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.2015年12月2日；88(5):892-901.
doi:10.1016/j.neuron.2015.10.27。

C9orf72 BAC转基因小鼠显示ALS/FTD的典型病理特征

杰奎琳·奥洛克 1, 劳伦特·博格达尼克 2, A K M G穆罕默德 1, 塔尼亚·F·根德隆 三, 凯文·J·金 1, 安德鲁·奥斯汀 2, 珍妮特·卡迪 4, 伊莱恩·Y·刘 5, 乔纳·扎罗 1, 莎迪·格兰特 1, Ritchie Ho公司 1, 肖恩·贝尔 1, 莎朗·卡莫纳 1, 梅根·辛普金森 1, 迪普蒂·拉尔 1, 凯瑟琳·吴 1, 莉莲·多赫蒂（Lillian Daughrity） 三, 丹尼斯·W·迪克森 三, 马修·B·哈姆斯 4, 伦纳德·彼得鲁切利 三, 爱德华·B·李 5, 凯瑟琳·卢茨 2, 罗伯特·H·巴洛 6
附属公司

C9orf72 BAC转基因小鼠显示ALS/FTD的典型病理特征

杰奎琳·奥洛克等人。 神经元. .

摘要

C9orf72基因中六核苷酸重复序列（GGGCC）的非编码扩增是家族性肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆的最常见原因。在这里，我们报告了携带细菌人工染色体（BAC）的转基因小鼠，该染色体包含完整的人类C9orf72基因，具有正常等位基因（15个重复）或疾病相关扩增（～100-1000个重复；C9-BACexp）。C9-BACexp小鼠表现出C9orf72扩张患者的病理特征，包括广泛的RNA病灶和重复相关的非ATG（RAN）翻译的二肽，这些二肽被靶向人类C9orf 72的反义寡核苷酸抑制。核仁蛋白分布改变，支持C9orf72转录物或RAN二肽促进核仁功能障碍。尽管在C9-BACex小鼠中早期广泛产生RNA焦点和RAN二肽，但即使在高龄时也未观察到行为异常和神经变性，这支持了这样一个假设，即RNA焦点和TRAN二肽是在症状前发生的，不足以在患者的水平上驱动小鼠的神经变性。

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数字

图1
图1。的生成C9或72BAC转基因小鼠
（A） C9-BAC结构示意图。pCC1 BAC主干（8.128 kb）用于分离包含整个人类的区域C9或72C9-ALS患者的基因（约36 kb），包括上游约110 kb和下游约20 kb。>用收缩对照BAC（15个重复）或不同大小的扩增物生成了30个不同的C9-BAC创始株系。（B） C9-BAC建立系中重复序列长度的Southern印迹分析。使用收缩的亚克隆产生具有15个GGGCCC重复序列的对照（F08-CTR）系。株系F08-CTR、F112和F113表现出可比较的表达，株系F112和F1 13的重复大小在~100-1000之间。（C） 人类的相对表达C9或72通过qPCR测量来自C9-BAC转基因系的皮层中的mRNA。（D） C9-BAC小鼠皮层表达的C9orf72蛋白（48kD）的Western blot分析（左）。抗-C9orf72（顶部）和抗肌动蛋白（底部）。Western印迹定量（右）标准化为非转基因（NTg）对照。（E） 5'RACE分析中外显子1a和1b的序列比对C9或72成绩单。左侧显示了iPSC衍生的运动神经元（来自BAC供体患者），以证明外显子1a和1b在人类细胞中的利用。（F）C9或72启动子甲基化检测通过MSRE-qPCR进行评估。BAC供体患者的成纤维细胞（Fibro）、诱导多能干细胞（iPSC）和iPSC-derived motor neurons（MN）（约800个重复）显示出可变甲基化，从成纤维细胞的约10%到iPSC和MN的约50%。C9-BAC转基因株系的甲基化水平较低（约5%）。来自未扩张患者（CTR）的淋巴母细胞系（LCL）和C9或72显示扩展托架（C9+）以进行比较*所有数据均显示为平均值±SEM。另请参见图S1。
图2
图2。C9-BAC转基因小鼠产生与人类相似的RNA焦点和RAN肽C9或72扩展载体
（A） F08-CTR（红盒）和F112 C9-BAC小鼠正、反义RNA病灶的荧光原位杂交（FISH）。CER-GL：小脑颗粒层；CER-PC：小脑浦肯野细胞，海马DG：海马齿状回；FC：额叶皮层；PMC：初级运动皮层；SC-MN：脊髓运动神经元。比例尺=10μm。（B） 非转基因（NTg）、F08-CTR和F112 C9-BACexp转基因小鼠跨脑区正反义病灶的定量。下图显示了3个月、6个月和8个月大时不同脑区有病灶的细胞的百分比。（C） 20个月大的NTg或F112 C9-BAExp小鼠的poly（GP）免疫染色显示大脑区域包括皮层、海马齿状回（Hippo-DG）和小脑颗粒层中存在内含物。（D） 可溶性聚（GP）存在于6个月大的C9-BACexp转基因小鼠（F112和F113）的皮层中，但不存在于NTg小鼠和F08-CTR小鼠中，如使用聚（GP）免疫测定所评估的。（F112、F113、NTG和F08-CTR的n=2）（E）不溶性多聚物（GP）水平低于C9-BACex转基因小鼠皮层中的可溶性多聚物水平（C），这是通过不溶性部分的免疫测定确定的。（F112、F113、NTG和F08-CTR的n=2）（F）不同脑区Poly（GP）水平的免疫测定。小脑的含量最高，而脊髓的含量最低。（n=3）（G）C9-BAC小鼠系和C9或72-FTLD阳性病例。品系F112和F113产生聚（GP）的水平与在两种不同的人类中检测到的水平相似C9或72+FTD额叶皮层样本（FTD#1和FTD#2）*所有数据显示为平均值±SEM。另见图S2。
图3
图3。C9-BAC转基因小鼠没有神经系统变性或功能缺陷的迹象
（A） 体重和（B）握力标准化为18个月大时的体重。对于本研究和以下所有行为研究，除非另有说明，否则使用雄性小鼠（NTg，n=8；F112，n=10）。（C） 非转基因（NTg）和C9-BACexp小鼠（F112）队列的Rotarod试验。在幼年（3个月；NTg，n=8；F112，n=9）或老年（18个月；NT g，n=8；F111，n=10）动物中，没有观察到感觉运动协调或运动学习的差异。（D） 18个月时的野外测试，比较NTg小鼠和C9-BACexp（F112）小鼠的总活动（左）和在中心（右）的时间。（E） 在16个月时进行社交能力和社交新颖性的3室测试。与中性区相比，F112小鼠更喜欢与陌生人和新物体呆在一起，与NTg小鼠没有区别。（F） C9-BACexp小鼠和NTg对照组在18个月时对记忆和求新能力的Y-Maze评估没有差异。（G） 20个月时，NTg和C9-BACexp（F112）小鼠胫骨前肌的神经肌肉接头染色（bungarotoxin=红色，synaptophysin/神经丝=绿色）在占位、断裂或面积方面没有差异（n=6）。（H） NTg、F08-CTR和C9-BACexp（F112）小鼠的股骨运动和感觉神经整形切片。（一） 20个月大的C9-BAC（F112）和对照小鼠（NTg，F08-CTR）的股骨运动和感觉神经轴突计数（n=6）。另请参见图S2。
图4
图4。C9-BACexp小鼠表现出核仁应激，反义寡核苷酸处理后RNA焦点和DPR蛋白减少
（A） 非转基因（NTg）和C9-BACexp（F112）小鼠小脑浦肯野细胞（CER-PC）、额叶皮层（FC）和初级运动皮层（PMC）中核仁蛋白（红色）与DAPI（蓝色）共染色的免疫荧光染色。C9-BACexp小鼠显示核仁素从核仁中部分移位。（比例尺=20μm）（B）核仁蛋白染色分布的定量显示，细胞核与核仁的染色量比率发生了变化（n=4只动物；双侧t检验，NTg与F112；*p<0.05；**p<0.01）。（C） 新生NTg和F113 C9-BACexp小鼠初级皮质培养物中感观病灶的RNA FISH。在73%（±9%）的神经元和星形胶质细胞中观察到RNA病灶。（D） 培养皮层神经元的代表性钙记录（NTg，顶部和F112，底部）。（E） 使用Fluo-4实时成像定量观察到的钙瞬变频率（n=27，NTg，n=68，F112）。（F） 在指定剂量的谷氨酸处理24小时后，初级皮层神经元培养物中的谷氨酸毒性试验显示Tuj1染色。（比例尺=400μm）（G）神经元数量（TuJ1阳性）除以细胞总数（DAPI，未显示），然后将F113和NTg归一化为对照组（无治疗）。（H） 用对照反义寡核苷酸（Scr ASO）或靶向人类第2外显子的ASO处理原代皮层培养物中感观病灶的RNA FISHC9或72抄本（C9 ASO）。（一） C9 ASO治疗后RNA病灶减少的量化（**p=0.004，双侧t检验）。（J） 免疫测定显示，与Scr ASO相比，用C9 ASO处理的C9 BACexp（F112系）小鼠的皮层培养物中poly（GP）DPR蛋白减少（**p=0.004，单向方差分析）。另请参见图S3。
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