跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府网站。

Https公司

网站是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2013年10月23日；5（208）：208ra149。
doi:10.1126/scitranslmed.3007529。

以C9ORF72重复扩增的ALS患者iPSC衍生运动神经元为靶点的RNA焦点

德鲁夫·萨琳 1, 杰奎琳·奥洛克, 普拉塔普·米拉, 穆罕默德, 莎迪·格兰特, 梅根·辛普金森, 肖恩·贝尔, 莎朗·卡莫纳, 洛伦·奥内拉斯, 阿奈斯·萨哈比安, 塔妮娅·根德伦, 伦纳德·彼得鲁切利, 迈克尔·鲍恩, 约翰·拉维茨, 马修·B·哈姆斯, 弗兰克·里戈, C弗兰克·贝内特, 托马斯·S·奥蒂斯, 克莱夫·N·斯文森, 罗伯特·H·巴洛
附属公司

以C9ORF72重复扩增的ALS患者iPSC-derived运动神经元为靶点的RNA焦点

德鲁夫·萨琳等。 科学转化医学. .

摘要

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种严重的神经退行性疾病，其特征是大脑和脊髓中的运动神经元丢失。C9ORF72基因非编码区的六核苷酸重复序列（GGGGCC）的扩增是家族型ALS（C9-ALS）、额颞叶变性和其他神经系统疾病的最常见原因。重复扩张如何导致疾病尚不清楚，提出了功能丧失（单倍体不足）和功能获得（有毒RNA或蛋白质产物）。我们报道了一种C9-ALS细胞模型，其运动神经元与来自携带C9ORF72重复扩增的ALS患者的诱导多能干细胞（iPSCs）分化而来。未观察到C9ORF72表达的显著缺失，并且转录物的敲低对培养的人类运动神经元没有毒性。重复序列的转录增加，导致在C9-ALS iPSC衍生的运动神经元中选择性积累GGGGCC重复RNA焦点。含有重复序列的RNA焦点与hnRNPA1和Pur-α共定位，表明它们可能能够改变RNA代谢。C9-ALS运动神经元显示与膜兴奋性有关的基因（包括DPP6）的表达发生改变，并且与控制运动神经元相比，在去极化时发射连续棘波的能力减弱。靶向C9ORF72转录物的反义寡核苷酸抑制了RNA焦点的形成，并逆转了C9-ALS运动神经元的基因表达改变。这些数据表明，患者源性运动神经元可用于描述ALS的致病事件。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：FB和FR是Isis Pharmaceuticals的员工，持有该公司的股票期权。FB是新加坡实验治疗中心的科学顾问委员会成员。FB已经提交了与这项工作有关的设计和使用反义寡核苷酸的专利C9ORF72型成绩单。

数字

图1
图1。的生成C9ORF72型ALS患者衍生iPSC和运动神经元
（A）四名ALS患者iPSC系中多能性标记物的表达C9ORF72型重复膨胀。免疫染色显示胚胎和多能干细胞表面抗原SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81的表达；以及核多能性标记OCT3/4和SOX2。右侧显示了四个C9ORF72患者iPSC系的核型。(B）SMI32+和ChAT+免疫染色证明从ALS C9ORF72患者衍生iPSCs中高效产生运动神经元。TuJ1是用于评估神经元总产量的泛神经标记物。（C）通过Southern blot分析检查成纤维细胞、多能干细胞和运动神经元培养物中的己二核苷酸重复序列长度，显示重复序列在扩张（第28i、29i、52i行的多能干电池）和收缩（第29名患者的多能干细胞系的运动神经元）时的体细胞不稳定性。iPSC的通道编号如（p）所示。(D）在来自四个个体的iPSC衍生运动神经元培养物中，运动神经元存活时间没有改变C9ORF72型ALS（C9-ALS）患者与四名对照受试者（n=3个独立实验）（单向方差分析，Tukey多重比较测试；对照组与ALS，95%置信区间差异，4周：-12.8至24.15，7周：-7.36至30.42）。运动神经元计数表示为运动神经元（SMI32+）与泛神经元（TuJ1+）种群的比率。(E）当iPSC分化为运动神经元时，观察到功能性运动神经元的特性（分化第69天显示来自对照iPSC 83i系对照的代表性运动神经元）。电流注入为−10 pA和+5 pA（左上角）。运动神经元的静息电位为-60mV，输入电阻为2.6 GigaOhm。同一运动神经元的自发活动（右上角）。确认记录神经元运动神经元身份的代表性图像（底部面板）。实时电生理记录中充满Alexa594染料（红色）的神经元在固定后显示，并用运动神经元标记物ChAT（绿色）进行反染色，以确认其身份。
图2
图2。六核苷酸扩增不会改变C9ORF72型但改变上游外显子的利用以促进重复序列的转录
(A）从来源于对照个体（n=4个独立受试者）和患有ALS的ALS患者的iPSC分化的运动神经元的RNA测序中获得的每千碱基/百万映射读数（RPKM）C9ORF72型重复扩增（C9-ALS，n=4名独立受试者）和成纤维细胞C9ORF72型基因。的总体表达C9ORF72型对照组和对照组的转录本没有差异C9ORF72型扩张载体，运动神经元培养物的RPKM值高于成纤维细胞。(B）四名对照受试者和四名受试者iPSC-衍生运动神经元培养的定量RT-PCRC9ORF72型使用外显子2引物的扩张载体（所有人通用C9ORF72型转录变体），确认C9ORF72型基因。数据表示为n=3个独立实验的平均值±SEM。n.s.，使用学生t检验不显著。(C）iPSC衍生运动神经元培养物细胞组分中C9ORF72蛋白的Western blot显示，由于在这些结构体上存在Flag标记，细胞膜组分中的两条带略小于过度表达的长短亚型的大小。在对照组（83iCTR）和C9ORF72型扩增（28iC9-ALS）运动神经元培养表明重复序列的存在并没有改变总蛋白水平。数据代表n=3个独立实验。(D）5′RACE分析上游外显子序列（外显子1a或1b）的代表性序列比对C9ORF72型对照受试者成纤维细胞中的转录物（14iCTR）。堆叠的水平条代表单个抄本，每个样本有100份抄本排序。在对照细胞中，包含外显子1b的转录物最为常见，外显子1a或外显子lb的转录起始位点几乎没有变化。(E）来自成纤维细胞的5′RACE转录物的比对c9或f72扩张患者（29iC9-ALS）。使用RACE引物第2外显子上游的SNP rs10757668测定来自野生型或扩增等位基因的序列。野生型等位基因（蓝色）的表达与对照组成纤维细胞相似，而扩展等位基因则显示外显子1a的使用频率更高，转录起始位点的变异性更大。(F）包含外显子1a或1b的转录本百分比C9ORF72型患者成纤维细胞（29i和30i）来自野生型（A等位基因，蓝色）或扩张型（G等位基因（红色）），显示来自扩张等位基因的包含外显子1a的转录物百分比增加*p＜0.05，t检验，转录物百分比，野生型与突变等位基因。(G、 H）来自两种不同来源的iPSC-derived运动神经元的5′RACE比对c9或f72扩张型ALS患者（30iC9-ALS和29iC9-ALS）的重复序列表达增强（包含外显子1a），以及突变等位基因转录起始位点使用的变异性。(一）在成纤维细胞中观察到的转录起始位点（TSS）数量的比较C9ORF72型患者29i和30i（右侧面板）和iPSC-衍生运动神经元（左侧面板）。扩张等位基因（G，红色）显示外显子1a转录物的TSS比野生型等位基因的TSS多（A，蓝色），而外显子2b的TSS数量在两个等位基因之间相似*p<0.05，t检验，TSS数量，野生型（A）与突变型（G）。
图3
图3。来自C9-ALS患者的iPSC衍生运动神经元培养产生GGGCCC RNA病灶，与Pur-α和hnRNPA1结合
（A）在iPSC-derived motor neuron培养物（品系83iCTR和52iC9-ALS）中，用GGGGCC重复序列的反义探针进行荧光原位杂交（FISH）的代表性图像。所有C9-ALS患者的细胞中都存在RNA病灶，但对照组的运动神经元培养物中没有。RNA病灶主要是细胞核，但偶尔也在细胞质中发现。比例尺=25μm。下面的直方图显示了每个细胞的焦距数**p<0.01非配对t检验（双尾）***对照组（所有四名受试者）与C9-ALS组（所有四人）的比较p<0.0001 Mann-Whitney检验。(B）在iPSC-derived motor neuron培养物中显示GGGGCC-FISH和不同细胞类型标记物的联合染色的代表性图像。RNA病灶位于神经元前体细胞核（巢蛋白阳性；显示29iC9-ALS线）、运动神经元（SMI32阳性；显示28iC9-ALS线）和星形胶质细胞（GFAP阳性；显示52iC9-AIS线）。比例尺=10μm。(C、 D）典型图像显示GGGCC FISH与RNA结合蛋白的联合染色。共聚焦成像观察到GGGGCC病灶与hnRNPA1和Pur-α共聚焦。白色箭头指向RNA焦点和hnRNPA1或Pur-α在同一焦平面上染色的焦点。相邻面板显示了y-z和x-z轴，确认了在三维中的同位化。比例尺=10μm。C、，52iC9-ALS线；D、，第28iC9-ALS行。（E）热图显示了四名不同的C9-ALS患者（n=4；第28i、29i、30i、52i行）和四名对照受试者（n=4；第00i、03i、14i、83i行）之间通过iPSC-derived运动神经元培养的RNA-seq确定的差异表达基因的层次聚类，p<0.05。箭头表示GGGGCC重复次数最少的受试者的运动神经元培养物（第30iC9-ALS行中为~70），这些重复次数最多的三行中聚集最远（~800）。(F）与对照组相比，C9-ALS患者iPSC衍生的运动神经元培养物中20个最高上调（蓝色）和下调（红色）基因的基因列表。以黄色突出显示的基因包括DPP6（DPP6）之前的ALS GWAS研究中牵涉到小脑蛋白家族的三名成员(CBLN1公司和4）。(G）qRT-PCR验证中突出显示的差异表达基因(F类)，所有p<0.05，CTR（4名受试者）vs C9-ALS（4名被试者），t检验。(H）C9-ALS iPSC-衍生运动神经元培养物的兴奋性（n=184）低于对照iPSC-派生运动神经元培养液（n=137）。对分化第66-79天的运动神经元培养进行记录。显示了对来自对照受试者（黑色，iPSC线83i）或C9-ALS患者（红色，iPSC线28i）的运动神经元的−10、0和10pA电流注射的响应的代表性迹线。对照组（黑色）和C9-ALS（红色）培养的运动神经元的动作电位平均数，作为电流注入的函数。图（右）显示了不同电流注入水平下激发的尖峰数量，与对照iPSC-衍生运动神经元相比，C9-ALS iPSC-派生运动神经元中激发的尖锋数量减少（CTR、iPSC线14i和83i、C9-ALS-iPSC线28i和52i；n=2个独立实验）。运动神经元的静息电位和输入电阻为−68.5 mV，控制为3.4 GigaOhm，C9-ALS运动神经元为−61.5 mV（3.2 GigaOmm）*p<0.05**p<0.01***p<0.001；C9-ALS与对照，非配对t检验，双样本，不相等方差。
图4
图4。击倒C9ORF72型反义寡核苷酸抑制ALS运动神经元的RNA焦点
(A）的示意图C9ORF72型基因结构，显示反义寡核苷酸（ASO）816和061的位置，以及用于检测外显子2中C9ORF72表达的引物。(B）用ASOs 816和061处理的iPSC衍生的运动神经元（C9-ALS系28iC9 ALS和52iC9 ALS）中总C9ORF72的定量RT-PCR。ASO816，针对所有人共同的第一个编码外显子C9ORF72型亚型，整体分解C9ORF72型约90%。ASO061对总转录水平有部分影响。（单因素方差分析-Tukey多重比较试验，差异的95%置信区间；未处理与加扰（n.s.）：−0.1713至0.4167；加扰与ASO061（n.s.）：−0.006394至0.5816；加扰与ASO816（***）：−0.5671至1.155；ASO816与ASO061（**.）：−0.8675至−0.2796）。n.s.=不重要。数据表示为n=3个独立实验的平均值±SEM。(C）5′RACE分析（所示为52iC9 ALS行），以分析用扰乱的ASO（左）或ASO061（右）治疗后的5′外显子利用率。虽然ASO061没有改变总数C9ORF72型在转录水平上，它抑制了包含外显子1a的转录物，同时相对增加了包含外隐子1b的转录物。(D）用不同ASO处理的C9-ALS患者运动神经元培养物（线29iC9-ALS和52iC9-ELS）上RNA FISH的代表性图像（打乱-“Scr.”，816061）显示ASO处理细胞中RNA焦点显著抑制。比例尺=10μm。下图显示了具有焦点的细胞百分比的量化（左），以及按每个细胞的焦点显示细分的直方图（右）。**=p<0.01；*=p<0.05；非配对t检验（双尾）。(E）C9-ALS iPSC-衍生运动神经元培养中异常上调基因的定量RT-PCR(DPP6（DPP6），CBLN1型，CBLN2、CBLN4和SLITRK2系列)用打乱的ASO或ASO816处理后（显示第14iCTR和52iC9-ALS行）。误差线为平均值±sem。***p<0.001**p<0.01；未配对t检验（双尾），加扰与ASO816。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“引用者”文章

工具书类

    1. Lomen-Hoerth C、Anderson T、Miller B。肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆的重叠。神经病学。2002年10月8日；59:1077.-公共医学
    1. Chen-Plotkin AS、Lee VM、Trojanowski JQ。神经退行性疾病中的TAR DNA-结合蛋白43。Nat Rev Neurol公司。2010年4月；6:211.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Ravits J等人。解读肌萎缩侧索硬化症：表型、神经病理学和遗传学告诉我们的发病机制是什么。肌萎缩侧索硬化症和额颞叶变性。2013年5月；14（补充1）：5。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Seeley WW公司。额颞叶痴呆患者的选择性功能、区域和神经元脆弱性。神经醇电流。2008年12月；21:701.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Neumann M等。额颞叶变性和肌萎缩侧索硬化症中的泛素化TDP-43。科学。2006年10月6日；314:130.-公共医学

出版物类型

MeSH术语