者的内向和外向离子电流（图。F、，G） ●●●●。钙2+使用钙敏感染料Fluo‐4 AM研究动力学。在没有外部刺激的情况下，在神经元的细胞体和过程中可以检测到自发的钙瞬变（图。H） ●●●●。然后用红藻氨酸（KA）刺激神经元，激活离子性受体，用KCl去极化膜并激活电压门控钙2+通道。暴露于KCl诱导的Ca2+Islet1+MN中的瞬态（图。一） ●●●●。同样，暴露于KA诱导的细胞内Ca特征增加2+80%细胞中的水平（图。J） ●●●●。
RNA Foci和RAN二肽存在于C9或72MN公司
在从C9或72患者中，我们发现所有细胞系中含有核内GGGCC重复序列的RNA病灶显著增加（图。A、，B） ●●●●。通过RNase治疗证实了探针的特异性，RNase显著减少了病灶数量（支持信息图S4A），DNase I治疗后保持了病灶数量。为了研究RAN翻译假说的证据，我们使用抗-GA、GP、GR和PR抗体进行了斑点杂交分析，并且我们可以检测到来自C9或72患者（图。C） ●●●●。
RNA焦点和重复相关的非ATG二肽在C9或72患者源性运动神经元（MN）。（A）：【CCCCGG】4探针用于检测来自C9或72六核苷酸扩增。（B）：高达65%的神经元中检测到RNA焦点C9或72诱导多能干细胞（iPSC）衍生的MN（计121–157个神经元），而对照组未检测到病灶（**，第页 < .01，单向方差分析）。（C）：对照组（OX3‐9和AH017）和患者品系（C902‐2、C9‐7245‐3和C9023）在基线检查时和用MG‐132治疗24小时后GR、PR、GA和GP二肽的点杂交分析。比例尺 = 5微米。数据表示为平均值 ± SEM。缩写：DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。
ER Ca升高2+细胞水平、线粒体形态改变和Bcl-2水平降低C9或72MN公司
虽然钙信号与C9或72扩张尚未报道，钙调节异常是ALS发病机制的既定特征。钙的水平2+对每个细胞系（OX3‐9、C9‐T2‐6、C9‐T2‐7、C9‐7245‐1和C9‐7245‐3）的三种独立分化的八种不同培养物的完全分化MN中ER中的储存进行分析。评估ER Ca的总含量2+在MNs中加入10μM thapsigargin（TG），ER-Ca导致荧光强度峰值增加2+测量细胞质中的损耗（图。A、，B） ●●●●。TG作为ER膜上SERCA泵的有效抑制剂，阻止钙的再摄取2+细胞质中的离子。在我们的培养物中，我们检测到ER-Ca水平显著升高2+中的内容C9或72iPSC衍生的MNs，与对照MNs相比，其细胞质荧光强度增加了两倍(第页 < .05，单向方差分析）（图。C） ●●●●。
ER Ca增加2+在中检测到内容C9或72诱导多能干细胞（iPSC）衍生的MN以及线粒体改变和Bcl-2蛋白失衡。（A）：TG刺激前后iPSC衍生神经元的图像（B）它们的代表性荧光痕迹。（C）：TG诱发ER-Ca的测量2+释放表明ER Ca显著升高2+与OX3-9（***，第页 < .001; *,第页 < .05; 采用Dunnet事后检验的单向方差分析）；n个 = 3个独立的差异，米 = 每个基因型记录150-200个神经元。（D）：免疫印迹显示所有患者的GRP78/BiP水平均升高，C9‐7245‐1和C8‐7245-3（*，第页 < .05，采用Dunnet事后检验的单向方差分析）（E）.n个 = 3个独立的差异，米 = 每个基因型每个分化记录142-200个神经元。（F）：抗凋亡Bcl‐2蛋白的免疫印迹显示患者细胞系和（G）与对照组OX3-9、AH017-13和OX1-61（*，第页 < .05; **,第页 < .01，采用Dunnett事后检验的单向方差分析）；n个 = 3个独立的区别(n个 = AH017‐13和OX1‐61的2个独立区分），米 = 3-4次技术复制。（H）：定量聚合酶链反应证实Bcl-X的下调L（左）和上调（一）BAK，特别是在C9‐7245和C902‐2 MN线路中（*，第页 < .05; **,第页 < .01；***，第页 < .001，采用Dunnett事后检验的单向方差分析）；n个 = 2个独立的微分；米 = 3份技术副本。（J）：装载有MitoTracker Red CMXRos并用Islet1和Tuj1进行免疫染色的OX3-9的代表性图像。（K）：胰岛MitoTracker平均荧光强度的量化1+/Tuj1号机组+所有患者的神经细胞都显示线粒体膜电位降低（***，第页 < .001，采用Dunnett事后检验的单向方差分析）；n个 = 2个独立的微分；米 = 每个基因型分析17-31个神经元。（左）：电子显微镜（EM）显示，与健康对照组（OX3-9）相比，患者细胞系C902‐2和C9‐7245‐3中的线粒体和线粒体增大。箭头指向线粒体。（百万）：线粒体改变的EM图像定量显示88%C9或72线粒体肿胀的神经元（**，第页 < .01，使用Dunnet的事后检验进行方差分析）。（N）：细胞色素c（c）C9‐7245‐1（*，第页 < .05，使用Dunnett的事后检验进行单因素方差分析）。n个 = 2个独立的差异，米 = 各2份技术副本。（O）：CNs显示凋亡标记细胞色素水平升高c（c）在C902‐10（*，第页 < .05; **,第页 < .01，单因素方差分析与Dunnett的事后检验）。n个 = 2个独立的差异。比例尺 = 20微米（J），1微米（L）。数据表示为平均值 ± 缩写：CNs，皮层神经元；内质网；MNs，运动神经元；TG、thapsigargin。
ER Ca异常升高2+水平可引起内质网应激，并可激活UPR。我们研究了与UPR和ER应激反应相关的蛋白质水平，发现与AH017-13和OX1-61 MN相比，C9-7245-1和C9-7245‐3 iPSC衍生MN中GRP78/BiP的水平显著升高(第页 < .05，单向方差分析）（图。D、，E） ●●●●。我们没有发现患者和对照组之间XBP‐1剪接的差异（支持信息图S5A）。
Bcl-2蛋白家族是调节内质网钙稳态的关键成分，控制钙的释放2+通过IP的离子三R和通过其自身二聚化形成的通道19Bcl-2家族促凋亡和抗凋亡成员之间的平衡对于控制内质网应激诱导的凋亡和线粒体膜通透性至关重要17.英寸C9或72MNs，我们检测到Bcl-2家族促凋亡和抗凋亡成员之间的不平衡，这表明C9‐7245‐1、C‐7245-3和C902‐2患者系中抗凋亡Bcl-2的下调达50%（图。F、，G） Bcl-X减少75%L（左）(第页 < .05，单向方差分析）（图。H） ●●●●。在扩张较大的MN中检测到促凋亡BAK的显著上调，其表达增加了2.5倍(第页 < .05，单向方差分析）（图。一） ●●●●。在一些MN系中也检测到促凋亡BIM的显著上调（支持信息图S5B）。
Bcl-2蛋白家族分布在内质网和线粒体膜上，在调节细胞内Ca2+钙的稳态和交换2+在两个细胞器之间。这些蛋白质和钙的功能障碍2+过载时，线粒体发生典型的形态学变化，如外膜肿胀和扰动，伴随着凋亡因子的释放37为了评估这些变化，我们使用了电位染料MitoTracker Red CMXRos，其积累取决于线粒体电位（图。J） 。我们发现与对照组相比，C9 MNs线粒体膜电位降低了30%(第页 < .01，单向方差分析）（图。K） 。
与这些发现相一致，EM对线粒体形态变化的分析也显示C9或72患者与健康对照组比较（图。五十） ●●●●。高达88%的人观察到线粒体形态改变和嵴结构异常C9或72相比之下，只有2%的正常健康神经元（图。M） ●●●●。
这些线粒体改变与细胞色素等凋亡因子的释放相一致c（c），与健康对照组相比，在所有患者系中，特别是在C9‐7245‐1中，发现其升高(第页 < .05，单向方差分析）（图。N、，O） ●●●●。这些结果表明C9或72扩张和ER Ca升高2+浓度和应激以及线粒体的改变可能是下游细胞凋亡的驱动因素。
C9或72iPSC衍生的MN和CN对细胞凋亡的敏感性增加
研究携带致病性己核苷酸扩增的MNs和CNs是否存在于C9或72在正常培养条件下形成凋亡表型，我们评估了细胞应激和细胞死亡的标记物。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶在细胞中以非活性原酶的形式存在，可通过蛋白水解裂解激活，半胱氨酸蛋白酶-3的裂解是启动细胞凋亡分解的一个基本过程。在神经元中C9或72我们发现，与来自OX1‐19、OX3‐9和AH017‐13的CN相比，患者裂解caspase‐3的免疫染色显著增加（图。A） ●●●●。我们检测到8.1%到10.5%的神经元在神经元中呈裂解caspase‐3阳性C9或72与OX1‐19和OX3‐9的最大值2.9%和1.9%相比(第页 < .05，单向方差分析）（图。B） ●●●●。与此结果一致，ALS/FTD衍生的MNs也显示PI染色显著增加，高达32%C9或72MN与健康MN相比，表明与对照MN相比生存率降低(第页 < .01，单向方差分析）（图。C） ●●●●。
裂解半胱天冬酶-3在C9或72MN和皮层神经元（CN）以及细胞活力降低C9或72MN和CN。（A、B）：裂解caspase‐3的免疫染色显示C9或72MN与对照MN的比较（*，第页 < .05; **,第页<.01，用Dunnett的事后检验进行单因素方差分析）；n个 = 3个独立的差异；米 = 每个实验分析每个基因型400个细胞。（C）：检测到细胞活力降低C9或72PI染色的MNs（***，第页 < .001，使用Dunnett的单向方差分析事后（post-hoc）测试）n个 = 2个独立的差异。（D、E）：与两个健康对照品系（OX3-9和AH017-13）（*，第页 < .05; ***,第页 < .001，采用Dunnett事后检验的单向方差分析）。（F）：通过PI染色在C9或72病人(***第页 < .001，采用Dunnett事后检验的单向方差分析）。n个 = 3个独立的差异。数据以平均值表示 ± SEM.比例尺 = 20微米。缩写：MNs，运动神经元；PI，碘化丙啶。
在CN培养物中，我们发现C902‐2和C90210细胞系中caspase‐3裂解的频率明显较高，与对照组相比，凋亡标记阳性的神经元高达35%(第页 < .05，单向方差分析）（图。D、，E） ●●●●。这些结果还与高PI染色相关，高PI染色在C902患者系中分析的多达40%的神经元中发现(第页 < .001，学生t吨测试）（图。F） ●●●●。综上所述，这些结果表明C9或72六核苷酸扩增激活患者MN和CN中caspase‐3依赖性凋亡。
应激颗粒和蛋白质聚集体存在于C9或72iPSC衍生的MN和CN
SQST1/p62是UPR和自噬通量的标记物，发现于来自C9或72ALS/FTD病例。我们发现每种来源的MN中SQST1/p62水平显著升高C9或72与基线时的对照组MN相比，重复次数最多的患者SQST1/p62的表达高出两倍(第页 < .05，单向方差分析）（图。A–C） ●●●●。在MN的自噬标记LC3‐II/LC3‐I中未检测到差异（支持信息图S5C、S5D）。在携带C9或72我们还发现大约40%的神经元对p62聚集体呈阳性反应（图。D–F） ●●●●。与MN相反，这些结果与对照组OX3-9和AH017-13相比，C902-2和C902-10中LC3-II水平的增加相关(第页 < .05，单向方差分析）（图。G） ●●●●。
p62在中升高C9或72神经元和PABP免疫阳性应激颗粒在C9或72神经元。（A）：C9运动神经元（MN）p62的免疫染色显示，聚集物是在基线条件下形成的。（B，C）：免疫印迹显示，与基线条件下的对照组相比，C9‐T2‐6、C9‐7245‐3和C902‐2 MNs中的p62水平较高（*，第页 < .05; **,第页 < .01，采用Dunnet事后检验的单向方差分析）；n个 = 2个独立的差异，米 = 3份技术副本。（D、E）：与对照组（***，第页 < .001，使用Dunnett的事后检验进行单因素方差分析）。（F、G）：免疫印迹法显示C9或72患者C902与对照组（***，第页 < .001，采用Dunnett事后检验的单向方差分析）；（H）PABP公司+和TIA‐1+在基线条件下，在所有五个C9患者行中检测到应激颗粒（一）PABP公司+MN的发病率明显高于对照组（*，第页 < .05; ***,第页 < .01，采用Dunnet事后检验的单向方差分析）；n个 = 3个独立的差异；米 = 每个基因型分析387–918个神经元。（J、K）：PABP+C9 CNs（***，第页 < .001，使用Dunnett的事后检验进行单因素方差分析）。比例尺 = 20微米；（H）底部面板中的比例尺 = 10微米。数据表示为平均值 ± 缩写：CNs，皮层神经元；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；PABP，聚A结合蛋白。
当RNA结合蛋白通过富含甘氨酸的结构域聚集时，就会形成应激颗粒。这些颗粒起到隔离、沉默或降解特定RNA转录物的作用，作为适应局部RNA翻译模式以促进对细胞应激反应的机制的一部分38PABP是应激颗粒的主要成分，是应激反应激活的有力标志。在我们的神经元培养中，我们发现在静息条件下，所有五种神经元中PABP阳性颗粒的神经元频率都增加了五倍C9或72患者MN线与对照组比较(第页 < .05，单向方差分析）（图。H、，一） ●●●●。这个C9或72MNs对早期应激颗粒标志物TIA-1也呈免疫阳性（图。H） ●●●●。PABP阳性应激颗粒检出率高达40%C9或72CN与最多20%的控制CN相比（图。J、，K） 。
D类震荡
无法直接研究神经退行性疾病患者的神经元，严重阻碍了对基本机制的理解，尤其是疾病早期发生的机制。干细胞技术的最新发展极大地扩展了ALS中可用的细胞模型的范围，允许直接观察来自iPSC的MN的病理机制，iPSC来源于具有疾病易感性遗传背景的成纤维细胞。
潜在机制C9或72MN的毒性尚待阐明，但可能包括单倍体不足和功能毒性增加，由RNA焦点或RAN翻译产生的毒性聚集倾向多肽介导1,10,39,40。这些潜在机制并非相互排斥，可能各自发挥作用。在这项研究中，我们确定了MN和CN中改变的几种聚合途径C9或72患者。
在具有六核苷酸重复序列的患者的CN中始终检测到RNA焦点1,14我们在所有的MN培养物中检测到离散的RNA焦点C9或72患者线路。由于RNA焦点的存在和数量与其他表型无关，因此RNA焦点与我们在此细胞模型中观察到的病理学的关系需要进一步研究。使用高水平蛋白质进行的斑点杂交分析显示，患者体内存在GA、GP、GR和PR二肽，但由于其丰度低且难以检测，因此在我们的细胞模型中分析其对神经元变性的贡献具有挑战性。最近的一项研究表明，转染poly-GA、poly-GP和poly-PA的神经元细胞中会形成应激颗粒，这表明RAN翻译可能与应激颗粒的形成和神经退行性变有关41.在我们的文化中C9或72MN和CN，我们检测到在基线条件下经常出现应激颗粒。应激颗粒是非翻译信使核糖核蛋白复合物的保守细胞质聚集体，是一种动态结构，当条件恢复正常或被自噬清除时就会分解42PABP的积累+应激颗粒表明自噬和蛋白酶体降解受损，这两条功能异常途径的融合可能部分解释了C9或72MN和CN退化。
众所周知，钙在ER线粒体串扰中发挥着复杂的调节作用，在细胞死亡信号中起着重要作用43.Bcl-2和Bcl-XL（左）位于ER膜上，降低[Ca2+]急诊室通过形成钙2+渗透性渗漏孔44降低Bcl-2和Bcl-X水平L（左）有助于钙的非生理积累2+由于泄漏减少，离子进入内质网，我们证实内质网钙水平升高2+中的商店C9或72MN。我们最近发现，小鼠MN和人类细胞模型中的TDP‐43致病性突变也会干扰ER-Ca2+，但效果相反，显示ER Ca降低2+ER-Ca水平降低2+释放45.
ER Ca之间的紧密连接2+储存物和线粒体使细胞能够迅速有效地对各种钙作出反应2+刺激。然而，在病理条件下，高水平的钙2+内质网会使线粒体超负荷，从而导致线粒体肿胀、外膜破裂和线粒体释放凋亡因子37抗凋亡蛋白Bcl-2位于线粒体膜上，在线粒体膜上阻止促凋亡BAK/BAX寡聚并形成允许释放凋亡因子细胞色素的通道c（c）进入细胞溶质。低水平的Bcl-2和增加的BAK促进细胞色素的释放c（c）线粒体触发caspases的激活，调控细胞凋亡的诱导和执行46与此相一致，我们检测到高水平的裂解caspase‐3和细胞色素c（c）在患者衍生的MN和CN中，表明C9神经元正在经历caspase依赖性凋亡。
ER Ca的破坏2+体内平衡也通过干扰钙的功能在内质网应激的诱导中发挥直接作用2+敏感ER伴侣47内质网应力的本构激活C9或72有趣的是，MNs在具有更多六核苷酸重复序列的细胞中更大，可能有助于诱导内质网应激相关的凋亡。这与之前的研究一致C9或72患者iPSC衍生的MN发现参与UPR激活和ER应激的转录物上调48虽然所有携带重复序列的MNs都显示出生存缺陷和活跃的凋亡途径，但只有具有较大六核苷酸扩增的患者衍生MNs在基线条件下表现出内质网应激。这些结果表明，内质网应激被大量致病性重复激活，但不是诱导神经元死亡的唯一途径。根据我们的观察，使用SOD1的类似研究+/A4V型iPSC衍生的MNs发现患者MNs的内质网应激升高，但用柳氮芥碱或敲除XBP‐1治疗并不能缓解生存缺陷，这表明内质网紧张只是导致MNs死亡的众多因素之一48选择性神经元脆弱性可能涉及相互加强的压力源和最终汇聚于神经元死亡的改变路径的特定组合49因此，在易患肌萎缩侧索硬化症患者中，随着年龄的增长，压力逐渐增加，这可能是肌萎缩侧索硬化症神经退行性变进展的基础。总之，我们的研究结果突出了ER Ca的重要性2+在不同体内和体外模型中的调节，支持ALS中MN变性由细胞内钙的细胞类型特异性损伤介导的假设2+搬运50,51,52.
来自的MN和CNC9或72患者还表现出高水平的SQST1/p62，这是一种适配器分子，用于选择性地降解泛素化靶点，其积累反映了自噬机制去除蛋白质聚集物的效率低下53.SQST1/p62是神经退行性疾病中常见的蛋白质聚集体成分，如帕金森病中的路易体、阿尔茨海默病中的神经纤维缠结和亨廷顿蛋白聚集体54,55,56先前有报道称，在患有六核苷酸扩增的FTD患者的iPSCs衍生的CN中，p62水平升高C9或72是尸检分析中的病理标志C9或72承运人5,7在基础状态下，我们检测到MN的高SQST1/p62水平，而LC3‐II/LC3‐I转换没有变化，这表明自噬流量减少C9或72MNs与健康对照组相比。有趣的是，SQST1/p62水平升高与ALS/FTD患者CN中LC3‐II增加相关，这表明这些细胞中可能存在明显的自噬体蓄积和自噬过程的损伤，这是CN特有的，在MNs中并不重复。
C结论
我们的研究确定了与C9或72MN和CN以及可能导致其在病理条件下脆弱性的分子变化。我们已经确定了一种在C9或72神经元，包括内质网钙调节异常和应激，随后是线粒体改变，线粒体释放凋亡因子，以及应激颗粒的形成。目前尚不清楚这种表型链是从何处开始的，有毒RAN二肽的存在是否会导致内质网应激和钙调节异常，或者RNA焦点的存在是否导致必需钙的补充2+监管机构记录。目前正在进行进一步的工作来分析连接六核苷酸重复序列的分子机制C9或72和神经元表型。在本研究中，大量重复扩增（>1000）与我们的患者MN培养中更严重的表型相关，但需要更广泛的研究来确定重复次数与细胞表型严重程度之间是否存在相关性。虽然我们的观察结果表明，所观察到的细胞表型足够强大，可以用作筛选潜在治疗方法的工具，但还需要进一步的工作来建立在激活的病理途径之间的确切的机械关系C9或72MNs、CNs和神经变性。
A类作者C贡献
R.D.：构思和设计、数据收集和汇编、数据分析和解释、手稿撰写和手稿最终批准；J.S.和M.N.：分化，RNA荧光原位杂交；N.A.：干细胞重新编程和iPS扩展和表征；T.L.和G.W.：电生理实验；H.C.：电子显微镜数据收集和解释；J.V.：干细胞重编程和iPS扩增；A.G.L.D.：Southern印迹；A.F.‐J.公司：部分生存数据收集；C.B.：干细胞重新编程；M.N.：提供重新编程因子；M.R.T.：提供患者；相对湿度：ER-Ca监督2+研究；S.A.C.：收集和汇编数据并最终批准手稿；K.T.：构思和设计、资金生成、提供研究患者、撰写稿件、编辑和最终批准稿件。
D类披露P（P）潜在的C关于…的冲突我利息
作者表示没有潜在的利益冲突。
致谢
我们感谢Adrian Isaacs和Sarah Mizielinska博士对RNA FISH技术的支持和建议；亚历克斯·克拉克博士对钙成像实验的建议；惠康信托人类遗传学中心高通量基因组学小组（由惠康信托基金资助，参考号090532/Z/09/Z），用于生成基因分型和转录组数据。这项工作是由Lights Up Asia基金会的慈善捐款促成的。R.D.由MND协会资助（107/516）。N.A.获得约旦政府的奖学金支持。J.S.由医学研究委员会/运动神经元疾病协会伊迪丝·沃尔夫森女士临床研究训练研究基金（MR/LOO2167/1）资助。A.G.L.D.由威康信托临床博士奖学金（AVRVTB0）资助。M.R.T.由医学研究委员会/运动神经元疾病协会伊迪丝·沃尔夫森女士高级临床研究基金（MR/K01014X/1）资助。牛津马丁学院（LC0910‐004）和威康信托基金会（WTISSF121302）为威廉·邓恩爵士病理学院内的詹姆斯·马丁干细胞设施提供核心支持。控制样本由牛津帕金森病中心（OPDC）研究提供，该研究由英国帕金森基金会纪念碑信托发现奖（Monument Trust Discovery Award）资助，该基金会是一家在英格兰和威尔士（2581970）以及苏格兰（SC037554）注册的慈善机构，得到了国家卫生研究所（NIHR）的支持牛津大学生物医学研究中心设在牛津大学医院NHS信托基金会和牛津大学，以及NIHR综合地方研究网络。
工具书类
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