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.1999年12月27日；147(7):1431-42.
doi:10.1083/jcb.147.7.1431。

RNA结合蛋白TIA-1和TIAR将eIF-2α的磷酸化与哺乳动物应激颗粒的组装联系起来

N L凯德莎 1, M古普塔, W李, 伊·米勒, P安德森
附属公司

RNA结合蛋白TIA-1和TIAR将eIF-2α的磷酸化与哺乳动物应激颗粒的组装联系起来

N L凯德莎等。 J细胞生物学. .

摘要

为了应对环境胁迫，相关的RNA结合蛋白TIA-1和TIAR与poly（A）（+）RNA在细胞质焦点共定位，类似于热休克植物细胞中含有未翻译mRNA的应激颗粒（SG）（Nover等人1989年；Nover等人1983年；Scharf等人1998年）。SGs处未翻译mRNA的积累在亚致死应激恢复的细胞中是可逆的，但在致死应激的细胞中则是不可逆的。我们发现TIA-1/R（+）SGs的组装是由eIF-2alpha的磷酸化启动的。拟磷酸eIF-2α突变体（S51D）诱导SG的组装，而非磷酸化eIF-2α突变体（S51A）阻止SG的组装。缺乏RNA-结合域的TIA-1突变体作为SG形成的转显性抑制剂发挥作用的能力表明，该RNA-连接蛋白作用于eIF-2alpha磷酸化的下游，促进未翻译mRNA在SG的隔离。SGs的组装和拆卸可以调节应激诱导的细胞从环境应激中恢复的翻译阻滞的持续时间。

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数字

图1
图1
TIA-1和TIAR在SG处聚合。DU 145细胞未经处理（A–C，同一场）或暴露于轻度热休克（44°C，20分钟，D–F，同一场内）。立即固定细胞，并使用TIAR特异性抗体6E3（A和D）和TIA-1特异性抗体ML29（B和E）进行双色免疫荧光处理，并分别拍照。TIA-1和TIAR在SG处共定位（箭头），相位控制显微镜（C和F）也可以看到。棒材，10μm。
图2
图2
重组TIA-1（而非hnRNP A1）在砷化物处理的COS转染物中的SGs处积聚。使用Superfect将编码重组TIA-1（A和D）或T7标记重组hnRNP A1（B、E、C和F）的质粒载体转染COS细胞。24小时后，在无亚砷酸盐（A–C）或有亚砷酸钠（D–F）的情况下培养细胞（0.5 mM，30分钟），然后使用与TIA-1（抗3E6）反应的单克隆抗体对重组蛋白进行可视化处理，重组TIA-1的表达水平大大超过内源性TIA-1/R，从而可以鉴定转染细胞；A和D）、T7（B和E）或内源性TIA-1/R（C和F，抗3E6）。显示成对字段（B和C以及E和F）。棒材，10μm。
图3
图3
向SG招募HSP27。DU145细胞未经处理（A和C）或暴露于热休克（45°C持续20分钟，B和D），并对TIA-1/R（A和B，抗3E6）和HSP27（C和D）进行染色。棒材，10μm。
图4
图4
TIA-1/R和poly（A）+RNA在SG处聚集。未处理（A和D）、亚砷酸盐处理并立即固定（0.5 mM，1 h，B和E），或亚砷酸钠处理为B和E，并允许在无砷培养基中恢复3 h（C和F）DU145进行原位免疫荧光检测聚（A）（A–C），并对TIA-1/R（D–F，抗3E6）进行复染。显示成对字段（A和D、B和F、C和F）。棒材，10μm。
图5
图5
致死应激诱导SG的不可逆组装。DU145细胞在无亚砷酸盐（F）或有亚砷酸钠（A–E）的情况下培养（2 mM，1 h），立即固定（A和D）或在无亚砷酸盐（B、C和E）的条件下恢复3 h，然后处理以显示聚（A）+RNA（A和B）、TIA-1/R（D和E）或DNA（C和F，Hoechst染料）。棒材，10μm。
图6
图6
PABP-I是SG的一个组件。对照组（A和C）或亚砷酸盐处理组（0.5 mM，40 min，B和D）DU145细胞被固定、渗透，并使用TIA-1/R（A和B，抗3E6）或PABP-I（C和D）抗体进行双色免疫荧光处理。TIA-1/R和PABP-I显然都是根据压力招募到SG的（B和D，同一领域的配对视图）。棒材，10μm。
图7
图7
野生型和突变型重组eIF-2α对TIA-1/R组装的影响+SG。（A） 将COS细胞与编码β-半乳糖苷酶的质粒以及单独载体、野生型eIF-2α、eIF-2β（S51D）或eIF-2γ（S51A）进行瞬时共转染，如图左侧所示。48小时后，在无亚砷酸盐（1 mM，1小时）的情况下培养细胞（对照组，左侧成对面板）或存在亚砷酸钠（右侧成对面板在固定和处理之前，使用β-半乳糖苷酶特异性单克隆抗体（绿色，抗β-半乳糖苷酶）或TIA-1（红色，TIA-1特异性抗体ML-29）进行双色免疫荧光显微镜检查。在每种情况下，相同区域的成对视图都会显示出来，以便识别转染细胞和未转染细胞。右下方面板中的箭头指出了转染细胞，在转染细胞中，eIF-2α（S51A）的表达阻止了亚砷酸盐诱导的SG组装。（B） 生成SG需要eIF-2α的磷酸化。按照描述对瞬时转染的COS细胞进行处理和染色，并对是否存在TIAR/1进行评分（每次处理至少100个转染细胞）+单克隆抗体3E6检测到的SGs，表示为每次治疗总细胞得分的百分比。对3个独立实验的结果进行平均。（C） 突变eIF-2α对β-半乳糖苷酶表达的影响。用所示质粒瞬时转染COS细胞，并用Western blot分析细胞总裂解物。上面板，β-半乳糖苷酶；下部面板，eIF-2α。
图7
图7
野生型和突变型重组eIF-2α对TIA-1/R组装的影响+SG。（A） 将COS细胞与编码β-半乳糖苷酶的质粒以及单独载体、野生型eIF-2α、eIF-2β（S51D）或eIF-2γ（S51A）进行瞬时共转染，如图左侧所示。48小时后，在无亚砷酸盐（1 mM，1小时）的情况下培养细胞（对照组，左侧成对面板）或存在亚砷酸钠（右侧成对面板在固定和处理之前，使用β-半乳糖苷酶特异性单克隆抗体（绿色，抗β-半乳糖苷酶）或TIA-1（红色，TIA-1特异性抗体ML-29）进行双色免疫荧光显微镜检查。在每种情况下，同一区域的成对视图都会显示出来，以便识别转染细胞和未转染细胞。右下方面板中的箭头指出了转染细胞，在转染细胞中，eIF-2α（S51A）的表达阻止了亚砷酸盐诱导的SG组装。（B） 生成SG需要eIF-2α的磷酸化。按照描述对瞬时转染的COS细胞进行处理和染色，并对是否存在TIAR/1进行评分（每次处理至少100个转染细胞）+单克隆抗体3E6检测到的SGs，表示为每次治疗总细胞得分的百分比。对3个独立实验的结果进行平均。（C） 突变eIF-2α对β-半乳糖苷酶表达的影响。用所示质粒瞬时转染COS细胞，并用Western blot分析细胞总裂解物。上面板，β-半乳糖苷酶；下部面板，eIF-2α。
图7
图7
野生型和突变型重组eIF-2α对TIA-1/R组装的影响+SG。（A） 将COS细胞与编码β-半乳糖苷酶的质粒以及单独载体、野生型eIF-2α、eIF-2β（S51D）或eIF-2γ（S51A）进行瞬时共转染，如图左侧所示。48小时后，在无亚砷酸盐（1 mM，1小时）的情况下培养细胞（对照组，左侧成对面板）或存在亚砷酸钠（右侧成对面板在固定和处理之前，使用β-半乳糖苷酶特异性单克隆抗体（绿色，抗β-半乳糖苷酶）或TIA-1（红色，TIA-1特异性抗体ML-29）进行双色免疫荧光显微镜检查。在每种情况下，同一区域的成对视图都会显示出来，以便识别转染细胞和未转染细胞。右下方面板中的箭头指出了转染细胞，在转染细胞中，eIF-2α（S51A）的表达阻止了亚砷酸盐诱导的SG组装。（B） 生成SG需要eIF-2α的磷酸化。按照描述对瞬时转染的COS细胞进行处理和染色，并对是否存在TIAR/1进行评分（每次处理至少100个转染细胞）+单克隆抗体3E6检测到的SGs，表示为每次治疗总细胞得分的百分比。对3个独立实验的结果进行平均。（C） 突变eIF-2α对β-半乳糖苷酶表达的影响。用所示质粒瞬时转染COS细胞，并用Western blot分析细胞总裂解物。上面板，β-半乳糖苷酶；下部面板，eIF-2α。
图8
图8
HA-TIA-1ΔRRM对亚砷酸盐诱导SGs组装的影响。将重组HA-TIA-1ΔRRM瞬时转染COS细胞，使其表达蛋白48 h，并在固定和poly（A）双重染色前，用0.5 mM亚砷酸钠处理1 h（A和C，同一视野的成对视图）或处理（B和D–F，同一领域的成对视野）+RNA通过原位杂交（C和D），以及HA-TIA-1ΔRRM（A，B，E）或内源性TIAR（F）通过免疫荧光显微镜，使用与HA标签（A、B和E）或内生TIAR（6E3）反应的单克隆抗体。箭头指向转染细胞。棒材，10μm。
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