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神经元。作者手稿；PMC 2016年12月2日提供。
以最终编辑形式发布为：
神经元。2015年12月2日；88(5): 892–901.
数字对象标识：2016年10月10日/j.neuron.2015.1027
预防性维修识别码：项目经理4672384
美国国立卫生研究院：美国国家卫生研究院732312
PMID：26637796

C9或72BAC转基因小鼠表现出典型的ALS/FTD病理特征

杰奎琳·奥洛克，1 劳伦特·博格达尼克，三 A.K.M.G.穆罕默德，1 塔尼亚·F·根德隆，4 凯文·J·金，1 安德鲁·奥斯汀，三 珍妮特·卡迪，5 伊莱恩·刘，6 乔纳·扎罗，1 莎迪·格兰特，1 Ritchie Ho公司，1 肖恩·贝尔，1 莎朗·卡莫纳，1 梅根·辛普金森，1 迪普蒂·拉尔，1 Kathryn Wu（凯瑟琳·吴），1 莉莲·多赫蒂（Lillian Daughrity），4 丹尼斯·W·迪克森，4 马修·B·哈姆斯，5 伦纳德·彼得鲁切利，4 爱德华·B·李，6 凯瑟琳·卢茨，三和罗伯特·H·巴洛1,2,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

六核苷酸重复序列（GGGCC）的非编码扩增C9或72基因是家族性肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆最常见的病因。在这里，我们报道了携带细菌人工染色体（BAC）的转基因小鼠，其中含有完整的人类C9或72具有正常等位基因（15个重复）或疾病相关扩增（约100-1000个重复；C9-BACexp）的基因。C9-BACexp小鼠表现出以下病理特征：C9或72扩张患者，包括广泛的RNA病灶和重复相关非ATG（RAN）翻译的二肽，这些二肽被靶向人类的反义寡核苷酸抑制C9或72Nucleolin分布发生改变，支持C9或72转录物或RAN二肽促进核仁功能障碍。尽管在C9-BACex小鼠中早期广泛产生RNA焦点和RAN二肽，但即使在高龄时也未观察到行为异常和神经变性，这支持了这样一个假设，即RNA焦点和TRAN二肽是在症状前发生的，并且不足以在患者的水平上驱动小鼠的神经变性。

介绍

肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶变性（FTLD）是临床表现、遗传学和病理学重叠的疾病(Chen-Plotkin等人，2010年). ALS是一种运动神经元疾病，它会因上下运动神经元丧失而导致肌肉萎缩和痉挛，而FTLD患者通常会因额叶和颞叶皮层退化而出现行为和语言障碍。GGGGCC六核苷酸重复序列在第一内含子/启动子中的扩增C9或72基因是家族性和散发性ALS和FTLD最常见的遗传原因(DeJesus-Hernandez等人，2011年；Renton等人，2011年). 最近，C9或72其他疾病也有重复扩张的报道，包括阿尔茨海默病、帕金森病、皮质基底综合征、路易体痴呆和亨廷顿样综合征(Cooper-Knock等人，2014年).

目前尚不确定的是C9或72主要通过功能增加、功能丧失或两者兼而有之导致神经退化。重复序列在正反义方向上转录，导致患者组织中含有重复序列的RNA聚集(Gendron等人，2013年). 这些RNA焦点可能结合RNA结合蛋白并改变RNA代谢(Donnelly等人，2013年；Lee等人，2013年；Sareen等人，2013年)，并且含有重复序列的流产转录物也会破坏核仁功能(Haeusler等人，2014年). 此外，简单的二肽重复可以通过具有多种毒性作用的正、反义链的重复相关非ATG依赖性（“RAN”）翻译产生(Ash等人，2013年；Mori等人，2013年). 虽然很明显，高水平的外源性DPR蛋白（GA或GR/PR）可能会对细胞产生毒性，但在人体组织和脑脊液中存在的较低水平的DPR蛋白是否会对细胞造成毒性尚不清楚(Su等人，2014年).

在这里，我们生成了表达C9或72从细菌人工染色体（BAC）中分离出的正常遗传控制元件中的六核苷酸重复序列C9或72扩张患者。我们观察到重复序列的有义和反义转录与RNA病灶的发展，以及DPR蛋白水平的产生，与在C9或72FTLD患者的组织，但没有发生神经变性。这些数据表明，RNA焦点和RAN翻译在患者的症状前发生，并且不足以在没有其他应激源或过度表达的情况下驱动神经退化。

结果

的生成C9或72BAC转基因小鼠

我们通过southern blot从一名C9-ALS患者的皮肤成纤维细胞中生成了一个BAC文库，该文库具有约800个重复序列(Sareen等人，2013年). BAC克隆239为~174 kb，包含完整的C9或72基因扩张(图1A). Southern blot证实GGGCC在BAC中存在扩增，但在细菌中也高度不稳定(图S1A). 为了产生重复序列长度正常（2-30）的对照小鼠，我们注射了一个来源于BAC 239的亚克隆，该亚克隆在细菌中稳定收缩为15个重复序列，产生F08-CTR系(图S1A，图1B). 为了产生疾病范围内扩张的小鼠（C9-BACexp），我们注射了一个主要重复大小为~800的亚克隆(图S1A). 由此产生的创始人展示了C9或72southern杂交的基因组重复大小从~100到1000不等(图1B). 幼崽之间的环带模式保持稳定(图S1B)和F112系在四代中几乎没有变化，表明多重重复大小代表作为单个转基因阵列插入基因组的BAC(图S1C). 在单个小鼠的组织或大脑区域中，没有发现重复大小的重大变化，这表明重复显示出相对较小的躯体不稳定性(图S1C). 定量RT-PCR和western blot证实C9或72转录物和蛋白质被表达(图1C、D)C9orf72蛋白水平适度增加（约2倍）。为了进一步分析，我们选择了两个C9-BACexp株系（F112和F113），因为它们显示了一系列扩展大小，都在疾病范围内（~100到1000），并且转录和蛋白表达水平与F08-CTR株系相似。这个C9或72六核苷酸重复扩增发生在两个交替使用的上游外显子（1a和1b）之间，并且只在含有亚型的外显子1a中转录。因此，我们对脊髓组织进行了cDNA末端5'快速扩增（5'RACE），并证实人类BAC主要表达1a（含重复）转录物，类似于BAC 239来源于患者的iPSC衍生运动神经元(图1E). 鉴于重复扩增可以诱导甲基化和沉默C9或72在人类的转录中，我们进行了甲基化敏感限制酶-qPCR来检测转基因甲基化水平(图1F)并观察到C9-BAC转基因小鼠的甲基化水平很低。值得注意的是，在具有多个插入的系中，无法确定每个不同转基因的表达程度。

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的生成C9或72BAC转基因小鼠

（A） C9-BAC结构示意图。pCC1 BAC主干（8.128 kb）用于分离包含整个人类的区域C9或72C9-ALS患者的基因（约36 kb），包括上游约110 kb和下游约20 kb。>用收缩对照BAC（15个重复）或不同大小的扩增物生成了30个不同的C9-BAC创始株系。

（B） C9-BAC建立系中重复序列长度的Southern印迹分析。使用收缩的亚克隆产生具有15个GGGCCC重复序列的对照（F08-CTR）系。株系F08-CTR、F112和F113表现出可比较的表达，株系F112和F1 13的重复大小在~100-1000之间。

（C） 人类的相对表达C9或72qPCR检测C9-BAC转基因株系皮层中的mRNA。

（D） C9-BAC小鼠皮层表达的C9orf72蛋白（48kD）的Western blot分析（左）。抗-C9orf72（顶部）和抗肌动蛋白（底部）。Western blot定量（右）归一化为非转基因（NTg）对照。

（E） 5'RACE分析中外显子1a和1b的序列比对C9或72成绩单。左侧显示了iPSC衍生的运动神经元（来自BAC供体患者），以证明外显子1a和1b在人类细胞中的利用。

（F）C9或72启动子甲基化检测通过MSRE-qPCR进行评估。BAC供体患者的成纤维细胞（Fibro）、诱导多能干细胞（iPSC）和iPSC-derived motor neurons（MN）（约800个重复）显示出可变甲基化，从成纤维细胞的约10%到iPSC和MN的约50%。C9-BAC转基因株系的甲基化水平较低（约5%）。来自未扩张患者（CTR）的淋巴母细胞系（LCL）和C9或72显示扩展托架（C9+）以进行比较*所有数据均显示为平均值±SEM。另请参阅图S1.

C9-BACex转基因小鼠产生与人类相似的RNA焦点和DPR蛋白C9或72扩展载体

检查中所见的核心病理特征C9或72扩张患者，我们调查了C9-BACexp转基因小鼠的大脑区域，以寻找正、反义RNA病灶。我们观察到C9-BACexp株F112和F113在整个神经系统中都显示出正、反义RNA焦点(图2A). 相反，在携带15个重复序列的F08-CTR系中未观察到RNA焦点(图2A). 在大多数脑区，大约40-80%的细胞在3个月大时就出现了正、反义病灶，并且它们的分布或频率没有随时间变化(图2B).

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C9-BAC转基因小鼠产生与人类相似的RNA焦点和RAN肽C9或72扩展载体

（A） F08-CTR（红盒）和F112 C9-BAC小鼠正、反义RNA病灶的荧光原位杂交（FISH）。CER-GL：小脑颗粒层；CER-PC：小脑浦肯野细胞，海马DG：海马齿状回；FC：额叶皮层；PMC：初级运动皮层；SC-MN：脊髓运动神经元。比例尺=10μm。

（B） 非转基因（NTg）、F08-CTR和F112 C9-BACexp转基因小鼠跨脑区正反义病灶的定量。下图显示了3个月、6个月和8个月大时不同脑区有病灶的细胞的百分比。

（C） 20个月大的NTg或F112 C9-BAExp小鼠的poly（GP）免疫染色显示大脑区域包括皮层、海马齿状回（Hippo-DG）和小脑颗粒层中存在内含物。

（D） 可溶性聚（GP）存在于6个月大的C9-BACexp转基因小鼠（F112和F113）的皮层中，但不存在于NTg小鼠和F08-CTR小鼠中，如使用聚（GP）免疫测定所评估的。（F112、F113、NTG和F08-CTR的n=2）

（E） 不溶性聚（GP）水平低于C9-BACex转基因小鼠皮层中的可溶性聚（GP）水平（C），这是通过不溶性部分的免疫测定测定的。（F112、F113、NTG和F08-CTR的n=2）

（F） 不同脑区Poly（GP）水平的免疫分析。小脑的含量最高，而脊髓的含量最低。（n=3）

（G） C9-BAC小鼠品系和小鼠皮层中多聚（GP）水平的比较C9或72-FTLD阳性病例。品系F112和F113产生聚（GP）的水平与在两种不同的人类中检测到的水平相似C9或72+FTD额叶皮层样本（FTD#1和FTD#2）*所有数据均显示为平均值±SEM。另请参阅图S2.

免疫染色显示，多聚物（GP）包涵体在幼年小鼠（6个月）的大脑中很少见，但在老年小鼠（20个月）中更常见，表明它们随着年龄的增长而积累(图2C). 为了定量评估DPR的产生，我们使用免疫分析检测poly（GP），这是一种由重复序列的正链和反链产生的DPR蛋白，在C9-FTD大脑中大量表达。我们发现，早在6个月大时，C9-BACexp小鼠在可溶和不可溶组分中就显示出丰富的多聚（GP）DPR蛋白，这在非转基因小鼠或F08-CTR系中未检测到(图2D，E). 聚（GP）DPR蛋白在小脑组织中含量最高，在脊髓组织中含量最低，反映了DPR病理学在C9或72扩展载体(Davidson等人，2014年) (图2F). 当在同一免疫分析中并行运行时，C9-BACex小鼠和C9-FTLD患者的皮层组织显示出数量上相似的可溶性聚（GP）DPR蛋白水平(图2G). 这些数据表明，C9-BACexp小鼠产生了正、反义RNA焦点，DPR的广泛产生分布与人类相似C9或72扩展载体。

老鼠携带C9或72六核苷酸扩增没有显示神经系统变性或功能缺陷的证据

鉴于在C9-BACex小鼠中观察到广泛存在的RNA焦点和DPR蛋白水平，我们检查了F112系的神经系统功能缺陷。无论是年轻人（3个月）还是老年人（18个月），体重、握力、旋转木马或旷野测试分析均未发现异常(图3A-D). 鉴于FTLD的啮齿动物模型在社交能力和社交新颖性方面表现出选择性异常，我们进行了三室试验(Roberson，2012年)但在非转基因和F112 C9-BAC小鼠之间没有发现差异(图3E). 最后，我们进行了Y迷宫测试以评估记忆和求新行为，但我们再次观察到C9-BACexp和非转基因对照小鼠之间没有差异(图3F).

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C9-BAC转基因小鼠没有神经系统变性或功能缺陷的迹象

（A） 体重和（B）握力标准化为18个月大时的体重。对于这项和下面的所有行为研究，除非另有说明，否则使用雄性小鼠（NTg，n=8；F112，n=10）。

（C） 非转基因（NTg）和C9-BACexp小鼠（F112）队列的Rotarod试验。在幼年（3个月；NTg，n=8；F112，n=9）或老年（18个月；NT g，n=8；F111，n=10）动物中，没有观察到感觉运动协调或运动学习的差异。

（D） 18个月时的野外测试，比较NTg小鼠和C9-BACexp（F112）小鼠的总活动（左）和在中心（右）的时间。

（E） 在16个月时进行社交能力和社交新颖性的3室测试。与中性区相比，F112小鼠更喜欢与陌生人和新物体呆在一起，与NTg小鼠没有区别。

（F） C9-BACexp小鼠和NTg对照组在18个月时对记忆和求新能力的Y-Maze评估没有差异。

（G） 20个月时，NTg和C9-BACexp（F112）小鼠胫骨前肌的神经肌肉接头染色（bungarotoxin=红色，synaptophysin/神经丝=绿色）在占位、断裂或面积方面没有差异（n=6）。

（H） NTg、F08-CTR和C9-BACexp（F112）小鼠的股骨运动和感觉神经整形切片。

（一） 20个月大的C9-BAC（F112）和对照小鼠（NTg，F08-CTR）的股骨运动和感觉神经轴突计数（n=6）。另请参见图S2.

为了询问小鼠额叶皮层或运动系统损伤“亚临床”水平的证据，我们对其进行了组织学检查。与对照组相比，C9-BACex小鼠的神经肌肉接头神经支配或股轴突计数没有差异(图3G-I). 此外，我们对C9-BACexp小鼠的大脑和脊髓进行了免疫组织化学，但没有发现蛋白质聚集（p62、TDP-43、泛素）、胶质增生、炎症、突触或神经元损失（GFAP、IBA1、突触素和NeuN染色）的证据(图S2).

C9-BACexp小鼠有核仁应激的证据，但无下游后遗症

我们首先研究了正反义RNA焦点与RNA结合蛋白Purα、hnRNPA3、hnRNPA2/B1和hnRNP-H的共定位，之前有报道称这些蛋白与培养模型和患者组织中含有GGGCC重复序列的RNA焦点结合(Lee等人，2013年；Xu等人，2013年). 令人惊讶的是，在C9-BACexp转基因小鼠中，这些RNA结合蛋白没有表现出与正或反义RNA焦点的隔离，甚至一致的共定位(图S3). 除了改变RNA结合蛋白的功能外C9或72扩增被证明通过将流产转录物的G-四倍体结构与核仁蛋白结合来破坏核仁的完整性(Haeusler等人，2014年)或来自精氨酸二肽重复蛋白，该蛋白定位于核仁并破坏其功能(Kwon等人，2014年；Wen等人，2014). 有趣的是，我们观察到C9-BACex小鼠神经元显示核仁中的核仁蛋白分散，类似于在培养细胞和神经组织中观察到的情况C9或72扩张患者(图4A、B). 虽然核仁蛋白的部分错误定位支持一定程度的核仁应激，但我们没有观察到任何下游后遗症，如RAN GTPase剪接改变或核糖体RNA生物发生(图S3). 为了进一步探讨基因表达的变化，我们通过RNA-seq分析了6个月大的C9-BAC小鼠（F08-CTR、F112 C9-BACexp和非转基因小鼠）脊髓和皮层的转录体，在这个年龄段，RNA焦点和DPR水平都会高度升高。与非转基因小鼠相比，基因集富集分析（GSEA）确定C9-BACexp皮层下调基因中免疫调节和细胞外基质途径显著富集（FDR<0.05）(图S4). 与非转基因小鼠相比，F08-CTR系皮层中下调的基因中，这些通路并不丰富，这表明在携带己二核苷酸扩增的C9-BACexp小鼠中具有特殊作用。此外，在比较改变的路径与最近公布的数据集中使用人类C9或72患者皮层或iPSC衍生神经元(Donnelly等人，2013年)我们发现，与对照组相比，C9-BACex小鼠和人类iPSC衍生神经元中调节TH1和TH2细胞发育的树突状细胞途径下调(图S4). 总之，这些数据表明，C9-BACex小鼠中存在的RNA焦点、DPR蛋白和核仁应激改变了特定途径中的RNA表达，从而促进与人类iPSC衍生神经元共享的细胞功能障碍，但不足以驱动神经退化。

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C9-BACexp小鼠表现出核仁应激，反义寡核苷酸处理后RNA焦点和DPR蛋白减少

（A） 非转基因（NTg）和C9-BACexp（F112）小鼠小脑浦肯野细胞（CER-PC）、额叶皮层（FC）和初级运动皮层（PMC）中核仁蛋白（红色）与DAPI（蓝色）共染色的免疫荧光染色。C9-BACexp小鼠显示核仁素从核仁中部分移位。（比例尺=20μm）

（B） 核仁蛋白染色分布的定量显示，细胞核与核仁中染色量的比率发生了变化（n=4只动物；双侧t检验，NTg与F112；*p<0.05；**p<0.01）。

（C） 新生NTg和F113 C9-BACexp小鼠初级皮质培养物中感观病灶的RNA FISH。在73%（±9%）的神经元和星形胶质细胞中观察到RNA病灶。

（D） 培养皮层神经元的代表性钙记录（NTg，顶部和F112，底部）。

（E） 使用Fluo-4实时成像定量观察到的钙瞬变频率（n=27，NTg，n=68，F112）。

（F） 在指定剂量的谷氨酸处理24小时后，初级皮层神经元培养物中的谷氨酸毒性试验显示Tuj1染色。（比例尺=400μm）

（G） 神经元数量（TuJ1阳性）除以细胞总数（DAPI，未显示），然后将F113和NTg归一化为对照组（无治疗）。

（H） 用对照反义寡核苷酸（Scr ASO）或靶向人类第2外显子的ASO处理原代皮层培养物中感观病灶的RNA FISHC9或72抄本（C9 ASO）。

（一） C9 ASO治疗后RNA病灶减少的量化（**p=0.004，双侧t检验）。

（J） 免疫测定显示，与Scr ASO相比，用C9 ASO处理的C9 BACexp（F112系）小鼠的皮层培养物中poly（GP）DPR蛋白减少（**p=0.004，单向方差分析）。另请参见图S3.

反义寡核苷酸对C9-BACexp小鼠原代皮层培养物中RNA焦点和DPR蛋白的抑制作用

最后，为了在细胞水平上检测C9-BACexp小鼠的表型，我们从C9-BACexp小鼠中生成初级皮质培养物，并将其与非转基因对照组进行比较。FISH显示73%（SD±9%）培养的C9-BACex小鼠神经元和星形胶质细胞中存在RNA病灶(图4C)，高于人类iPSC衍生神经元中报告的20-35%C9或72病人(Donnelly等人，2013年；Sareen等人，2013年). 钙瞬变频率无差异(图4D，E)或对谷氨酸毒性的敏感性(图4F、G)在C9-BACex神经元培养的皮层神经元中观察到。然而，针对人类外显子2的反义寡核苷酸（ASO）C9或72在原代皮层培养物中能够显著抑制RNA焦点和聚（GP）DPR蛋白(图4H-J). 这些数据表明，C9-BACexp小鼠的皮层细胞再现了C9或72扩张病理学在体外，并证明其在研究旨在减少小鼠生理水平产生的RNA焦点和DPR病理学的治疗方法方面的实用性。

讨论

在这里，我们报告了C9-BACexp小鼠表现出患者的主要病理特征，包括正、反义RNA病灶，以及与FTLD患者大脑中所见水平相似的可溶性DPR蛋白。尽管如此，C9-BACexp小鼠在其生命周期内并没有发生可测量的神经退化。这与许多神经退行性疾病的动物模型是一致的，这些疾病通常只模拟人类病理生理学的某些方面，并且经常缺乏明显的神经退变(Rockenstein等人，2007年). 此外，许多小鼠模型需要转基因启动子驱动的高水平过度表达才能产生病理学，这就可能产生与所模拟的人类疾病无关的突发毒性。在准备这份手稿时，小鼠表达了高水平的合成物C9或72据报道，在使用腺相关病毒的鸡β-肌动蛋白启动子控制下的重复序列会产生RNA病灶、RAN肽并发展为神经退行性变(Chew等人，2015年). 重要的是，C9-BACexp小鼠显示出与人类疾病组织相似数量的正、反义RNA焦点和DPR肽，而不需要使用外源启动子获得高水平的过度表达。这表明还需要其他因素来驱动神经变性C9或72在小鼠中以正常生理水平重复。

研究支持了多种潜在的功能毒性增益C9或72己核苷酸扩增表达。其中包括RNA焦点隔离RNA结合蛋白产生的RNA毒性(Donnelly等人，2013年；Lee等人，2013年；Sareen等人，2013年); 聚（GA）DPR骨料的内质网应力或Unc119隔离(May等人，2014年；Zhang等人，2014); 以及来自包含RNA转录物的G-四倍体的核仁应激(Haeusler等人，2014年)或含有DPR蛋白的精氨酸（PR/GR）(Kwon等人，2014年；Mizielinska等人，2014年；Tao等人，2015年；Wen等人，2014). 虽然正反义RNA病灶在整个神经系统中广泛存在，但C9-BACexp小鼠出人意料地没有表现出与病灶相互作用的RNA-结合蛋白的结合或隔离。不同发表的报告中隔离的RNA-结合蛋白的变异性表明，迄今为止所报道的RNA--结合蛋白中没有一种可能在C9或72发病机制。相比之下，我们确实观察到核仁蛋白的定位发生改变，这表明存在轻微的核仁应激，但尽管如此，我们没有观察到任何下游后遗症，例如核糖体RNA生物发生改变或剪接事件改变。这种差异可能是由于急性过度表达培养模型中所见的严重毒性，或者是因为所报告的核仁蛋白定位改变的后遗症在由细胞凋亡引起的级联神经变性中发生的较晚C9或72扩展。

值得注意的是，仅在老龄小鼠的脑组织中观察到宏观的p62阳性DPR蛋白聚集体，而多聚（GP）免疫分析表明，年轻小鼠中的可溶性DPR蛋白水平，表明随着年龄变化的蛋白质稳态改变导致不溶性DPR聚集体的积累。无论如何，对于DPR宏观总量是否在C9或72重复发病，因为它们的分布与ALS和FTLD患者的临床表型几乎没有关系，病理程度最高的通常是小脑，相对较少的是脊髓(Davidson等人，2014年；曼恩，2014).

而C9-BACexp小鼠专注于建模功能获得表现C9或72扩展载体，部分损失C9或72表观遗传沉默导致的功能仍然是疾病发病的潜在因素。表达减少C9或72抄本已上报(DeJesus-Hernandez等人，2011年；Gijselinck等人，2012年)，因为含有重复的等位基因的表观遗传修饰可能是有害的或保护性的(Belzil等人，2013年；Russ等人，2015年；Xi等人，2013年). 据报道，C9orf72蛋白可调节培养细胞内体运输(Farg等人，2014年)，以及C9或72斑马鱼或蠕虫的同源性导致运动障碍(Ciura等人，2013年；Therrien等人，2013年). 虽然C9-BACexp小鼠无法解决C9或72扩张的发病机制涉及功能丧失的一个组成部分，他们认为RNA焦点和RAN二肽本身不足以驱动神经退行性变。这与人类的几个观察结果一致C9或72患者遗传学和病理学。首先C9或72扩张并没有完全渗透，在正常老年人和高达0.6%的欧洲或北美血统正常对照人群中都会出现(Galimberti等人，2014年；Harms等人，2013年). 这支持了这样一种假设，即神经退行性变需要额外的环境或遗传因素才能表现为C9或72膨胀突变。第二，DPR病理学的积累明显早于人类的神经退行性变，并且与人类的区域性神经退行症不对应，而与TDP-43病理学相关(Baborie等人，2014年；Proudfoot等人，2014年). 鉴于C9-BACex小鼠表现出RNA焦点和DPR蛋白的这些早期特征，而没有神经退化或TDP-43病理学，我们建议它们重现人类疾病的症状前阶段，这需要额外的侮辱（遗传、环境和/或衰老）充分表现并导致神经退化。这使得它们对于研究疾病发病机制的早期阶段以及确定促进神经退行性变的额外压力源极为有用C9或72扩展载体。最后，它们将成为研究改变RNA焦点和DPR病理学的治疗策略的宝贵工具，因为我们发现ASO针对人类C9或72转录物能够显著降低培养的皮层细胞中的RNA焦点负担和聚（GP）水平。

实验程序

所有研究均按照美国国立卫生研究院动物护理和使用指南中描述的方案进行，并经杰克逊实验室和西达斯-西奈机构动物护理和利用委员会批准。Jackson Laboratory提供小鼠，目录号如下：23099:C57BL/6J-Tg（C9orf72_3）112Lutzy/J；23100:C57BL/6J-Tg（C9orf72_3）113Lutzy/J；23088:C57BL/6J-Tg（C9orf72_2）8Lutzy/J。

补充材料

支持数据

单击此处查看。（130万，pdf）

致谢

我们要感谢Uthra Rajamani和Dhruv Sareen对ImageXpress的帮助，感谢David Rushton和Virginia Mattis对初级皮质培养的帮助，以及Vince Funari对RNA测序的帮助，并感谢Isis Pharmaceuticals的Frank Bennett和Frank Rigo提供反义寡核苷酸。这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）拨款NS055980和NS069669（R.H.B）、AG039510（E.B.L.）、AG000255（E.Y.L.），NS089979（T.F.G.）、NS084528（L.P.）、NS 063964（L.P.）的支持；NS077402（L.P.）；NS084974（L.P）、ES20395（L.P.）、国防部ALSRP AL130125以及Cedars-Sinai ALS研究基金（R.H.B.）。该项目得到了国家翻译科学促进中心（Grant UL1TR000124）的支持。

脚注

作者贡献：J.G.O.协调了该项目，参与了所有实验的性能和分析。L.B.通过Southern Blotting建立并筛选C9-BAC创始株系，进行协调行为测试，进行轴突和神经肌肉接头分析。T.G.检查RAN肽的表达。J.G.O.、L.B.、T.G.、A.K.M.G.M.筛选C9-BAC创始株系以进行重复扩增和表达。A.K.M.G.M.进行了RNA FISH和免疫组织化学实验。A.K.M.G.M.、SC、J.G.O.、L.B.和A.A.进行组织收集和分析。E.B.L.和E.L.进行甲基化分析。M.B.H.和J.C.进行了Southern blots和重复引物PCR。S.B.植入并处理组织进行分析。J.Z.计数RNA焦点。S.G.进行了RACE分析。K.J.K.和K.W.对C9-BAC控制线中的重复区域进行了测序。R.H.B.和R.H.分析了RNA序列数据。C.L.和R.H.B.对实验进行了规划、设计和解释。J.G.O和R.H.B.写了手稿。

工具书类

  • Ash PE、Bieniek KF、Gendron TF、Caulfield T、Lin WL、Dejesus-Hernandez M、van Blitterswijk MM、Jansen-West K、Paul JW、3rd、Rademakers R等。C9ORF72 GGGCC膨胀产生c9FTD/ALS特有的不溶多肽的非常规翻译。神经元。2013;77:639–646. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Baborie A、Griffiths TD、Jaros E、Perry R、McKeith IG、Burn DJ、Masuda-Suzukake M、Hasegawa M、Rollinson S、Pickering-Brown S等。与C9ORF72基因中的六核苷酸重复扩增相关的额颞叶退行性变中，二肽重复蛋白的积累早于TDP-43的积累。神经病理应用神经生物学。2014 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Belzil VV、Bauer PO、Prudencio M、Gendron TF、Stetler CT、Yan IK、Pregent L、Daughrity L、Baker MC、Rademakers R等。c9FTD/ALS中C9orf72基因表达降低是由组蛋白三甲基化（血液中可检测到的表观遗传事件）引起的。神经病理学学报。2013;126:895–905. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Chen-Plotkin AS、Lee VM、Trojanowski JQ。神经退行性疾病中的TAR DNA-结合蛋白43。Nat Rev Neurol公司。2010;6:211–220. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Chew J、Gendron TF、Prudencio M、Sasaguri H、Zhang YJ、Castanedes-Casey M、Lee CW、Jansen-West K、Kurti A、Murray ME等。神经变性。C9ORF72在小鼠中重复扩增会导致TDP-43病理学、神经元丢失和行为缺陷。科学。2015;348:1151–1154. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ciura S、Lattante S、Le Ber I、Latouche M、Tostivent H、Brice A、Kabashi E。C9orf72功能丧失会导致肌萎缩侧索硬化斑马鱼模型的运动障碍。Ann Neurol公司。2013[公共医学][谷歌学者]
  • Cooper-Knock J，Shaw PJ，Kirby J.C9ORF72相关疾病的广谱性；基因型/表型相关性和临床表型的潜在修饰。神经病理学学报。2014;127:333–345. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Davidson YS、Barker H、Robinson AC、Thompson JC、Harris J、Troakes C、Smith B、Al-Saraj S、Shaw C、Rollinson S等。与C9ORF72扩张相关的额颞叶变性和运动神经元疾病中二肽重复蛋白的脑分布。神经病理学通讯学报。2014;2:70. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • DeJesus-Hernandez M、Mackenzie IR、Boeve BF、Boxer AL、Baker M、Rutherford NJ、Nicholson AM、Finch NA、Flynn H、Adamson J等。C9ORF72非编码区的扩增GGGCC六核苷酸重复导致染色体9p-连锁FTD和ALS。神经元。2011;72:245–256. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Donnelly CJ、Zhang PW、Pham JT、Haeusler AR、Mistry NA、Vidensky S、Daley EL、Poth EM、Hoover B、Fines DM等。ALS/FTD C9ORF72扩增产生的RNA毒性通过反义干预得到缓解。神经元。2013;80:415–428. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Farg MA、Sundaramoorthy V、Sultana JM、Yang S、Atkinson RA、Levina V、Halloran MA、Gleeson PA、Blair IP、Soo KY等C9ORF72与肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆症有关，调节内体贩运。人类分子遗传学。2014;23：3579–3595。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Galimberti D、Arosio B、Fenoglio C、Serpente M、Cioffi SM、Bonsi R、Rossi P、Abbate C、Mari D、Scarpini E。C9ORF72六核苷酸重复扩增外显率不完全：老年非痴呆受试者队列中的频率。阿尔茨海默病杂志。2014;39:19–22.[公共医学][谷歌学者]
  • Gendron TF、Bieniek KF、Zhang YJ、Jansen-West K、Ash PE、Caulfield T、Daughrity L、Dunmore JH、Castanedes-Casey M、Chew J等。扩增C9ORF72六核苷酸重复序列的反义转录物形成核RNA焦点，并在c9FTD/ALS中进行重复相关的非ATG翻译。神经病理学学报。2013;126：829–844。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Gijselinck I、Van Langenhove T、Van der Zee J、Sleegers K、Philtjens S、Kleinberger G、Janssens J、Bettens K、Van Cauwenberghe C、Pereson S等。弗兰德斯-比利时额颞叶退行性变-肌营养性侧索硬化症患者队列中C9orf72启动子重复扩增：一项基因鉴定研究。柳叶刀神经病学。2012;11:54–65.[公共医学][谷歌学者]
  • Haeusler AR、Donnelly CJ、Periz G、Simko EA、Shaw PG、Kim MS、Maragakis NJ、Troncoso JC、Pandey A、Sattler R等。C9orf72核苷酸重复结构启动疾病的分子级联。自然。2014;507:195–200. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Harms MB、Cady J、Zaidman C、Cooper P、Bali T、Allred P、Cruchaga C、Baughn M、Libby RT、Pestrong A等。缺乏C9ORF72编码突变支持肌萎缩侧索硬化症重复扩张的功能增强。神经生物老化。2013;34：2234，e2213–2239。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kwon I，Xiang S，Kato M，Wu L，Theodoropoulos P，Wang T，Kim J，Yun J，Xie Y，McKnight SL。C9orf72重复序列编码的多肽结合核仁，阻碍RNA生物生成，杀死细胞。科学。2014;345：1139–1145。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lee YB、Chen HJ、Peres JN、Gomez-Deza J、Attig J、Stalekar M、Troakes C、Nishimura AL、Scotter EL、Vance C等。ALS/FTD中的六核苷酸重复形成长度依赖性RNA焦点、隔离RNA结合蛋白，具有神经毒性。单元格报告。2013;5:1178–1186. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Mann DM。与C9ORF72扩张相关的额颞叶退行性变和运动神经元疾病中的二肽重复蛋白毒性，值得注意。神经生物老化。2014[公共医学][谷歌学者]
  • May S、Hornburg D、Schludi MH、Arzberger T、Rentzsch K、Schwenk BM、Grasser FA、Mori K、Kremmer E、Banzhaf-Strathmann J等。C9orf72 FTLD/ALS-相关Gly-Ala二肽重复蛋白引起神经元毒性和Unc119隔离。神经病理学学报。2014;128:485–503. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Mizielinska S、Gronke S、Niccoli T、Ridler CE、Clayton EL、Devoy A、Moens T、Norona FE、Woollacott IO、Pietrzyk J等。C9orf72重复扩增通过富含精氨酸的蛋白质导致果蝇的神经退化。科学。2014;345:1192–1194. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Mori K、Weng SM、Arzberger T、May S、Rentzsch K、Kremmer E、Schmid B、Kretzschmar HA、Cruts M、Van Broeckhoven C等。C9orf72 GGGCC重复序列被翻译成FTLD/ALS中的聚集二肽依赖蛋白。科学。2013[公共医学][谷歌学者]
  • Proudfoot M，Gutowski NJ，Edbauer D，Hilton DA，Stephens M，Rankin J，Mackenzie IR。具有C9ORF72突变和智力残疾的额颞部痴呆家族的早期二肽重复病理学。神经病理学学报。2014;127:451–458.[公共医学][谷歌学者]
  • Renton AE、Majounie E、Waite A、Simon-Sanchez J、Rollinson S、Gibbs JR、Schymick JC、Laaksovirta H、van Swieten JC和Myllykangas L等。C9ORF72中的六核苷酸重复扩增是染色体9p21-连锁ALS-FTD的原因。神经元。2011;72:257–268. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Roberson ED。额颞叶痴呆小鼠模型。Ann Neurol公司。2012;72:837–849. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Rockenstein E，Crews L，Masliah E。神经退行性疾病转基因动物模型及其在治疗开发中的应用。先进的药物交付审查。2007;59：1093–1102。[公共医学][谷歌学者]
  • Russ J、Liu EY、Wu K、Neal D、Suh E、Irwin DJ、McMillan CT、Harms MB、Cairns NJ、Wood EM等。重复扩增C9orf72的超甲基化是一种临床和分子疾病修饰剂。神经病理学学报。2015;129:39–52. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Sareen D、O'Rourke JG、Meera P、Muhammad AK、Grant S、Simpkinson M、Bell S、Carmona S、Ornelas L、Sahabian A等。针对具有C9ORF72重复扩增的ALS患者iPSC衍生运动神经元中的RNA焦点。科学转化医学。2013;5：208ra149。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Su Z、Zhang Y、Gendron TF、Bauer PO、Chew J、Yang WY、Fostvedt E、Jansen-West K、Belzil VV、Desaro P等。c9FTD/ALS中生物标记物的发现和引导小分子靶向r（GGGCC）相关缺陷。神经元。2014;83:1043–1050. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Tao Z，Wang H，Xia Q，Li K，Li K，Jiang X，Xu G，Wang G，Ying Z。核仁应激和受损应激颗粒的形成有助于C9orf72 RAN翻译诱导的细胞毒性。人类分子遗传学。2015[公共医学][谷歌学者]
  • Therrien M、佐治亚州Rouleau、宾夕法尼亚州Dion、JA Parker。C9ORF72缺失导致秀丽线虫运动神经元变性和应激敏感性。《公共科学图书馆·综合》。2013;8：e83450。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wen X、Tan W、Westergard T、Krishnamurthy K、Markandaiah SS、Shi Y、Lin S、Shneider NA、Monaghan J、Pandey UB等。与C9ORF72-ALS/FTD连接的反义脯氨酸-精氨酸二肽形成有毒核聚集物，引发体外和体内神经死亡。神经元。2014;84:1213–1225. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Xi Z、Zinman L、Moreno D、Schymick J、Liang Y、Sato C、Zheng Y、Ghani M、Dib S、Keith J等。ALS中GC重复序列附近CpG岛超甲基化与C9orf72扩增。美国人类遗传学杂志。2013 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Xu Z，Poidevin M，Li X，Li Y，Shu L，Nelson DL，Li H，Hales CM，Gearing M，Wingo TS等。与肌萎缩性侧索硬化症和额颞叶痴呆相关的扩增GGGGCC重复RNA导致神经退行性变。美国国家科学院院刊。2013;110:7778–7783. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Zhang YJ，Jansen-West K，Xu YF，Gendron TF，Bieniek KF，Lin WL，Sasaguri H，Caulfield T，Hubbard J，Daughrity L，et al.聚合蛋白c9FTD/ALS聚（GA）RAN翻译蛋白通过诱导内质网应激引起神经毒性。神经病理学学报。2014;128:505–524. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]