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.2015年12月2日；88(5):902-909.
doi:10.1016/j.neuron.2015.111.018。

人C9ORF72六核苷酸扩增在BAC转基因小鼠中复制RNA Foci和二肽重复蛋白，但不产生神经变性

欧文·彼得斯 # 1, 加布里埃拉·托罗·卡布雷拉 # 1 2, 海伦·特拉 1, 塔尼亚·F·根德隆 三, 珍妮·麦基恩 1, 杰克·梅特维尔 1, 亚历山德拉·韦斯 1, 尼古拉斯·威特曼 1, 约翰尼·萨拉梅 1, 朱云·金 4, 孙华明 2, 凯文·博伊兰 5, 丹尼斯·迪克森 三, 扎克·肯尼迪 1, 林自强 1, 张永杰 三, 莉莲·多赫蒂（Lillian Daughrity） 三, 克里斯·荣格 6, 汾标高 1, 彼得·萨普 1 7, H罗伯特·霍维茨 7, Daryl A Bosco公司 1, Solange P Brown公司 4, 彼得·德容 6, 伦纳德·彼得鲁切利 三, 克里斯·米勒 2, 小罗伯特·H·布朗 1
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人C9ORF72六核苷酸扩增在BAC转基因小鼠中复制RNA Foci和二肽重复蛋白，但不产生神经变性

欧文·彼得斯等。 神经元. .

摘要

C9ORF72基因中的非编码己核苷酸重复序列扩增是与家族性肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）相关的最常见突变。为了研究C9ORF72在这些疾病中的病理作用，我们建立了一个携带细菌人工染色体的小鼠系，该细菌人工染色体包含人类C9ORF 72基因的外显子1至6，GGGCC基序重复约500次。小鼠没有表现出明显的行为表型，但重述了C9ORF72 ALS/FTD的独特组织病理学特征，包括正反义核内RNA焦点和聚甘氨酸-脯氨酸二肽重复蛋白。最后，在C9BAC小鼠的原代皮层神经元培养物中使用靶向人C9ORF72的人工微小RNA，我们已经减弱了C9BAC转基因和多聚（GP）二肽的表达。C9ORF72 BAC转基因小鼠将成为研究ALS/FTD病理生物学和治疗的重要工具。

关键词：肌萎缩侧索硬化症；C9ORF72；RAN翻译；RNA焦点；额颞叶痴呆；微RNA；神经变性；重复扩张；转基因小鼠。

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数字

图1
图1。C9ORF72 BAC转基因小鼠的构建、扩增大小和表达谱
（A） 用于产生C9BAC小鼠的细菌人工染色体片段示意图。153.2kb结构包含（从左到右）140.5kb人类基因组DNA上游C9ORF72型，人类C9ORF72型启动子区域，外显子1到部分外显子6带有a（GGGCC）500重复图案C9ORF72型内含子1。黑条表示B中使用的Southern印迹探针的目标区域。（B）用HindIII、SacI和TaqI消化的各种组织提取的基因组DNA的Souther印迹，并用5'-DIG-（GGGCC）进行探测5-DIG-3'DNA探针。约4.4kb和约6.0kb的两条带在6代后大小稳定，代表300和500重复序列的扩展（也见图S1B）。箭头表示非特定带区。（C） 全人类表达的ddPCR分析C9ORF72型非神经疾病对照组、c9ALS/FTD和SOD fALS患者的人类额叶皮层组织中的变体（Vall）、变体V1、V2和V3以及小鼠C9ORF72直系物，以及C9BAC和Ntg小鼠的全脑匀浆（平均值±SEM，n=4，Kruskal-Wallis检验，Mann-Whitney U检验，*p<0.05，ND=未检测到）。（D） 代表寿命的Kaplan-Meier曲线显示，C9BAC小鼠的存活率与Ntg同窝小鼠相比没有显著差异（Ntg n=17，C9BA n=16，Mandel-Cox Log Rank，P=0.971）。（E） 生理学研究表明，运动单位数估计（MUNE）运动单位大小或复合运动动作电位没有显著变化，但肌电图得分略有增加（平均值±SEM，Ntg n=3，C9BAC n=4非配对t检验）。
图2
图2。C9BAC小鼠重述了C9ORF72型ALS和FTD患者
（A） 荧光就地使用Cy3标记的DNA探针进行杂交，以对抗感觉和反感异常扩增C9ORF72型转录本（红色=探针，蓝色=DAPI核染色）。这个C9ORF72型在24个月大的C9BAC小鼠的整个大脑，包括运动皮层内锥体层和内颗粒层，以及腰椎运动神经元中，含有感觉或反感觉转录物的重复序列形成核内RNA内含物或病灶。FISH结合细胞类型特异性免疫染色显示神经丝重阳性神经元（B）、胆碱乙酰转移酶（ChAT）阳性锥体神经元（C）和GFAP阳性星形胶质细胞（D）中的有义转录物病灶。10个月龄和24个月龄C9BAC小鼠运动皮层内锥体层（E）和腰椎运动神经元核（F）的每核感觉转录焦点数量均减少（平均值±SEM，双向方差分析，Bonferroni多重比较*p<0.05，**p<0.001）。（G） 通过免疫分析对4个月龄和24个月龄C9BAC小鼠中枢神经系统和肝脏各区域以及C9ALS病例额叶皮层中的可溶性多聚（GP）蛋白进行定量（平均值±SEM，C9BAC-组n=3，C9ALS n=6，双向方差分析，Bonferroni多重比较，*p<0.05，***p<0.001）。（H） C9BAC小鼠皮层多聚（GP）蛋白的免疫染色。染色显示，在10个月大时，整个大脑中都存在小的核周包涵体，在24个月大的小鼠中观察到的数量显著增加。在年龄匹配的Ntg小鼠中未观察到此类内含物。比例尺A-D=10μm，H=20μm。
图3
图3。C9BAC小鼠和初级皮层神经元中C9ORF72的沉默
（A） 培养10天的C9BAC胚胎皮层神经元中检测到正反义病灶在体外（DIV）。这些病灶在RNase治疗后不可见，在Ntg神经元中，或通过针对强直性肌营养不良相关的1型（CTG）n或2型（CCTG）n扩张的探针（DM1和DM2，标尺=5μm）未检测到。（B） ●●●●。通过ELISA测定来自单个C9BAC或Ntg同窝胚胎的培养皮层神经元中聚（GP）的浓度（平均值±SEM，未配对t检验，Ntg n=2，C9BACn=6，未配对t检验）。（C） 来自单个C9BAC和Ntg胚胎的培养皮层神经元对自噬抑制剂氯喹或3-甲基腺嘌呤的反应没有显著差异（两个独立实验，单个胚胎培养；C9BACn=6，Ntg n=5，平均值±SEM，双向方差分析，Bonferroni多重比较，*p<0.05）。（D） 所有转录本的ddPCR分析C9ORF72型（Vall）在两个独立实验中相对于HPRT（实验1。单个胚胎n=4，平均值±SEM，单因素方差分析，Bonferroni多重比较试验，*p<0.05，***p<0.0001；实验2。混合胚胎培养，n=3，单因素方差分析，Bonferroni多重比较试验***p<0.001）。（E） rAAV-GFP-miRC9成熟microRNA产物水平（归一化为snoRNA135）与C9ORF72型相对于实验1（黑色）和实验2（蓝色）的rAAV-GFP。（F） 通过ELISA定量两个独立实验（实验1）培养的初级皮层神经元的聚（GP）水平。单个胚胎n=2，平均值±SEM，单因素方差分析；实验2。混合胚胎培养，n=3，单因素方差分析，Bonferroni多重比较试验，**p<0.001）。
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