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.2010年10月11日；5（10）：e13250。
doi:10.1371/journal.pone.0013250。

焦油DNA结合蛋白-43（TDP-43）与应激颗粒相关：培养细胞和病理脑组织的分析

利群·刘-叶苏克维茨 1, 艾琳·比尔古泰, 张永杰, 塔拉·范德韦德, Allison Citro公司, 塔潘·梅塔, 纳瓦·扎鲁, 安·麦基, 罗伯特·鲍泽, 米歇尔·谢尔曼, 伦纳德·彼得鲁切利, 本杰明·沃洛津
附属公司

焦油DNA结合蛋白-43（TDP-43）与应激颗粒相关：培养细胞和病理脑组织的分析

利群·刘-叶苏克维茨等。 公共科学图书馆一号. .

勘误表in

  • 公共科学图书馆一号。2011;6(9). doi:10.1371/annotation/7d880410-06e3-4fe3-a8f1-e84c89bcf8d0。塔拉·范德韦德[更正为塔拉·范德韦德]

摘要

焦油DNA结合蛋白-43（TDP-43）是许多额颞叶变性（FTLD-U）和肌萎缩侧索硬化（ALS）病例中内含物的主要成分。TDP-43主要位于细胞核内，但在ALS和FTLD-U中枢神经系统的受累区域，TDP-43被异常处理并形成细胞质内含物。控制TDP-43包裹体形成的机制尚不清楚。越来越多的证据表明，TDP-43通过与已知与RNA颗粒相关的mRNA结合蛋白相互作用来调节mRNA代谢。在这里，我们发现TDP-43可以在细胞培养中被诱导形成内含物，并且大多数TDP-43内含物与SG共同定位。SGs是细胞质RNA颗粒，由混合蛋白-RNA复合物组成。在应激条件下，SG由朊蛋白样蛋白（如TIA-1）的可逆聚集产生，以调节mRNA代谢和蛋白质翻译。我们还发现，TDP-43的疾病相关突变增加了TDP-43内含物的形成，以应对应激刺激。生化研究表明，TDP-43包合物形成增加与TDP-43洗涤剂不溶性复合物的积累有关。TDP-43通过与SG蛋白（如TIA-1）的直接蛋白质相互作用以及RNA依赖性相互作用与SG相关。调节SGs形成的信号通路也调节TDP-43内含物的形成。我们观察到，WT或突变TDP-43介导的包涵体形成可以通过使用抑制或逆转SG形成的翻译抑制剂来抑制。最后，使用苏丹红抑制内源性自发荧光，我们还证明了病理性中枢神经系统组织中的TDP-43阳性内含物与应激颗粒的多种蛋白质标记物共同定位，包括TIA-1和eIF3。这些数据为积累TDP-43参与SG途径的证据提供了支持。

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竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。TDP-43构造：显示此报告中使用的TDP-43构建的图表。
增强型绿色荧光蛋白；RRM，RNA识别基序；GRR，富含甘氨酸结构域；NLS，核定位信号；NES，核出口信号。
图2
图2。TDP-43内含物与SG蛋白共定位。
A.）TDP-43：：EGFP在基础条件下和亚砷酸盐治疗后人类神经母细胞瘤BE-M17细胞中的细胞分布；细胞与抗TIA-1抗体（红色，标记SG）和DAPI（蓝色，标记细胞核）共同标记。基本情况（左侧面板）：WT TDP-43（T-FL）通常表现为弥漫性核表达，而TDP-43216–414（T-216）和TDP-4386–414（T-86）：：EGFP构建物形成细胞质和核内含物。TDP-43反应性与RNA结合蛋白TIA-1共定位。亚砷酸盐处理（右侧面板）：亚砷酸钠处理（0.5 mM，1小时）诱导一些TDP-43：：EGFP转移到细胞质中，在那里形成与TIA-1共定位的内含物（箭头），表明内含物是SG。TDP-43216–414和TDP-4386–414：：EGFP构建物在细胞质（箭头）和细胞核中形成内含物，但只有TDP-43生成的内含物86–414亚砷酸盐增加了结构。亚砷酸盐处理的细胞中存在的内含物与TIA-1共同定位。B.）与TDP-43和TIA-1共定位的TDP-43包裹体的量化。C.）在Hanks平衡盐溶液中培养1小时，诱导TDP-43包裹体（箭头）的形成，与TIA-1阳性包裹体共定位。在相同条件下，转基因EGFP没有形成内含物。比例尺：3µm。
图3
图3。利用SG标记对TDP-43包裹体进行共定标。
A.）转染TDP-43的人神经母细胞瘤BE-M17细胞86–414（T-86:：GFP）在基础条件下构建形成细胞质内含物（箭头）。包裹体与内源性SG标记物共定位，包括TIA-1、TIA-R和免疫细胞化学（ICC）鉴定的Poly A结合蛋白（PABP）。B.）TDP-43夹杂物（WT = T-FL、TDP-43216–414 = T-216，TDP-4386–414 = 亚砷酸盐处理后出现的T-86，绿色）也与eIF3（红色）共存。C.）TDP-43和Dcp1a（P-体蛋白标记物）的双重标记。用WT TDP-43：：GFP转染BE-M17细胞 = T-FL、TDP-4386–414：：GFP = T-86和TDP-43216–414 = T-216:：GFP（绿色）和Dcp1a-mRFP（红色）。Dcp1a:：mRFP标记P-体（三角形），靠近TDP-43阳性夹杂物（箭头）。在标有“高磁”的面板中，方框区域以较高的放大倍数显示。比例尺 = 3微米。
图4
图4。TDP-43与翻译和细胞死亡的关系。
A.）代表性免疫印迹显示TDP-43对蛋白质翻译的影响。用GFP或TDP-43（WT，TDP-43）转染HEK-293细胞86–414或TDP-43216–414). 24小时后，他们接受±亚砷酸盐治疗（0–0.1 mM，45分钟），使用点击化学标记（15分钟脉冲）评估蛋白质翻译。亚砷酸盐处理强烈抑制大多数蛋白质的翻译。TDP-43的表达与蛋白质翻译的任何一致性变化无关。B.）TDP-43结构表达诱导caspase活性（WT = T-FL、TDP-43216–414 = T-216、TDP-4386–414 = T-86）；对照（Ctrl）指EGFP转染。
图5
图5。内源性TDP-43在亚砷酸盐处理后形成包裹体（0.5 mM，1小时，箭头，BE-M17细胞），包裹体呈TIA-1阳性（红色）。
通过与环己酰亚胺（50µg/ml，1小时）共同处理抑制TDP-43夹杂物。在基础（对照）条件下，TDP-43或TIA-1阳性内含物不明显。比例尺：10µm。
图6
图6。TDP-43和TIA-1的共同免疫沉淀。
用TDP-43（WT、K82/84A或A315T）和TIA-1转染HEK 293细胞。K82/84A TDP-43结构体去除了核定位信号（图7B中再次使用该结构体），A315T TDP-43构造体包含与家族性ALS相关的突变（图8中再次使用此结构体）。在37°C下用RNase A（50µg/ml）处理裂解产物30分钟。用TIA-1抗体进行免疫沉淀，用TDP-43抗体检测免疫印迹。左侧上部面板：在与TDP-43：：EGFP共转染TIA-1的通道中，明显存在与TDP-43:：EGFP-结构（双星）相对应的丰富反应性。43 KD（单星）处的较弱带也很明显，表明TIA-1和内源性TDP-43之间存在关联。最后，在与A315T TDP-43（三星级）相对应的车道上，也明显存在与TDP-43：：EGFP二聚体（～140 KD）的预期大小大致一致的较高分子量带。左下面板：在用RNase A处理后，与TDP-43的结合仍然存在，尽管它减少了（双星）。用RNase A处理后，TIA-1与内源性TDP-43（单星）之间的结合被取消，与上带（三星）的结合被减少，这可能与TDP-43:：EGFP二聚体相对应。右上面板：阴性对照显示免疫沉淀的特异性。左车道：用于免疫沉淀的转染细胞裂解液（30µg）。右车道：用兔IgG代替抗TIA-1抗体进行免疫沉淀。用抗TDP-43抗体进行免疫印迹。
图7
图7。应力颗粒调节剂对TDP-43包裹体形成的调节。
A） 翻译抑制剂环己酰亚胺（50µg/ml，1小时）或依米汀（20µg/ml，1小时，）分散由WT-TDP-43:：EGFP（T-FL）TDP-43形成的包裹体86–414：：EGFP（T-86），而嘌呤霉素（20µg/ml，3小时）增加TDP-43的形成86–414：：EGFP包裹体形成。嘌呤霉素还诱导WT和TDP-43形成的细胞质内含物的形成86–414：：EGFP（箭头）。然而，嘌呤霉素不会改变TDP-43的丰度216–414：：EGFP（T-216）夹杂物。B） TDP-43：：缺乏核定位信号的EGFP（TDP-43 K82/84A）在亚砷酸盐处理后形成丰富的细胞质内含物，与TIA-1（抗TIA-1抗体，红色）共定位。通过与环己酰亚胺（50µg/ml，1小时）共同处理来分散夹杂物。量化显示在右边的条形图中。C.）用TDP-43ΔRRM1和ΔRRM2/2结构体（N-末端EGFP标签）转染细胞。24小时后，将细胞置于两种条件下：亚砷酸盐（0.5 mM，1小时）或亚砷酸钠加环己酰亚胺（50µg/ml，1 h）。然后固定细胞，并进行TDP-43内含物与TIA-1共同定位的免疫细胞化学。箭头指向显示TDP-43和TIA-1共定位的代表性包裹体。细胞质TDP-43包涵体的形成在基础条件下不明显，但在亚砷酸盐暴露条件下，两种结构均形成与TIA-1共定位的包涵体，且环己酰亚胺可逆。量化显示在右边的条形图中。比例尺：10µm。
图8
图8。ALS-连接的TDP-43突变增加了聚集性，以应对亚砷酸盐诱导的应激。
A） 转染WT、Q331K或Q343R TDP-43：：EGFP的人神经母细胞瘤BE-M17细胞的代表性图片。经亚砷酸盐处理（0.5 mM，1小时）后，Q331K和Q343R TDP-43：：EGFP构造比WT构造产生更多的夹杂物（箭头）。然而，亚砷酸盐和环己酰亚胺（CHX，50µg/ml，1小时）的共同处理可防止夹杂物的形成。B） EGFP和TDP-43-EGFP构建物（WT、G294A、A315T、Q331K和Q343R）在不同条件下（基础、亚砷酸盐和亚砷酸钠+环己酰亚胺）细胞质包涵体形成的定量。每个条件统计15个字段。比例尺 = 8微米。
图9
图9。与疾病相关的TDP-43突变与不溶性蛋白质聚集体水平增加有关。
用TDP-43（WT、A315T或Q343R）转染HEK 293细胞。48小时后，将细胞处理为±亚砷酸盐（0.5 mM，1小时），分离成可溶和不可溶部分，并进行免疫印迹。上面板：可溶部分。下面板：不溶部分。可以观察到几个不同种类的TDP-43，包括推测与内源性TDP-43（单星）、TDP-43:：EGFP（双星）和二聚体TDP-43：：EGFP（三星）相对应的带。突变与亚砷酸盐处理后不溶性TDP-43水平增加和TDP-43分解产物（TDP-43：：EGFP下的条带）水平增加有关。
图10
图10。毒性量化。
A） 亚砷酸盐处理后，TDP-43的疾病相关突变增加了半胱天冬酶3/7的活性。用EGFP或TDP43（WT、Q331K或Q343R）转染HEK 293细胞。48小时后，对细胞进行±50µM亚砷酸盐处理，12小时后在各种条件下测定caspase 3/7活性。结果显示，在基本条件下，EGFP转染细胞的结果正常化。B） 用EGFP或TDP43（WT、G294A或Q331K）转染BE-M17细胞。48小时后测量LDH释放，并将其归一化为总LDH和转染效率。基线毒性设定为EGFP转染的神经元。转染TDP-43（WT、G294A或Q331K）会增加LDH释放，G294A和Q331K-TDP-43的释放量明显高于WT TDP-43 = 每组6次测量）。C.）12小时时，亚砷酸盐（50µM）诱导TDP-43夹杂物。
图11
图11。ALS和FTLD-U脑中TDP-43内含物与SG标记物（eIF3和TIA-1）的共定标。
A） 用苏丹黑处理人大脑皮层切片，强烈降低红、绿通道中脂褐素的内源性荧光（受试者14，表1）；蓝色通道为DAPI染色。B） ALS患者脊髓内含物中TIA-1与TDP-43的共放大（Ctrl =  受试者5，ALS =  受试者1，表1）。在标有“高磁”的面板中，方框区域以较高的放大倍数显示。C） FTLD-U患者额叶皮质TDP-43内含物与eIF3（Ctrl）共定位 =  受试者16，FTLD =  受试者11，表1）。含有TDP-43内含物的FTLD-U和ALS切片显示与SG标记物共定位。D） FTLD-U脑中磷酸化-TDP-43和eIF3反应性的共同定位（受试者10，表1）。E） 免疫细胞化学对照。第1行：无神经系统疾病患者脑组织中的TDP-43主要表现为核定位（受试者14，表1）。第2行：FTLD-U患者TDP-43阳性细胞质内含物显示与eIF3共定位（受试者9，表1）。第3-5行：用抗原肽证明免疫吸收，消除eIF3染色（对照样品 =  神经系统正常者14例；自由贸易区 =  受试者9，表1。比例尺：A、B、C、D = 10微米，E = 3微米。
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