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基因发育。1998年3月1日；12(5): 654–666.
数字对象标识：10.1101/gad.12.5.654
预防性维修识别码：PMC316571型
PMID：9499401

HSF1特异性转录的分子伴侣 阻遏物

石彦宏，1 迪克·莫瑟，2和理查德·森本理查1,三
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

热休克基因的快速瞬时转录激活是由HSF1从惰性负调控单体可逆转化为转录活性DNA-结合三聚体介导的。在热休克反应减弱期间，热休克基因的转录恢复到基础水平，HSF1恢复为惰性单体。这些事件与Hsp70和其他热休克蛋白（分子伴侣）水平升高一致。在这里，我们表明分子伴侣Hsp70和耳蜗酮Hdj1直接与HSF1的反式激活域相互作用，并抑制热休克基因转录。任一伴侣的过表达抑制转染的GAL4-HSF1激活域融合蛋白和内源性HSF1的转录活性。由于HSF1 DNA结合的激活和HSF1的诱导磷酸化均未受到影响，因此Hsp70的主要自我调节作用是负调控HSF1转录活性。这些结果表明，热休克基因转录的抑制是由于Hsp70与HSF1反式激活结构域的结合，从而为分子伴侣在热休克反应自动调节的至少一个关键步骤中的作用提供了可信的解释。

关键词：转录控制、自身调节、热休克蛋白、Hsp70、激活域

细胞对各种形式的环境和生理应激的反应，包括热休克、重金属、氧化剂、紫外线、细胞因子或激素，涉及目标基因的快速转录诱导，其活性由不同的应激特异性转录因子调节(Baeuerle 1995年). 对每一种压力的分子反应都有助于保护细胞免受相同或其他潜在有害形式压力的致命暴露。例如，热休克基因的转录迅速被诱导，但短暂地维持在最大水平，并随着应激强度或恢复到控制状态而成比例衰减(DiDomenico等人，1982a，b条；Mosser等人，1988年；Straus等人，1990年；Abravaya等人，1991年). 在高等真核生物中，热休克转录反应的应激诱导成分主要是热休克因子（HSF），它们在非应激细胞中以惰性非DNA结合状态普遍表达和维持。当细胞暴露于看似不同的应激条件下时，HSFs被激活到DNA结合的转录活性状态，这导致热休克基因的优先转录(Mosser等人，1988年；Morimoto等人，1990年；Lis和Wu 1993年；森本茂1993；Rabindran等人，1993年；Sarge等人，1993年；Westwood和Wu 1993；吴1995).

热休克反应为细胞提供了重建蛋白质稳态、蛋白质合成、蛋白质折叠和组装以及蛋白质降解之间平衡的机制。尽管暴露于升高的温度会导致在长时间的热休克或恢复时减弱的反应，但当类似物结合到新生多肽中时，热休克反应的其他诱导物，如氨基酸类似物，会激活热休克基因表达。在后一种情况下，热休克基因组成性上调，不会发生衰减(DiDomenico等人，1982b；Mosser等人，1988年). 除其他外，这些观察结果导致了一个广泛接受的建议，即热休克反应是由热休克蛋白自动调节的。另外，遗传证据也支持这一点，即酵母Hsp70的突变导致热休克基因的过度表达(克雷格和雅各布森1984；克雷格和格罗斯1991)并依赖于HSF与DNA的结合位点(Boorstein和Craig 1990年)以及Hsp70与HSF相互作用的生化证据(Abravaya等人，1992年；Baler等人，1992年；Mosser等人，1993年；Rabindran等人，1994年). 然而，目前尚不清楚HSF调节中的许多事件中，包括三聚、DNA结合、诱导型磷酸化或应激诱导的转录激活，哪些受到Hsp70的影响。由于酵母HSF是组成性三聚体，在衰减过程中不会转化为非DNA结合单体，因此主要的调控形式可能是转录激活水平(Sorger等人，1987年；雅各布森和佩勒姆1988；Sorger和Nelson 1989年；Boorstein和Craig 1990年). 分子伴侣在调节热休克反应中的作用也已在大肠杆菌。这个大肠杆菌由DnaK、DnaJ和GrpE组成的DnaK伴侣机通过与σ32(Tilly等人，1983年；Grossman等人，1987年；Straus等人，1990年；Liberek等人，1992年；Blaszczak等人，1995年；Gamer等人，1996年).

在本研究中，我们证明Hsp70在体内和体外与HSF1的反式激活域稳定结合。其结果是负调控HSF1的转录活性，而对HSF1的DNA结合或诱导磷酸化状态几乎没有影响，因此表明分子伴侣Hsp70起到了抑制热休克特异性转录激活因子转录活性的作用。

结果

Hsp70与HSF1交易激活域关联

热休克转录反应的减弱发生在持续暴露于中等热休克条件或从应激中恢复时(Abravaya等人，1991年). 衰减的一个特征是热休克基因转录的快速抑制，这先于HSF1三聚体转化为单体，并且HSF1 DNA结合活性的丧失(Abravaya等人，1991年；Kline和Morimoto 1997). 这些复杂事件的动力学表明，其他蛋白质可能直接作用于HSF1激活结构域，可能抑制其转录活性。因此，我们使用直接蛋白质相互作用分析筛选与HSF1反式激活域（氨基酸395-503）相互作用的潜在调节蛋白。来自HeLa的提取物35S标记蛋白，四种大小在30到70 kD之间的蛋白质与野生型HSF1激活域特异性结合，融合到GST，而不是与GST单独或与转录惰性HSF1激活区缺失突变体（氨基酸451–503）结合（图。​（图1A）。1A） ●●●●。Hsp70被鉴定为与HSF1激活域相关的蛋白质之一（图。​（图1B）。1B） ●●●●。与Hsp70的相互作用具有选择性，因为在活化域结合蛋白的收集中未检测到Hsp90（数据未显示）。

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 在体外和体内，Hsp70与HSF1激活域结合。(A类)与HSF1激活域结合的蛋白质的鉴定。单独GST、HSF1激活域（氨基酸395-503）GST融合蛋白（GST-AD）或HSF1激活区（氨基酸451-503）的缺失突变体GST融合蛋白质（GST-ΔAD）与35S标记的HeLa全细胞提取物。结合蛋白通过SDS-PAGE和荧光分析进行分析。指出了分子量标记（MW）的大小。(B类)Hsp70是HSF1激活域相互作用蛋白之一。用Hsp70特异性抗体3A3通过蛋白质印迹分析分析与GST、GST–AD或GST–ΔAD结合的蛋白质。HeLa全细胞提取物（WCE）输入作为阳性对照。(C类)免疫沉淀法测定Hsp70与HSF1激活域相互作用。用β-肌动蛋白转染COS-7细胞热休克蛋白70单独构建（S.P.Murphy，unpubl.）或与GAL4-HSF1激活域（GAL4-AD）构建（+）一起构建。细胞裂解物用Hsp70特异性抗体3A3免疫沉淀，用HSF1特异性多克隆抗体免疫印迹。显示内源性HSF1和转染的GAL4–AD(正确的). 将一等分的细胞裂解物（WCE）直接用Western blot分析作为对照。(D类)Hsp70增加与HSF1在热休克减弱或恢复过程中相关。HeLa细胞在42℃下热休克0、15、60和240分钟，或在42℃热休克120分钟，然后在37℃下恢复240分钟（R）。用HSF1特异性多克隆抗体免疫沉淀细胞裂解物，并用Hsp70特异性单克隆抗体C92或HSF1特异的单克隆抗体4B4免疫印迹。

为了进一步研究HSF1反式激活域与Hsp70的相互作用，使用Hsp70特异性抗体通过免疫沉淀分析对短暂过度表达GAL4-HSF1和Hsp70细胞进行分析。通过蛋白质印迹分析对含有Hsp70的免疫复合物的HSF1的存在进行分析。转染的GAL4–HSF1激活域融合蛋白和内源性HSF1均属于Hsp70相关蛋白（图。​（图1C）。1C） ●●●●。这证实了先前的结果，即Hsp70与HSF1相互作用(Abravaya等人，1992年；Baler等人，1992年；Rabindran等人，1994年)并证明Hsp70相互作用的特定位点是HSF1激活域。在4小时的热休克过程中，通过与HSF1特异性抗体共免疫沉淀检测到Hsp70与HSF1的相关性。在热休克的衰减和恢复过程中，Hsp70水平的增加与HSF1复合物有关（图。​（图11D） ●●●●。

HSF1激活结构域与Hsp70和Hdj1直接相互作用

为了检查Hsp70与HSF1激活域的相互作用是直接的还是涉及其他蛋白质，纯化的重组人Hsp70被与GST-HSF1激活区孵育并检查复合物的形成。在没有其他蛋白质的情况下，Hsp70直接与HSF1激活域相互作用（图。​（图2A）。2A） ●●●●。HSF1激活域还与Hsp70同源物Hsc70结合（图。​（图2A）2A） 和DnaK（数据未显示），但与Hsp70 AAAA突变体无关（图。​（图2A）2A） 具有从EEVD突变为AAAA的Hsp70的最后四个氨基酸，并且缺乏伴侣功能(Freeman等人，1995年). 为了进一步检测相互作用的特异性，在结合试验中研究了其他伴侣，包括Hdj1和Hsp90。Hdj1也与HSF1激活域直接相互作用，但Hsp90没有（图。​（图2B）。2B） ●●●●。Hsp70与底物结合的一个特征是ATP介导的底物释放(佩勒姆1986；Clarke等人，1988年；Flynn等人，1989年；Kost等人1989；Beckmann等人，1990年；Palleros等人，1991年). 为了检测ATP对Hsp70–HSF1激活域相互作用的影响，在没有或存在ATP或其不可水解的类似物ATP-γs的情况下进行了类似的结合试验。HSF1–Hsp70复合物在添加ATP后解离，不受ATP-γs的影响（图。​（图2C），2C） 类似于Hsp70与底物的相互作用。HSF1激活域也与Hdj-1相互作用，但HSF1–Hdj1复合物对核苷酸不敏感（图。​（图2C），2C） 与DnaJ与底物相互作用的ATP不敏感性的其他观察结果一致(Wawrzynow和Zylicz 1995).

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 Hsp70和Hdj1直接与HSF1激活域相互作用。(A类)体外重组Hsp70和HSF1激活结构域的相互作用。纯化的重组Hsp70、Hsc70和Hsp70 AAAA突变体与纯化的GST或GST-HSF1激活域融合蛋白（GST-AD）在谷胱甘肽珠上孵育。与GST结合的蛋白质（通道5–7)或GST–AD（车道9–11)用SDS-PAGE和考马斯蓝染色进行分析。车道中包括Hsp70、Hsc70和Hsp70 AAAA突变株1, 2,和3中，分别；GST在通道中4;GST–AD在车道上8；分子质量标记（MW）在车道上12(B类)体外重组Hdj1与HSF1激活域的相互作用。纯化的重组Hdj1和Hsp90在谷胱甘肽珠上与GST或GST-AD孵育。与GST结合的蛋白质在通道中4和5;通道中与GST–AD结合的蛋白质7和8;车道内的Hdj11;车道内的Hsp902;车道GST三；GST–车道AD6;车道内的MW9(C类)核苷酸对Hsp70或Hdj1与HSF1激活域相互作用的影响。Hsp70或Hdj1与GST–HSF1激活结构域在不存在核苷酸的情况下孵育（泳道3,7)，存在1m米ATP（车道4,8)，或1米米ATP-γs（车道5,9). 车道中包括Hsp70输入1;GST–车道AD2;车道内的Hdj16;车道内MW10（尺寸为正确的).

随后在用纯化的全长Hsp70、氨基末端ATP酶结构域或羧基末端底物结合结构域的结合测定中鉴定了Hsp70与HSF1相互作用的结构域（图。​（图3A）。三A） ●●●●。只有全长Hsp70和底物结合域与HSF1激活域相互作用；未检测到Hsp70-ATPase结构域与HSF1激活域的结合（图。​（图3B）。三B） ●●●●。这些结果以及HSF1–Hsp70复合物的ATP敏感性（图。​（图2C），2C） 表明HSF1激活域与Hsp70之间的相互作用具有底物-伴侣复合物的特征，与主要通过Hsp70的ATP酶域发生的cochaperone-Hsp70相互作用不同(Hohfeld等人，1995年；蔡和道格拉斯1996).

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 Hsp70的羧基末端底物结合域与HSF1的激活域相互作用。(A类)显示了全长人类Hsp70（氨基酸1-640）、缺失突变型Hsp70 N（氨基酸1-436和618-640）和Hsp70 C（氨基酸386-640）的示意图。ATP结合域（氨基酸1–386）表示为阴影框；底物结合域（氨基酸386–640）作为固体盒。指出了抗Hsp70单克隆抗体3A3或5A5的表位。(B类)HSF1激活域与Hsp70的底物结合域相互作用。纯化的全长重组Hsp70、Hsp70 N（含降解产物）和Hsp70 C（含一些全长Hsp70）与纯化的GST（lanes）孵育5–7)或GST–HSF1激活域（GST–AD）（车道9–11)结合蛋白被广泛洗涤，并通过SDS-PAGE和3A3免疫印迹进行分析(顶部)或5A5(底部)抗体（Ab）。车道中显示了全长Hsp70、Hsp70 N和Hsp70 C的输入1, 2,和三个别地；车道GST4；GST–车道AD8

HSF1激活域与Hsp70相互作用的区域通过体外结合试验确定。GST-HSF1激活域融合蛋白的集合，包括野生型激活域I（氨基酸395-503）和缺失突变体II（氨基酸411-503）、III（氨基酸425-503。​（图4A），4A） ，纯化为重组蛋白（图。​（图4C）4C） 并与含有Hsp70的HeLa全细胞提取物或与重组Hsp70单独孵育。野生型激活域I和缺失突变体II和III与Hsp70相关，而缺失突变体IV和V不与Hsp七十结合（图。​（图4B；4B类；数据未显示）。这些结果将Hsp70结合位点界定为HSF1激活域的425-439个氨基酸残基。

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 在HSF1激活域内定位Hsp70结合位点。(A类)HSF1激活结构域的野生型和缺失突变体的示意图。结构体I（野生型）和II–V（缺失突变体）表示为HSF1激活域与GST融合的区域。指出了每个结构的边界和Hsp70结合活性的水平。(B类)潜在的Hsp70结合位点位于HSF1激活域的氨基酸残基425-439。HSF1–GST融合蛋白与HeLa全细胞提取物（WCE）孵育。用Hsp70特异性抗体3A3进行Western blot分析，检测Hsp70作为结合蛋白的存在。纯化的重组Hsp70和一份HeLa全细胞提取物作为阳性对照。(C类)考马斯蓝染色显示每个纯化GST融合蛋白的SDS-PAGE。包括分子量标记（MW）。

Hsp70和Hdj1负调节HSF1的转录激活特性

在证明了Hsp70和Hdj1与HSF1直接相互作用后，我们讨论了这些相互作用是否影响HSF1的转录活性。通过转染过度表达任一伴侣蛋白来检测伴侣蛋白表达升高的影响，而不考虑热休克反应的其他后果。当与表达高水平Hsp70的载体共表达时，融合到GAL4 DNA结合域的HSF1激活域的转录活性被抑制了四到五倍（图。​（图5A，5A、 i和iii）。由于GAL4–HSF1融合蛋白的水平（数据未显示）及其DNA结合活性（图。​（图5A，5A、 ii）受到影响，我们得出结论，Hsp70主要作为HSF1转录激活域的负调控因子发挥作用。

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 短暂过度表达Hsp70细胞中HSF1转录活性的分析。(A类)HSF1激活域和Hsp70的共表达。(我)在β-actin hsp70质粒DNA（0、1、5和10μg）存在下，GAL4–HSF1激活域的转录活性作为报告质粒G5BCAT的相对CAT活性进行测量。用荧光成像仪对CAT活性进行量化，用共转染的内部对照β-半乳糖活性进行标准化，并与转染的β-肌动蛋白量进行对比热休克蛋白70质粒DNA。(ii（ii）)GAL4–HSF1的DNA结合活性。仅显示了凝胶的顶部对应于GAL4–HSF1 DNA结合复合物。凝胶位移分析在探针过量时进行。(三)用Hsp70特异性单克隆抗体4G4进行Western blot分析，检测Hsp70过表达水平。(B类)HSF1激活域和Hsp70 AAAA突变体的共表达。(我)β-肌动蛋白存在下GAL4–HSF1激活域的转录活性热休克蛋白70AAAA质粒DNA（0、1、5和10μg）。(ii（ii）)Hsp70 AAAA突变体的过度表达水平。ECL暴露与A类(三). (C类)VP16激活域和Hsp70的共表达。(我)β-actin存在下GAL4–VP16激活域的转录活性热休克蛋白70质粒DNA（0、1、5和10μg）。(ii（ii）)Hsp70的过度表达水平。ECL暴露与A类(三).

Hsp70对HSF1转录活性的负面影响要求伴侣具有功能性。缺乏伴侣活性的Hsp70 AAAA突变体不与HSF1激活域结合（图。​（图2A）2A） 因此不抑制HSF1转录活性（图。​（图5B）。5B） ●●●●。Hsp70的过度表达既不会抑制共转染RSV–β-gal对照的表达（数据未显示），也不会抑制GAL4–VP16激活域的转录活性（图。​（图5C）5C） 以及其他GAL4激活域（数据未显示）。这些结果表明，Hsp70的负面影响是HSF1反式激活域特有的。

在平行实验中，Hdj1的过度表达也导致HSF1转录活性的负调控。Hdj1与GAL4–HSF1激活域的共表达导致GAL4-HSF1转录活性的四倍抑制（图。​（图6A）。6A） ●●●●。对于Hsp70，Hdj1没有抑制GAL4–VP16激活域的转录活性（图。​（图6B）。6B） ●●●●。

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 短暂过度表达Hdj1细胞中HSF1转录活性的分析。GAL4–HSF1激活域(A类)或GAL4–VP16激活域(B类)转染COS-7细胞，β-肌动蛋白含量增加hdj1型质粒DNA（0、1、5和10μg）。(我)GAL4-激活域融合的转录活性作为相对CAT活性进行测量，并与转染β-肌动蛋白的量进行绘图hdj1型质粒DNA如图所示。​图5。5. (ii（ii）)用Hdj1特异性抗体通过Western blot分析检测Hdjl的过度表达水平。在所示的Western blot中，ECL也有类似的暴露A类和B。

条件性表达hsp70细胞中hsp90和hsp70基因转录的自动调节

如果Hsp70负调控HSF1转录活性，则有可能控制Hsp70的水平，并检查Hsp70水平增加对HSF1转录活动的影响。为了实现这一点，我们使用了稳定转染的细胞系（PETA70），在四环素调节系统的控制下有条件地表达人Hsp70(Mosser等人，1997年). PETA70细胞与GAL4-HSF1激活域、G5BCAT报告子和RSV-β-gal内对照共同转染。在诱导和积累Hsp70后，通过CAT报告子的表达测量的GAL4-HSF1活性被抑制四倍（图。​（图7A、C）。7A、 C）。没有观察到GAL4–HSF1 DNA结合活性水平的可检测变化（图。​（图7B）；7B） ；这些结果表明，Hsp70对HSF1的反式激活活性有影响。

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 四环素调节的Hsp70过度表达细胞中HSF1转录活性的分析。(A类)GAL4–HSF1的转录活性。转染GAL4-HSF1激活域结构的PETA70细胞在含有或不含脱水四环素（tet或−tet）的培养基中保持48小时。GAL4-HSF1转录活性作为相对CAT活性进行测量，以β-gal活性进行标准化，并相应绘制。(B类)GAL4–HSF1的DNA结合活性。在探针过量时进行凝胶位移分析。GAL4–HSF1 DNA结合复合物(顶部，箭头所示）和多余的自由探针(底部，星号表示）。(C类)脱水四环素（−tet）退出诱导的Hsp70水平。用Hsp70特异性抗体4G4进行Western blot分析。

为了探讨伴侣蛋白水平升高对HSF1转录活性的影响是否与热休克期间所达到的生理相关，我们检测了Hsp70水平升高对内源性热休克基因诱导转录的影响。在表达Hsp70水平升高的PETA70细胞中（图。​（图8E），8E） 热休克不诱导内源性热休克基因的转录；这一结果与热休克诱导转录的典型模式形成鲜明对比热休克蛋白70和hsp90α未诱导细胞中的基因。例如，在Hsp70过度表达的细胞中hsp90α该基因在热休克后没有被诱导，而在使用未诱导Hsp70的细胞的平行实验中hsp90α基因转录（图。​（图8A）。8A） ●●●●。这些结果清楚地证明了Hsp70负调控热休克基因转录。为热休克蛋白70由于PETA70细胞含有多个热休克蛋白70基因下的四环素诱导启动子，因此占高基础热休克蛋白70基因转录。然而，与针对热休克蛋白90α基因，热休克没有增强热休克蛋白70可能是因为热休克对转录的普遍抑制作用（图。​（图8A）。8A） ●●●●。然而，在没有或存在Hsp70过表达的情况下，HSF1获得了较高的DNA结合活性并被诱导磷酸化（图。​（图8B、D），8B、 D），表明Hsp70主要影响HSF1转录活性。

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 Hsp70过表达细胞中热休克基因转录、HSF1 DNA结合和诱导型磷酸化的分析。在42℃热休克处理0、15和60分钟之前，将PETA70细胞在含有或不含脱水四环素（tet或−tet）的培养基中保存48小时(A类)的转录率热休克蛋白70和hsp90α通过连续转录分析测定对照（tet）或Hsp70过表达（−tet）细胞中的基因。(B类)内源性HSF1的DNA结合活性。(C类)在缺乏（−）或存在（+）5 m的情况下，HSF1 DNA结合活性的抗体超位移米外源性ATP。仅显示了与HSF1 DNA结合复合物相对应的凝胶顶部。(D类)用HSF1特异性多克隆抗体进行Western blot分析，检测HSF1的诱导磷酸化状态。（C） 非热曲棍球控制；（HS）60分钟热冲击。(E类)用Hsp70特异性抗体4G4进行Western blot分析，测定脱水四环素停药后Hsp70水平（−tet）。

之前，我们已经确定在HSF1复合物中检测到Hsp70（图。​（图1）。1). 为了确定在PETA70细胞中过表达的Hsp70是否与HSF1相关，我们使用全细胞提取物进行了凝胶迁移率变化测定。HSF–HSE(小时吃秒典当e（电子）与未过度表达Hsp70的热休克细胞相比，表达高水平Hsp70热休克细胞提取物中的元素复合物显示出较慢的电泳迁移率（图。​（图8B）。8B） ●●●●。过度表达Hsp70的热休克细胞HSF–HSE复合物的抗体超移位检测到带有Hsp70特异性抗体的超移位三元复合物（Hsp70:HSF1–HSE），而在不过度表达Hps70的热应激细胞提取物中未检测到此类复合物（图。​（图8C）。8C） ●●●●。添加ATP后，HSF1–Hsp70复合物被破坏，导致HSF–HSE复合物迁移速度更快，不能被Hsp70特异性抗体超转移（图。​（图8C），8C） ，证实了HSF–Hsp70复合物对ATP敏感的体外数据（图。​（图22C） ●●●●。

为了进一步确定这些伴侣-HSF1相互作用和随后对HSF1活性的影响是特定的，使用稳定转染的人类细胞系（PERTA70–AAAA）条件性过度表达非功能性Hsp70 AAAA突变体（图。​（图9A）。9A） ●●●●。在Hsp70 AAAA突变体过表达到与野生型Hsp70相似的水平时（图。​（图9E），9E） ，也不是热休克诱导的转录hsp90α基因（图。​（图9B）9B） 也没有HSF1 DNA结合活性（图。​（图9C）9C） 受到了影响。HSF–HSE复合物与Hsp70特异性抗体的抗体超移在未诱导或AAAA-表达细胞中均未检测到任何HSF–Hsp70复合物（图。​（图9D），9D） 与野生型表达Hsp70的细胞相比（图。​（图8C）。8C） ●●●●。这些结果进一步表明，Hsp70的转录调控需要其伴侣功能才能与HSF1直接结合。

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 转录率分析热休克蛋白70和hsp90αHsp70 AAAA突变过度表达细胞中的基因。(A类)野生型Hsp70和AAAA突变体示意图。HSF1激活域的结合活性（图。​（图2A）2A） 并指出了突变的残基。(B类)热休克蛋白90α基因检测采用连续转录分析。PERTA70–AAAA细胞在含有或不含多西环素（+AAAA或−AAAA）的培养基中保存24小时，然后在42°C热休克处理0、15和60分钟(C类)凝胶迁移率测定法测定的DNA结合活性。(D类)HSF1 DNA结合活性的抗体超位移。仅显示了与HSF1 DNA结合复合物相对应的凝胶顶部。(E类)用Hsp70特异性抗体4G4进行Western blot分析，测定强力霉素诱导24小时的Hsp70 AAAA突变体水平，并与从培养基中取出脱水四环素48小时后诱导的野生型Hsp70水平进行比较。

Hsp70的转录抑制是否依赖于特定水平的Hsp70？为了评估阻断热休克基因转录所必需的Hsp70水平，在48小时内诱导PETA70细胞积累Hsp70。在此期间，在不同时间点取出等分细胞，暴露于热休克，并检查Hsp70水平、内源性热休克基因转录和HSF1 DNA结合活性。相对于在非过度表达细胞（在四环素存在下保持）中观察到的典型热休克转录模式，内源性hsp90αHsp70诱导12小时后，该基因减少了6倍，24小时后观察到11倍的抑制，48小时后又观察到25倍的抑制（图。​（图10A）。10A） ●●●●。在此期间，HSF1 DNA结合水平最初未受影响，在以后的时间点降低了25%（图。​（图10A）。10A） ●●●●。通过Western blot分析测量在此期间诱导的Hsp70水平，并将其与热休克反应（4小时热休克）减弱期间积累的Hsp70。衰减过程中获得的Hsp70水平与12小时四环素诱导后获得的水平相等（图。​（图10B）10B） 对应于Hsp70对HSF1的300倍超额。这些结果表明，Hsp70主要影响HSF1的转录活性，但对HSF1 DNA结合活性的影响不大。

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 表达不同水平Hsp70的细胞中热休克基因转录分析。通过从培养基中撤出脱水四环素0、8、12、24和48小时，将Hsp70诱导到不同水平(A类)hsp90α通过连续转录分析检测42°C热休克处理1小时后的基因，并用磷成像仪定量，将其归一化为pBR322和gapdh公司基因，并与脱水四环素停药时间（hr）绘制成一条实线。相同处理后的HSF1 DNA结合活性通过凝胶位移法测量，用荧光成像仪定量，并绘制成折线图。通过Western blot分析测定不同时间点诱导的Hsp70水平，并用密度测定法定量，绘制成条形图。(B类)将脱水四环素停药诱导的Hsp70水平与41°C下4小时热休克处理期间积累的水平进行比较（PETA70细胞的中间热休克温度范围为39°C至42°C，41°C时Hsp70积累最高，数据未显示）。用Hsp70特异性抗体4G4进行Western blot分析。通过密度测定法定量相对Hsp70水平。

总之，这里的结果表明，热休克转录反应的减弱是一个多步骤事件，其中Hsp70的合成和积累增加直接导致Hsp70与HSF1激活域结合，并导致热休克诱导的转录受到抑制。转录停滞之后，HSF1三聚体转化为单体，HSF1 DNA结合丢失。

讨论

热休克基因的转录是在持续暴露于高温时瞬时诱导的。诱导反应的减弱表明，即使在存在应激信号的情况下，热休克基因的高表达也会抑制信号或负调控激活途径的组成部分。人类细胞中Hsp70的条件性过表达本身就足以抑制热休克诱导的转录。这些结果，加上体内和体外证明伴侣蛋白与HSF1转录激活域直接相关，确立了Hsp70（和其他伴侣蛋白）作为转录阻遏物的作用。

分子伴侣在热休克反应自动调节中的作用与果蝇属以及其他暴露于氨基酸类似物导致热休克基因表达持续激活的生物体(DiDomenico等人，1982b；Mosser等人，1988年). 将氨基酸类似物并入新生多肽中，这些多肽不会折叠到天然状态，从而将先前存在的Hsp70隔离到无效的伴侣-底物相互作用循环中，而不是早期折叠中间体与Hsp70之间的短暂相互作用中(Beckmann等人，1990年). 此外，由于在氨基酸类似物诱导的应激期间合成的Hsp70本身由于氨基酸类似物的掺入而被错误折叠，因此新合成的伴侣蛋白是无功能的，不能抑制HSF活性。因此，HSF是一种稳定的蛋白质，不依赖于连续的蛋白质合成，保持转录活性状态(齐马里诺和吴1987；Amici等人，1992年).

Hsp70水平升高的结果似乎与热休克基因的转录抑制有关，对HSF1的其他特征（如DNA结合或应激诱导的磷酸化）几乎没有直接影响。这表明，热休克反应的衰减阶段由不同的事件组成，其中热休克基因转录速率可以与HSF1的DNA结合和诱导磷酸化状态解耦。这些结论独立地得到了热休克基因转录、HSF1 DNA结合和诱导磷酸化的详细动力学分析的支持，这表明热休克基因的转录速率在HSF1 DNA结合活性丧失之前下降(Kline和Morimoto 1997). 同样，暴露于瞬时热休克（42°C）并在37°C下恢复后，热休克基因转录迅速受到抑制，但通过体外凝胶迁移率变化试验和体内足迹试验测定HSF1 DNA结合活性持续(Abravaya等人，1991年). 在消炎药激活HSF1的过程中，也观察到热休克反应减弱期间HSF1 DNA结合与转录活性的解偶联。在这些条件下，HSF1的激活导致DNA-结合活性形式缺乏转录活性(Jurivich等人，1992年；Giardin和Lis 1995；Cotto等人，1996年).

尽管我们的数据与Hsp70作为转录抑制因子的作用一致，但我们并没有提出Hsp70的新活性，该活性不同于其在其他伴侣-底物复合物中的特性。Hsp70的过度表达并不直接影响HSF1 DNA结合活性的获得，这一证明与之前在大鼠M21和TTRat1细胞以及果蝇属组成性Hsp70过表达不干扰HSF1 DNA结合活性激活的TTSL2细胞(Rabindran等人，1994年). Hsp70水平的增加对HSF1 DNA结合活性失活的动力学有轻微影响(Mosser等人，1993年；Rabindran等人，1994年). 酵母热休克基因的调控酿酒酵母涉及对HSF转录活性的抑制，而不受HSF组成三聚体形式的影响(Boorstein和Craig 1990年). 从酵母到人类的遗传和生物化学观察结果表明，HSF的转录活性与Hsp70的自身调节密切相关。

虽然热休克蛋白在热休克反应调节中的作用主要集中在Hsp70上，但我们的数据也揭示了其他分子伴侣如Hdj1的作用。Hdj1与HSF1在高等真核生物中的相互作用及其对HSF1转录活性的抑制作用在酵母中得到了支持，观察到酿酒酵母DnaJ同源物SIS1负调控其自身表达。然而，SIS1自动调节需要HSE和其他序列，这表明可能涉及其他调节分子(Zhong等人，1996). HSF也可能与Hsp90相关；然而，这个结果似乎是可变的，因为酵母、大鼠和兔子Hsp90检测到了这种关联(Nadeau等人，1993年；Nair等人，1996年)但与人类Hsp90无关（本研究；Baler等人，1992年；Rabindran等人，1994年). 一个相关的问题是，自动调节是否需要升高特定伴侣的水平，或者一个或多个伴侣的浓度在相对较短的时间内大幅增加，以减弱信号。虽然这里提供的数据清楚地证明了当达到一定水平的Hsp70时会发生转录抑制，但Hsp70家族的组成性表达成员Hsc70通常在人类细胞中高水平表达。然而，由于Hsc70通常参与多种细胞活动，包括蛋白质合成、蛋白质组装和移位以及蛋白质降解，因此可能无法对HSF1进行负调控。

无论伴侣如何导致HSF1激活域无法进入，Hsp70和其他分子伴侣通过稳定和重折叠应激诱导的折叠中间产物来保护细胞免受蛋白质聚集体的有害影响。这表明，保护蛋白质免受应激诱导的损伤与热休克转录反应的激活和衰减之间必须存在平衡。尽管尚不清楚基础转录机制的哪些成分与HSF1接触以影响高水平的诱导转录，但这些相互作用也可能是短暂的。随着热休克期间核室中Hsp70水平的增加(Velazquez等人，1980年；韦尔奇和费拉米斯科1984)或者通过条件过表达（数据未显示），HSF1提供了一种替代性相互作用，导致热休克基因转录的Hsp70依赖性抑制。分子伴侣调控HSF1转录活性的模型如图所示​图11。11值得注意的是，Hsp70过度表达的影响对热休克转录具有特异性，并且应激诱导磷酸化HSF1三聚体的形成不受影响。推测其他应激诱导事件，可能与Hsp70协同作用，对HSF1三聚体的去磷酸化和转化为单体很重要。

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 Hsp70和Hdj1调节热休克转录反应的模型。在热休克时，HSF1迅速转化为转录活性三聚体，该三聚体与热休克基因上游的HSEs结合。这导致热休克蛋白（如Hsp70和Hdj1）的合成增加。Hsp70和Hdj1与HSF1激活域结合，抑制其转录活性，导致热休克反应减弱。

虽然我们的数据没有揭示伴侣与HSF1激活域之间的相互作用如何导致转录抑制，但激活域中伴侣结合位点的存在可以竞争性地隔离接触位点或导致HSF1构象的伴侣依赖性改变。无论哪种情况，转录机器都无法访问激活域。这与DnaK和DnaJ伴侣在RepA调节中的作用有某些相似之处(Wickner等人，1991年)和噬菌体λ复制(乔治普洛斯1990). 在前一种情况下，伴侣作为RepA的构象激活剂发挥作用，在后一种情况中，伴侣干扰λP蛋白与dnaB，从而可以解开噬菌体染色体。在类固醇载脂蛋白受体家族中，伴侣作为转录激活物调节器的作用也被描述，尽管在这种情况下，多个伴侣被招募来通过形成稳定的伴侣-底物复合物来维持激活物处于抑制状态(Bohen和Yamamoto 1994). 人们很容易认为，在p53和Hsp70（Hsc70）之间观察到的相互作用也可能反映了转录激活剂的伴侣依赖性调节形式(Hupp等人，1992年).

材料和方法

质粒构建与蛋白质纯化

GST–HSF1激活域（氨基酸395–503）融合构建由生态相应GAL4–HSF1融合结构X的RI消化(Shi等人，1995年)，其中有两个生态RI位点——一个位于GAL4 DNA结合域和HSF1激活域编码序列之间的多连接子区域，另一个位于HSF1终止密码以外，生成包含HSF1激活区编码区域的640-bp片段。640-bp生态RI片段被连接成生态RI消化的pGEX-5X-1载体（Pharmacia–LKB）。HSF1激活域–GST融合缺失突变体II、III、IV和V的结构类似于从相应的GAL4–HSF1融合结构XI、XII、XIII和XIV中创建(Shi等人，1995年). 所有构建体在GST和HSF1序列之间的连接处进行测序，以确保HSF1阅读框得到维持并确认缺失突变体的边界。β-肌动蛋白热休克蛋白70用质粒pH2.3将EEVD中Hsp70的最后4个氨基酸突变为AAAA，构建AAAA(Wu等人，1985年)作为PCR模板并创建巴姆5′端的HI站点和生态RI站点，后面是巴姆PCR产物3′端的HI位点。PCR产物用巴姆HI并连接到巴姆HI消化pHβ-肌动蛋白-1–新向量(Gunning等人，1987年)所以放大了热休克蛋白70AAAA受人β-肌动蛋白启动子控制。通过测序证实了残基的突变。β-肌动蛋白hdj1型通过PCR和pGEX–hdj1型（B.C.Freeman，unpubl.）作为模板创建巴姆扩增人体两端的HI位点hdj1型DNA片段，以及巴姆将HI消化的PCR产物连接到巴姆HI-消化pHβ-肌动蛋白-1新载体位于人β-actin启动子下游。通过PCR扩增的所有DNA片段全部测序，以确保突变不会随机发生。pTR-DC型/热休克蛋白70–按说明创建gfp(Mosser等人，1997年). pTR-DC型/热休克蛋白70AAAA–gfp由创建克拉我和生态β-肌动蛋白的RI消化热休克蛋白70AAAA和490-bp克拉I–生态将含有AAAA突变的RI片段连接成克拉我和生态RI部分消化pTR-DC/热休克蛋白70–gfp替换相应的hsp70野生型片段。已经描述了GST融合蛋白的纯化，野生型或突变型Hsp70、Hsc70、Hdj1和Hsp90(Freeman等人，1995年；Freeman和Morimoto，1996年).

GST体外结合试验

HeLa全细胞提取物或纯化的重组蛋白与固定在谷胱甘肽-糖珠上的纯化GST或GST-HSF1融合物孵育。在100床体积的NETN缓冲液（0.5%NP-40，0.1 m）中清洗珠子四次米EDTA，20米米pH值为7.4300 m时的Tris米NaCl）用于HeLa全细胞提取物和TEN缓冲液（20 m米pH 7.4，0.1 m时的Tris米EDTA，100米米NaCl）用于纯化蛋白质。结合蛋白在SDS-样品缓冲液中煮沸洗脱，并通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色或Western blot分析进行分析。为了检测核苷酸对相互作用的影响，纯化的重组Hsp70/Hdj1蛋白与GST-HSF1激活域在不存在或存在1m米ATP或1米米TEK–Mg缓冲液中的ATP-γs（20 m米Tris，pH 7.4，0.1 m米EDTA，50米米KCl，5米米氯化镁2).

细胞培养、代谢标记和瞬时稳定转染

HeLa细胞在添加有5%小牛血清（GIBCO BRL）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，在5%的湿化CO中生长237°C培养箱。为了进行标记，用缺乏蛋氨酸的DMEM清洗细胞，并在添加100μCi Tran的1ml相同培养基中标记12小时35S-label（ICN），然后用1×PBS清洗并收获。COS-7细胞在添加10%小牛血清的DMEM中生长，培养箱温度为37°C，CO含量为5%2用磷酸钙沉淀法转染浓度为40%-50%的细胞(Shi等人，1995年). 在所有的瞬时转染实验中，如图图例所示，用1μg GAL4-HSF1激活域质粒、2μg G5BCAT报告质粒、1μg RSV–β-gal内控质粒和各种数量的Hsp70-或Hdj1-表达质粒共同转染细胞​图55和​和6。6.PETA70细胞(Mosser等人，1997年)在RPMI 1640中生长，补充10%胎牛血清（Sigma），2 m米 我-谷氨酰胺（GIBCO BRL）、200μg/ml G418（GIBCO-BRL），100μg/ml潮霉素（Sigma）和10 ng/ml脱水四环素（Acros Organics）。从培养基中提取水杨酸四环素以诱导Hsp70表达。电穿孔法转染PETA70细胞(Mosser等人，1997年). 通过pTR-DC共转染产生PERTA70–AAAA细胞系/热休克蛋白70AAAA–gfp质粒及质粒ptk/湿度转化为表达逆转录四环素控制反式激活因子（rtTA）的PEER细胞(Gossen等人，1995年). 在分批培养中选择Hygromycin耐药细胞（200μg/ml），通过向培养基中添加四环素衍生物多西环素（Sigma），然后对GFP阳性细胞进行流式细胞术细胞分选，选择Hsp70 AAAA突变蛋白的四环素可调节表达的细胞(Mosser等人，1997年). PERTA70-AAAA细胞在添加10%胎牛血清的RPMI 1640中生长，2 m米 我-谷氨酰胺、200μg/ml G418和100μg/ml潮霉素。向培养基中添加多西环素（1μg/ml）以诱导Hsp70 AAAA突变体的表达。

CAT、凝胶迁移率变化、Western blot和免疫沉淀分析

CAT试验和GAL4凝胶迁移率变化试验的条件如前所述(Shi等人，1995年). HSF1凝胶迁移率变化分析如所述(Mosser等人，1988年). 如前所述，使用Hsp70特异性抗体C92（Amersham）进行抗体超转移试验(Abravaya等人，1992年). 用HSF1特异性多克隆抗体进行HSF1的蛋白质印迹分析(Sarge等人，1993年)或单克隆抗体4B4(Cotto等人，1997年). 用Hsp70特异性单克隆抗体3A3、5A5、4G4（S.P.Murphy，unpubl.）或C92（Amersham）进行Hsp70的Western blot分析。用Hsp40特异性多克隆抗体对Hdj1进行Western blot分析(Hattori等人，1992年). Western blot分析的条件如下所述(Sarge等人，1993年). 单克隆抗体3A3和5A5可识别Hsp70和Hsc70。单克隆抗体4G4和C92特异性识别Hsp70，但不识别70-kD热休克蛋白的其他成员。用Hsp70（C92）特异性单克隆抗体或HSF1特异性多克隆抗体进行免疫沉淀(Kline和Morimoto 1997).

转录运行分析

在50μCi的[α-32P] 如上所述的UTP（Amersham）(Banerji等人，1984年). 放射性RNA与人类DNA探针杂交热休克蛋白70基因（pH 2.3）(Wu等人，1985年)，人类hsp90α基因（pUC801）(Hickey等人，1989年)pBR322（Promega）作为非特异性杂交的对照，大鼠gapdh公司基因(Fort等人，1985年)作为转录的标准化控制。使用荧光成像仪（分子动力学）定量放射性信号的强度。

致谢

我们感谢布莱恩·弗里曼（Brian Freeman）和大卫·比姆斯顿（David Bimston）提供了纯化的伴侣蛋白和宝贵的讨论，感谢苏·福克斯（Sue Fox）提供了出色的技术援助和评论，感谢何塞·科托（Jose Cotto）提供了建议，感谢萨米尔·马图尔（Sameer Mathur）和安努·马修（Anu。Antoine Caron协助选择稳定的细胞系，Steven Triezenberg（密歇根州立大学）提供GAL4–VP16（pSGVP）结构，James Douglas Engel（西北大学）提供了GAL4-GATA3结构，Kenzo Ohtsuka（日本名古屋爱知癌症研究所）提供了Hsp40特异性抗体。这些研究得到了国立卫生研究院对R.M.的资助。Y.S.的部分资助来自西北大学卢里癌症中心的格莱姆旅游奖学金。

这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，根据《美国法典》第18卷第1734节，本篇文章必须标记为“广告”，以表明这一事实。

脚注

电子邮件ude.uwn@otomirom-r; 传真：（847）491-4461。

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文章来自基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社